Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

Summary

Principal dissociada mesencéfalo culturas de células de dopamina permitir o estudo das características pré-sináptica dos neurônios dopaminérgicos. Eles podem ser usados ​​para monitorar em tempo real a cinética de liberação de dopamina e proteína / mRNA níveis de reguladores de exocitose dopamina. Aqui, nós mostrar-lhe como gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

Abstract

A capacidade de criar culturas de células primárias de neurônios de dopamina permite o estudo das características pré-sináptica dos neurônios de dopamina no isolamento da entrada sistêmica de outras partes do cérebro. Em nosso laboratório, usamos esses neurônios para avaliar a cinética de liberação de dopamina usando amperometria de fibra de carbono, bem como níveis de expressão de genes relacionados a dopamina e proteínas usando PCR quantitativo e imunocitoquímica. Neste vídeo, vamos mostrar como podemos gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

O processo envolve várias etapas, incluindo o revestimento de astrócitos corticais glial, o condicionamento de meios de cultura de células neuronais pelo substrato glial, a dissecção do mesencéfalo em recém-nascidos, a digestão, extração e cultivo de neurônios de dopamina e da adição de fatores neurotróficos para garantir a sobrevivência da célula.

As aplicações adequadas para tal preparação incluem eletrofisiologia, imunocitoquímica, PCR quantitativo, a microscopia de vídeo (ou seja, em tempo real de fusão vesicular com a membrana plasmática), ensaios de viabilidade celular e outras telas toxicológicos.

Protocol

Precedendo a preparação Cultura

Nota: ** As células gliais deve ser banhado com bastante antecedência para que eles tenham tempo para proliferar e cobrir o fundo dos pratos. Para camundongos com atípica ou experimental fundo genético, certifique-se para combinar as culturas gliais e neuronais, em termos de genótipo.

Nota: ** 1-7 dias antes da dissecação, prepare neuronal médio fresco e substituir o médio glial nos pratos com 2 ml.

Nota: ** No dia antes da dissecação, os seguintes itens devem ser deixados sob luz UV durante a noite:

• 4 placas de dissecção
• 2 frascos de dissociação com uma barra de agitação magnética micro-
• 2 tampas dos frascos (com dois pequenos furos poked no topo)
• Espalhar-se anéis de slides (e revestimento em EtOH 70%) - deixe a caixa aberta também
• PELO MENOS duas caixas cheias de amarelos (10-200μl) ponteiras
• 1 caixa de azul (100-1000μl) ponteiras

Dia da Cultura

Nota: * Certifique-se não tocar em nada que ficou de fora para UV durante a noite!

Manter um ambiente estéril sob a capa é muito importante.

1) Defina Up:

Nota: ** Retiradas todos os ingredientes congelados para fazer a solução de papaína.

1. Pinça limpa com EtOH 70%. Cobrir cada ponta com uma ponta de pipeta estéril amarelo. Usar para colocar anéis de deslize estéril em sua caixa.
2. Chapa quente:
   1. Colocar uma placa mini-magnetic/hot sob o capô com um copo cheio até 1000ml 500-600ml dH ₂ O e uma barra de agitação magnética grande.
   2. Coloque um disco de isopor no copo um pouco acima do nível da água.
   3. Deslize o termômetro em um pequeno buraco no disco de isopor. Discagem de calor precisa ser ligeiramente superior a 2 (para uma temperatura de 34 ° C) e agitar o disco deve ser ~ 5-6.
3. PBS:
   1. Prepare PBS estéril e estéril preencher 15 tubos 15ml com 4-6 ml (não se esqueça de manter estéreis
      técnica).
   2. Coloque os tubos ea garrafa de ações no gelo ao lado do capô.
4. Carbogênio:
   1. Quebrar um stripette 5ml pela metade e empurrá-lo através de uma rolha de borracha, de forma a ponta do stripette está saindo da extremidade larga da rolha.
   2. Coloque a tampa em um frasco de 500ml com 400-500ml dH ₂ O (fim quebrada de stripette deveria estar no ₂ dH O).
   3. Ligar um tubo na abertura lateral do balão.
   4. Corte a ponta fora uma ponteira amarela e ligar isto à extremidade do tubo (com o lado cortado virado para fora).
      
      Conecte o tanque carbogênio para a ponta do stripette 5ml.
      
