Summary
विच्छेदन और एक व्यक्ति के मस्तिष्क क्षेत्र से कोशिकाओं के विकास के सेलुलर और शारीरिक मापदंडों की जांच की सुविधा. हम है कि एक सीरम मुक्त वातावरण में न्यूरॉन - समृद्ध संस्कृतियों का उत्पादन प्राथमिक कोशिका संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
hippocampal न्यूरॉन्स के शारीरिक गुणों आमतौर पर विशेष रूप से सीखने और स्मृति में हिप्पोकैम्पस की भागीदारी की वजह से जांच कर रहे हैं. प्राथमिक hippocampal सेल संवर्धन neuroscientists गतिविधि और व्यक्तिगत सेल और एकल synapse स्तर पर न्यूरॉन्स के गुणों की जांच करने के लिए अनुमति देता है. इस वीडियो में, हम प्रदर्शन करेंगे कैसे अलग करने के लिए और नवजात चूहों से प्राथमिक hippocampal कोशिकाओं के विकास. हिप्पोकैम्पस के रूप में 2 से 3 मिनट के रूप में संक्षेप में प्रत्येक नवजात पशु से अलग हो सकता है, और संस्कृतियों को अधिक से अधिक दो सप्ताह के लिए के लिए बनाए रखा जा सकता है. हम भी संक्षेप में प्रदर्शन कैसे ratiometric कैल्शियम इमेजिंग के लिए इन hippocampal न्यूरॉन्स का उपयोग करने के लिए होगा. जबकि इस प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस के लिए प्रक्रिया का वर्णन है, कोई संशोधन करने के लिए थोड़ा के साथ, यह मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Hippocampal अलगाव से पहले
Hippocampal अलगाव की शुरुआत से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरणों बाँझ हैं. नीचे 70% इथेनॉल के साथ संस्कृति हुड स्प्रे, और हुड के अंदर जगह उपकरण. तुम 6 की आवश्यकता होगी - और 10 सेमी पेट्री डिश, बाँझ पाली एल लेपित गिलास coverslips, pipettors और सुझावों, डिस्पोजेबल pipettes, और एक बिजली pipettor. इस बिंदु पर से, सही बाँझ तकनीक का उपयोग करें याद है.
- पानी के स्नान पर मुड़ें और यकीन है कि यह 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम किया जाता है
- निम्नलिखित समाधान है कि 4 में संग्रहीत हैं ° सी की जरूरत होगी:
- संशोधित ईगल मध्यम (सदस्य)
- Neurobasal
- हांक बफर नमकीन घोल (HBSS)
- Borate बफर समाधान
- सोडियम पाइरूवेट समाधान
- बाँझ फ़िल्टर 20% आसुत जल में ग्लूकोज समाधान
- सभी बोतलों उन्हें हुड में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ नीचे स्प्रे करने के लिए सुनिश्चित करें.
- फ्रीजर से बाहर इन जमे हुए समाधान लो और उन्हें एक गर्म पानी के स्नान में जगह:
- घोड़े सीरम का एक 5 मिलीलीटर विभाज्य
- B-27 के पूरक के एक 1 मिलीलीटर विभाज्य
- एक 1 मिलीलीटर विभाज्य (100X एंटीबायोटिक पेनिसिलिन प्लस स्ट्रेप्टोमाइसिन)
- और एक 0.5 एल glutamine के मिलीलीटर विभाज्य
- बाद समाधान thawed है, उन्हें बाहर ले पानी के स्नान के, 70% इथेनॉल के साथ उन्हें नीचे स्प्रे, और हुड में उन्हें जगह. अब चढ़ाना और Neurobasal माध्यम तैयार किया जा सकता है.
- समाधान तैयार करने के बाद, कंटेनर कसकर टोपी और उन्हें डिग्री सेल्सियस स्नान 37 में जगह गर्म जबकि hippocampal अलगाव प्रदर्शन.
- इसके अलावा, फ्रीजर से बाहर protease trypsin (2.5%) की एक विभाज्य ले और यह पानी के स्नान में जगह है. Trypsin dissected हिप्पोकैम्पस, जो अगले कदम में अलग हो जाएगा पचा जाएगा.
- एक 15ml शंक्वाकार ट्यूब ले लो, यह HBSS के साथ भरने, और यह इलाज समूह के साथ लेबल. यहाँ यह है कि पृथक hippocampi अगले कदम में एकत्र किया जाएगा.
