Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Summary

Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês (MnCl₂), Que pode entrar nas células através dos canais de cálcio quando as células são biologicamente ativos. Além disso, mostramos o uso de MnCl₂ Como agente de contraste celular ressonância magnética para determinar a viabilidade in vitro de CTEh.

Abstract

Células estaminais embrionárias humanas (CTEh) demonstraram a capacidade de restaurar o miocárdio lesado. A ressonância magnética (MRI) emergiu como uma das modalidades de imagem predominante para avaliar a recuperação do miocárdio lesado. Além disso, os agentes ex-vivo rotulagem, tais como nanopartículas de óxido de ferro, têm sido empregados para rastrear e localizar as células-tronco transplantadas. No entanto, este método não monitora uma propriedade biologia celular fundamental em relação à viabilidade das células transplantadas. Tem sido conhecido que o cloreto de manganês (MnCl ₂₎ entra nas células através de voltagem dependentes de cálcio (Ca ^{2 +)} canais quando as células são biologicamente ativos, e acumula intracelularmente para gerar T efeito encurtamento ^1. Portanto, sugerimos que o manganês guiada ressonância magnética pode ser útil para monitorar a viabilidade das células após o transplante de CTEh no miocárdio.

Neste vídeo, vamos mostrar como rotular CTEh com MnCl ₂ e como essas células podem ser claramente vistos usando MRI in vitro. Ao mesmo tempo, a atividade biológica de Ca ^{2 +-channels} será modulada utilizando tanto Ca ^{2 +} canal-agonistas e antagonistas para avaliar as alterações do sinal concomitante.

Protocol

Rotulagem de manganês de células estaminais embrionárias humanas Trypsinize as hastes embrionárias humanas que foram cultivadas no alimentador sem condições por 5 minutos. Neutralizar a tripsina, adicionando meios de cultura. Girar as células por centrifugação a 800 rpm por 5 minutos a 20 ° Celsius. Após re-suspensão de células do sedimento, contar o número de células por trypan coloração azul. Com base na contagem de células obtidas, divide as células em quatro alíquotas de 3 mil…

Discussion

Estes resultados indicam que o manganês não entra através do canal de cálcio voltagem-dependentes, e manganês pode ser usado como agente de contraste para IRM, que também pode mostrar a viabilidade celular. Portanto, sugerimos que o manganês guiada ressonância magnética pode ser útil para monitorar a viabilidade das células após o transplante de células estaminais embrionárias humanas no miocárdio.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	Gibco	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	Gibco	11330
2- mercaptoethanol 98+%	Reagent	Sigma	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	Gibco	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	Gibco	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	Gibco	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Medical Systems
clinical Knee coil	Tool	GE Medical Systems
DPBS	Reagent	Gibco	14190