      
5. Prepare papaína sol'n:
   1. * Use técnica estéril cuidado.
   2. Misture em um tubo de 50ml estéril.
6. Filtro de papaína sol'n dentro do frasco de dissociação:
   1. Use uma unidade de filtragem Steriflip e transferir para frasco 25ml dissociação via stripette (OR colocar um filtro nova seringa 0,2 Hm na ponta do êmbolo de uma seringa de 20 ml,
      remover o êmbolo e usar um stripette (25 ml) para transferir todos os sol'n papaína para a seringa.
   2. Filtro no frasco dissociação).
   3. Cap do frasco, inserir uma seringa estéril através do orifício na tampa e coloque um filtro de seringa estéril 0,2 Hm à base da seringa.
   4. Conecte o carbogênio para o filtro e este lugar em parafilme. Coloque o frasco na isopor disco / suporte.
      
      * O bar agitar micro-magnético deve estar se movendo.
      * O gás deve ser tornando-o dentro do frasco.
      * A temperatura deve se estabilizar em 34 ° C.
      
      
7. Prep dissecção:
   1. Traga o microscópio de dissecção sob o capô.
   2. Lay out de todos os instrumentos de dissecação em folha de alumínio, spray com EtOH 70%, despeje o excesso e deixe sob o capô para secar.
8. Prepare médio neuronal:
   1. Deixe 30ml de meio de neuronal fresco na incubadora.
9. Lay out uma grande praça de folha de alumínio e 12 quadrados menores. Deixe a tesoura decapitação com a folha de alumínio. Encher uma caixa de isopor pequeno com água gelada e deixar todos fora do capô.
10. Prep a anestesia (ketamina 0.075ml e 0.075ml xzylazine).
11. Obter pelo menos 12 filhotes (P0-P2) para 100 placas. Para camundongos, certifique-se que há um jogo de genótipo para o lixo todo. Se o genótipo é desconhecido, as células da placa de cada filhote de cachorro em um prato separado, manter registros precisos de números de mouse e combiná-los com pratos de cultura de células e certifique-se a base genética do substrato gliais é uniforme em culturas de células.

2 Dissection)

1. Anestesiar o animal pela primeira vez com uma injeção intraperitoneal. Quando animais mostra sedação e não responde à cauda filme-ensaio, colocá-lo em gelo por 30 segundos (até hipotermia). Lave uma pequena folha de alumínio quadrada, Decaptesoura de citações, e cabeça com EtOH 70%.
2. Decapitar, permitir que a cabeça a cair para o quadrado de papel alumínio e mover-se sob o capô. Remova cuidadosamente cérebro em um tubo de 15ml de PBS gelado. Colocar o tubo de volta no gelo durante a remoção do cérebro que vem.
3. Repita estes primeiros passos, até há 3 cérebros no gelo. Despeje todos os três cérebros e PBS para o prato dissecção primeira sob o microscópio. Remover seção apropriada do cérebro (VTA) e usar uma pipeta de transferência para colocar os segmentos em papaína sol'n. Iniciar um temporizador quando os segmentos primeiro ir dentro
4. Repita últimos 3 etapas até que todos os cérebros estão sendo digeridos no papaína. O tempo médio para a digestão deve ser de 2 horas. Os segmentos de primeira terá sido em cerca de uma hora pelo tempo que os últimos ir dentro
   
   Tente dividir a diferença.
   
   
5. * Durante a digestão:
   1. Certifique-se que a temperatura no banho é de 34 ° C.
   2. Segmentos podem aderir à barra de agitação no início, mas deve espalhar-se como o tempo passa. Se não o fizerem, toque no fundo do frasco.

3) Trituração:

1. Usando uma pipeta, transferir os segmentos do cérebro para um tubo estéril 15ml (tentar evitar excesso de papaína sol'n) e lave-os 3 vezes com 2 ml de meio de glial aquecido da incubadora. Depois de colocar a mídia glial no tubo, permitem segmentos para resolver e, em seguida, remova cuidadosamente como sol'n tanto quanto possível, sem perturbar os segmentos. Alterar pipetas para evitar a contaminação!
   
   ** Não manter o sol'n que é removido.
   
   
2. Usando uma pipeta frescas começam triturações em 2ml de mídia glial. Triturar 25 vezes (em evitar que bolhas de ar) e deixar o tubo de sentar-se por 3 minutos até que os segmentos não dissociado resolver. Use uma pipeta para remover e MANTER sol'n, tanto quanto possível, sem perturbar os segmentos na parte inferior. Manter o sobrenadante em um tubo (estéril) novos 15m.
3. Repita o passo anterior, utilizando uma pipeta 1000μl e pipetar 200μl até que esteja completamente dissociado.
4. Triturar 10 vezes com uma pipeta, transferir ou até que as células estão completamente suspensas em sol'n.