Hippocampal अलगाव
- Hippocampal अलगाव शुरू करने के लिए, यकीन है कि नवजात शिशु पिल्ले को साफ कर रहे हैं और उनके दूध बैंड, placentas, और उनकी माँ से हटा नाल डोरियों था.
- एक पेट्री डिश में पिल्ले प्लेस, 70% के लिए स्वच्छ, और उन्हें हुड में जगह इथेनॉल के साथ स्प्रे. पशु तुरंत संवर्धन पहले euthanized हैं.
- आगे बंध्याकरण के लिए एक डिश से पिल्ला ले, 70% इथेनॉल में पिल्ला डुबकी, और तब बाँझ HBSS के दो washes में.
- कैंची के साथ शरीर से सिर निकालें. एक ही कैंची का प्रयोग, त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से काटा.
- ठीक चिमटी की एक जोड़ी का प्रयोग, मस्तिष्क से दूर खोपड़ी छील और एक छोटे से पेट्री डिश है कि बाँझ HBSS की एक छोटी राशि शामिल है में मस्तिष्क जगह.
- वापस पील मस्तिष्क गोलार्द्धों. हिप्पोकैम्पस एक छोटे से औसत दर्जे का टेम्पोरल लोब में seahorse के आकार की संरचना है.
- एक 15 मिलीलीटर की ट्यूब में HBSS 3 मिलीलीटर में हिप्पोकैम्पस और स्थान निकालें. एक पिल्ला के साथ इन चरणों को दोहराएँ, और 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक पृथक हिप्पोकैम्पस जगह. अब, यह समय ऊतक एकल कक्षों के लिए अलग कर देना है.
Hippocampal सेल हदबंदी
- आखिर hippocampi पृथक किया गया है, HBSS के साथ 4.5 मिलीलीटर से 15 मिलीलीटर ट्यूब को भरने.
- जल स्नान, इथेनॉल के साथ स्प्रे, हुड में और जगह से trypsin निकालें. ट्यूब trypsin की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- हुड में, ट्यूब से एक बाँझ विंदुक के साथ समाधान / HBSS trypsin, दूर hippocampi कि ट्यूब के नीचे बसे है परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है. ट्यूब और ज़ुल्फ़ धीरे HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़ें. ° 5 मिनट के लिए सी 37 पर सेते हैं.
- इस कदम को दो बार दोहराएँ, पुराने HBSS को हटाने और नए समाधान के साथ की जगह.
- DNase फ्रीजर की मैं बाहर विभाज्य लो. DNase की 0.5 मिलीलीटर hippocampi के लिए 4.5 मिलीलीटर HBSS में जोड़ें. DNase एंजाइम निष्क्रियता को बढ़ावा देने के लिए जोड़ा जाता है.
- समाधान Triturate (या ऊपर और नीचे विंदुक) जब तक यह समरूप है. Homogenate में बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहो.
- Trypan नीले अपवर्जन विधि के साथ सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करते हैं.
- एक 10 सेमी पेट्री 6 से 8 coverslips युक्त पकवान लो, और चढ़ाना माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें. Coverslips युक्त डिश के लिए कक्षों की वांछित संख्या पिपेट. भंवर धीरे कोशिकाओं को फैलाने के लिए, और सुनिश्चित करें कि coverslips ओवरलैप नहीं करते.
- कोशिकाओं humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2-4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ संलग्न करने के लिए अनुमति दें. इस बात की पुष्टि करता है कि कोशिकाओं व्यवहार्य हैं और संलग्न है के बाद, व्यक्तिगत Neurobasal मध्यम युक्त व्यंजन coverslips हस्तांतरण. इनक्यूबेटर में इन व्यंजनों को वापस प्लेस.
- एक बार एक हफ्ते, ताजा Neurobasal मध्यम और प्रयोगात्मक उपचार के साथ मध्यम के एक तिहाई के रूप में की जरूरत की जगह है,. अब, संस्कृति में इन कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों का अध्ययन किया जा के लिए तैयार हैं.
Fura-2 hippocampal न्यूरॉन्स के कैल्शियम इमेजिंग
- सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स के बाद इन विट्रो में 48 घंटे (लेकिन पहले नहीं) के लिए किया गया है, कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों शुरू कर सकते हैं. इस बिंदु पर, इन न्यूरॉन्स के लिए प्रक्रियाओं का विस्तार शुरू कर दिया है चाहिए. कैल्शियम इमेजिंग के लिए अधिकतम आयु सीमा में इन विट्रो में 3 दिन से 7 तक है .
- Fura-2 के साथ लोड संस्कृतियों 37 पर 30 मिनट के लिए AM ° सी, जिसके बाद वे एक 20X एक चाप क्सीनन दीपक का उपयोग करने के लिए कैल्शियम सूचक डाई और एक 512 बिट सीसीडी कैमरा है, जो हर 150ms के नमूने उत्तेजित के उद्देश्य के तहत imaged किया जा सकता है.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल गैरी बैंकर और किम Goslin एक मौलिक काम के एक संशोधन के रूप में विकसित किया गया था. इस पुस्तक संवर्धन कोशिकाओं में रुचि किसी के लिए एक आवश्यक संसाधन है - न केवल न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित है.
बाँझपन, गति, मध्यम की पसंद इस्तेमाल किया: संवर्धन सेल में तीन सबसे महत्वपूर्ण कारक हैं.
बाँझपन - एक लामिना का प्रवाह / बाँझ हुड, सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों, और एक बाँझ इनक्यूबेटर आवश्यक हैं. किसी भी कदम पर संदूषण न केवल मौजूदा प्रयोग पर आप काम कर रहे हैं, लेकिन यह भी है कि योजना बनाई है हो सकता है बाद में काम करने के लिए हानिकारक है. एक के बाद इनक्यूबेटर दूषित हो जाता है, यह सप्ताह (या एक महीने) लेने के लिए यह साफ और बाँझ हो सकता है. संदूषण, जबकि एक दृश्य स्तर पर तुरंत स्पष्ट नहीं है, निश्चित रूप से सेल व्यवहार्यता और सेल फिजियोलॉजी को प्रभावित करेगा. बाँझपन जरूरी है.
स्पीड - संवर्धित कोशिकाओं के स्वास्थ्य कोशिकाओं के माहौल और मध्यम नियंत्रित वातावरण में नहीं हैं समय की राशि के लिए दृढ़ता से बंधा हुआ है . इसलिए, यह जरूरी है कि समय की राशि जब तक कोशिकाओं चढ़ाना माध्यम हैं जानवर से कोशिकाओं को हटाने के लिए आवश्यक एक न्यूनतम पर है. क्योंकि कई कदम trypsin में incubating या धोया जा रहा में समय नहीं बदल सकते हैं, क्या बदल सकते हैं मस्तिष्क कोशिकाओं से हटाने के लिए आवश्यक समय की राशि है. विच्छेदन अक्सर अभ्यास. इस कदम के लिए आवश्यक समय की राशि के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य की जरूरत है.
माध्यम की पसंद - वहाँ कई मालिकाना माध्यमों, जिनमें से एक हैं Neurobasal है. Neurobasal, glial वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करने के दिन से पहले (जो अलग से बनाया जा जरूरत है - इस पुस्तक में बैंकर और Goslin 1 से चर्चा की है) आवश्यक था. बावजूद, यह महत्वपूर्ण है कि आप जानते हैं कि क्या इस्तेमाल किया जा रहा है कि मध्यम में है. Neurobasal, B-27 के रूप में एक पूरक के साथ अक्सर इस्तेमाल किया जाता है. सुनिश्चित करें कि इन मध्यम और पूरक आहार के घटक जाना जाता है, के रूप में वे कोशिकाओं के गुणों को प्रभावित कर सकते हैं. यह मेरे लिए सीरम मुक्त / लकड़ी का कोयला छीन / phenol लाल मुक्त माध्यम का उपयोग करने के लिए स्टेरॉयड हार्मोन दिया है कि मेरी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया काम का एक बड़ा हिस्सा स्टेरॉयड हार्मोन की कार्रवाई की जांच से बचने के प्रयोगशाला में मानक प्रथा है. इस अवधारणा - पता है क्या आप का उपयोग कर रहे हैं समाधान में है - संवर्धन सेल में सभी चरणों के लिए महत्वपूर्ण है.
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Acknowledgments
JLN महाराष्ट्र 68347 के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