4) Células Plating

1. Usando uma pipeta estéril amarela cobrindo cada ponta da pinça, cuidadosamente uma gota anel slide como centrado no vidro tão bem quanto possível dentro de cada prato.
2. Colocar 10μl da solução de célula na hemocitômetro e contar. (Excluir massas junk).
3. Multiplicar o número de células por 10. Este é o número de células / ml. Divide 1,000,000-1,500,000 (ou densidade desejada) por este número. Este é o número de mL para adicionar por prato.
4. Use a ponta da pipeta para deslizar anéis sobre o centro-bem de cada prato que você adicionar mL apropriado / prato. Placa-los suavemente e passar dicas para cada prato.
5. Adicionar 100μl (de diluído) GDNF sol'n dentro do anel de slides de cada prato.
6. Neste momento, coloque as bandejas na incubadora e trazer o meio neuronal na sala fria.
7. Permitem que as células para resolver durante a noite.
8. Dia seguinte: retire anéis (usando novas pontas de pipeta estéril cobrindo as pontas pinças para cada prato)
   

5) A inibição mitótica: no dia seguinte

1. Diluir alíquotas FDU de 1:10 estoque 1000X adicionando estoque FDU 200μl para 1,8 ml MEM estéril.
2. Adicionar 20μl diluída FDU sol'n ao anel exterior de cada prato. Trocar a ponteira com freqüência. Cubra e retornar à incubadora.
   
   * Perturbe os pratos tão pouco quanto possível para os próximos dias 7-10. Verifique se há pratos infectados e remover todos os pratos infectadas nos primeiros sinais de infecção. Culturas estão prontos para testes dentro de 3 semanas.

MEDIA / SOLUTIONS

Médio neuronal

(Para 200 ml)

** Melhor se condicionando a glia de frascos durante a noite antes de usar para lavagens / trituração

Ingrediente	Quantidade	Notas
BSA 5%	0,5 g	V fração
Líquido MEM	94,0 ml	Sigma
Líquido DMEM	80,0 ml	Sigma
F-12 líquidos	20,0 ml	Sigma
Líquido de glicose 45%	1,50 ml	Sigma solução
Glutamina 200mM	0,5 ml	Solução Sigma aliquotado
Diporzio Conc.	2,0 ml	Sigma solução
Líquido Catalase	0,1 ml
Ácido cinurênico 0.5M	200μl	Em NaOH 1N
HCL 5N	50 ul

1. Misture os ingredientes (BSA vai durar) em 250ml garrafa de plástico.
2. Label, filtrar e refrigerar.

Ácido cinurênico
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Fazer estoque 8ml: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N e pipetar em alíquotas de 200μl ESTÉRIL

DiPorzio Mídia

A) DiPorzio Conc. Ações:

NECESSIDADE			Combinar			Alliquot
Aditivo	Solvente	Tubo	Quantidade	ml	ml / tubo	Conc.	Quantidade	# Aliq.
Insulina	HCL 20mM (1)	plástico	Garrafa de 250mg	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferrina	Hank		Frasco de 500mg	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank		Frasco 70mg	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescina	Hank		50mg	3	0,12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 SeO 3	Hank		0.104mg	10	0,5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10mM NaOH		2mg	10	0,1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesterona	100% EtOH	Vidro	12.5mg	10	0,05	1.25mg/ml	Use pipeta
Cortisol	100% EtOH	Vidro	20mg	10	0,02	2.00MG / ml	Use pipeta

1. 20mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
2. Fazer estoque 1mg/ml e adicionar 104μl de 10ml.

B) DiPorzio stock Media:

Aditivo	Quantidade (ml)	Quantidade (ml) X2	Conc final. mcg / ml	Conc final. Molaridade
Progesterona	0,05	0,1	0,06	200nM
Cortisol	0,02	0,04	0,04	125nM
BSS Hank	6,21	12,42
Insulina	1	2	25
Na 2 SeO 3	0,5	1	0,01	30nM
T3	0,1	0,2	0,02	30nM
SOD	1	2	5
Putrescina	0,12	0,24	2,4	15nm
Transferrina	1	2	100

1. Use um tubo de 15ml polyproylene estéril para adicionar a progesterona e cortisol. Use uma pipeta de aspiração e vácuo para acelerar a evaporação do etanol: (use um stripette 5ml quebrado ao meio e coloque metade do caminho para baixo dentro do tubo sendo muito cuidadoso para não aspirar líquido EtOH pipeta Segure firmemente no lugar com Kimwipes e depois trazer a ponta. até a marca de 500μl localizado no lado do tubo.
2. Adicione o alíquotas subseqüentes na ordem em que aparecem no gráfico acima.
3. Após a adição de insulina, o que torna a nublado sol'n, adicionar 20μl de NaOH 1N para neutralizar o pH. Sol'n deve ir do amarelo ao rosa e imediatamente claro. Além disso, após a adição de transferrina, imediatamente adicionar 20μl de NaOH 1N, para neutralizar o pH e prevenir a formação de precipitados.
4. Elaborar 10ml em uma pipeta sorológica e se dividem em cinco alíquotas (um lote).
5. Loja @ -20 ° C.
6. Pode fazer 2 lotes de uma só vez.

Dissociação Mídia

A. papaína (para 1 frasco):

** Prepare dia de chapeamento de direito antes da dissecção.

Ingrediente	Quantidade </ Strong>	(Notas) Conc Final.
Água Cisteína	7.8mL	Cisteína 1mM
Papaína	Varia (* 190μl para a garrafa de 44.0mg/ml)	20 unidades / ml (400 unidades totais para o valor de 20ml de sol'n)
H & B conc.	2mL
Carbogênio	95% O2 + 5% de CO2
HCl 5N	10μl
0,5% de vermelho de fenol	20μl	0,001%
Kynurenate 0.5M	10μl	(Em 1N NaOH) 0,5 mM

1. Adicionar papaína para a água cisteína FIRST.
2. Adicione o conc H & B., Kynurenate, HCl, e vermelho de fenol.
3. Filtro no frasco de dissociação (conforme descrito nas direções set-up) e se conectar à carbogênio.
   

B. H & B Concentrado (100ml de 5X):

Ingredientes	MW	Powder/50ml H 2 O	Conc. (M)	Combine (ml)	Conc final. (MM)
NaCl	58,44	11,699 g	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 g	1	2,7	5,4
NaHCO 3	84,01	4,2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 g	1	0,5	1
EDTA (ED2-SS)	292	Sigma 5% (make 5g/100ml estoque)	0,134	0,3722	0,5
Glicose	180	Sigma 45%	2,5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Combine as quantidades a partir de soluções estoque.
2. Dividir em alíquotas 4ml.
3. Adicionar alíquota à água após a adição de cisteína papaína.
   

C. Água Cisteína (157.5ml de 1X):

Ingredientes	MW	Componentes Em pó (mg)	H 2 O (ml)	Ações Conc. (MM)	Combine (ml)	Conc final. (MM)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0,6	1,9 mm
Cisteína	121,7	(1.5)	24	20mm (0,02 m)	10	1,27 (0.88)
Água TC					146,9

1. Fazer e manter um estoque de sol'n CaCl2 0,5 M a 4 ° C
2. Faça uma sol'n usar um dos cisteína e combinar com outros ingredientes
3. Divida em 10 alíquotas de 15,75 ml e armazenar a 4 ° C
   

GDNF Preparação

1. Prep alíquota:
   1. Dissolver estéril, pellet liofilizado de 5μg GDNF com 2,4 ml de água deionizada estéril. A concentração desta sol'n GDNF = 2.08μg/mL.
   2. Distribuir o 2.08μg/mL GDNF sol'n em 76.9μl alíquotas em criotubos estéril. Este 160ng = por frasco.
   3. Armazenar a -20 ° C.
2. Além de culturas:
   1. Descongelar uma alíquota para cada 8 pratos.
   2. Diluir alíquota, adicionando 723.1μl media neuronal / alíquota. Isto fará uma sol'n 160ng/800μl de GDNF.
   3. Adicionar 100μl deste sol'n para a 2 ml de meio em cada prato para uma concentração final de 10ng GDNF por mL.
      

FDU Preparação

FDU-sol'n stock 1000X:

Ingrediente	Quantidade	(Notas) Conc Final.
Uridina	247 mg	16,5 mg / ml
5 FDU (5-fluorodeoxyuridine)	100 mg (frasco)	6,7 mg / ml
Água TC	15 ml

1. Fazer um pouco mais de 15 ml de 16,5 uridina mg / ml.
2. Adicionar 15 ml uridina sol'n a 100 mg de garrafa FDU para fazer 6,7 mg / ml sol'n FDU.
3. Dividir em alíquotas 200μl e congelar em -20 ° C.

Diluir para Uso:

1. Inibir o crescimento de células não-neuronais. Diluir 1:10 estoque 1000X adicionando estoque 200μl para 1,8 ml de MEM.
2. Adicionar 20μl FDU diluído ao anel exterior de cada prato. Alterar pontas de pipeta com freqüência. Cubra e retornar à incubadora.

Discussion

Os métodos descritos aqui permitem resolução fina de características morfológicas e neuroquímicas dos neurônios dopaminérgicos centrais que não estão disponíveis de outra forma em uma abordagem sistêmica ou em vivo.

Materials

Materials are included in the protocol text.