Summary
تشريح ونمو الخلايا من منطقة في الدماغ الفردية يسهل التحقيق في المعلمات الخلوية والفسيولوجية. نحن تصف طريقة لزرع الخلايا الأولية التي تنتج الخلايا العصبية التخصيب الثقافات في بيئة خالية من المصل.
Abstract
عادة يتم التحقيق الخصائص الفيزيولوجية للعصبونات الحصين ، وخصوصا بسبب تورط حصين في التعلم والذاكرة. زراعة الخلايا الأولية الحصين يسمح علماء الأعصاب على دراسة النشاط وخصائص الخلايا العصبية في زنزانة فردية واحدة على مستوى المشبك. في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل وزراعة الخلايا الأولية الحصين من الفئران حديثي الولادة. قد تكون معزولة الحصين من كل حيوان الأطفال حديثي الولادة في قصيرة بقدر 2 إلى 3 دقائق ، ويمكن المحافظة على الثقافات لمدة تصل الى أسبوعين. ونحن أيضا لفترة وجيزة تبين كيفية استخدام هذه الخلايا العصبية الحصين للتصوير ratiometric الكالسيوم. في حين أن هذا البروتوكول يصف عملية للقرن آمون ، مع قليل من دون تعديل ، ويمكن تطبيقه في مناطق أخرى من الدماغ.
Protocol
قبل قرن آمون إلى العزلة
قبل البدء في عزلة الحصين ، تأكد من أن جميع الأدوات معقمة. رذاذ أسفل غطاء الثقافة مع الايثانول 70 ٪ ، ووضع الأدوات داخل غطاء محرك السيارة. ستحتاج 6 -- و 10 سم ، أطباق بتري ، معقمة بولي - L coverslips الزجاج المطلي ، وpipettors نصائح ، ماصات القابل للتصرف ، وpipettor الكهربائية. من هذه النقطة ، تذكر أن استخدام تقنية معقمة الصحيح.
- بدوره على حمام مائي وتأكد من أن يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
- الحلول التالية التي يتم تخزينها في 4 درجات مئوية وستكون هناك حاجة :
- تعديل النسر متوسطة (MEM)
- Neurobasal
- هانك محلول ملحي مخزنة (HBSS)
- بورات العازلة الحل
- الصوديوم البيروفات الحل
- العقيمة ، التي تمت تصفيتها حل الجلوكوز 20 ٪ في ماء مقطر
- تأكد من رش جميع زجاجات أسفل مع الايثانول 70 ٪ قبل وضعها في غطاء محرك السيارة.
- تأخذ هذه الحلول المجمدة من الفريزر ووضعها في حوض الماء الساخن :
- A قسامة 5 مل من مصل الحصان
- A قسامة 1 مل من B - 27 تكملة
- A قسامة 1 مل من المضادات الحيوية 100X (البنسلين زائد الستربتومايسين)
- وقسامة 0.5 مل من الجلوتامين - L
- بعد أن تحسنت الحلول ، وتأخذهم بعيدا عن حمام ماء ، رش عليهم مع الايثانول 70 ٪ ، ووضعها في غطاء محرك السيارة. ويمكن الآن أن أعد والمتوسطة Neurobasal الطلاء.
- بعد مستعدون للحلول ، وكأب الحاويات بإحكام ووضعها في الحمام 37 درجة مئوية في عملية الاحماء أثناء تنفيذ العزلة الحصين.
- أيضا ، يأخذ قسامة من التربسين البروتيني (2.5 ٪) من الثلاجة وضعها في حمام ماء. سوف تربسين هضم تشريح الحصين ، والتي ستكون معزولة في الخطوة التالية.
- اخذت انبوب 15ml المخروطية وملئه مع HBSS ، وتسميته مع مجموعة العلاج. ومن هنا أنه سيتم جمعها معزولة الحصين في الخطوة التالية.
الحصين العزل
- للبدء في عزلة الحصين ، تأكد من الجراء الوليد نظيفة وكان الفرق حليبها ، مشيمة ، وإزالة الحبل السري من قبل الأم.
- وضع الجراء في طبق بتري ، مع رش الإيثانول 70 ٪ لتنظيف ، ووضعها في غطاء محرك السيارة. يصرح باستخدامها مباشرة قبل استزراع الحيوانات.
- لمزيد من التعقيم تأخذ واحدة من الطبق الجرو ، وتراجع في الجرو إلى إيثانول 70 ٪ ، ومن ثم الى اثنين من يغسل HBSS العقيمة.
- إزالة الرأس من الجسم مع المقص. باستخدام مقص نفسه ، خفضت من خلال الجلد والجمجمة.
- باستخدام زوج من ملاقط غرامة ، وقشر الجمجمة بعيدا عن الدماغ والمخ في مكان طبق بتري الصغيرة التي تحتوي على كمية صغيرة من HBSS العقيمة.
- قشر العودة نصفي الكرة المخية. قرن آمون هو صغير ، وفرس البحر على شكل هيكل في الفص الصدغي الإنسي.
- إزالة الحصين والمكان الى 3 مل من HBSS في أنبوب 15 مل. كرر هذه الخطوات مع كل الجرو ، ومكان كل الحصين معزولة في أنبوب 15 مل. الآن ، حان الوقت لفصل الأنسجة إلى خلايا واحد.
الحصين الخلية تفارق
- بعد أن تم عزل جميع الحصين ، وملء الأنبوب مل 15-4،5 مل مع HBSS.
- إزالة التربسين من الحمام المائي ، مع رش الإيثانول ، ومكانته في غطاء محرك السيارة. إضافة 0.5 مل من التربسين إلى أنبوب ، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- في غطاء محرك السيارة ، إزالة حل HBSS / التربسين من أنبوب مع ماصة معقمة ، والحرص على عدم تعكير صفو الحصين أن استقروا في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة 5 مل من HBSS إلى الأنابيب ودوامة بلطف. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- كرر هذه الخطوة مرتين ، وإزالة HBSS القديمة واستبدالها مع الحل الطازجة.
- يأخذ قسامة من الدناز خرجت من الثلاجة. إضافة 0.5 مل من الدناز إلى الحصين في HBSS مل 4.5. إضافة إلى تشجيع إهماد الدناز الانزيم.
- متمزج الحل (أو ماصة صعودا وهبوطا) حتى يصبح متجانس. يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات في جناسة.
- تحديد قابلية الخلية مع استبعاد أسلوب التريبان الأزرق.
- تأخذ طبق بيتري 10 سم تحتوي على 6-8 coverslips ، وإضافة 10 مل من المتوسط الطلاء. ماصة العدد المطلوب من الخلايا التي تحتوي على الطبق coverslips. دوامة برفق لتفريق الخلايا ، وتأكد من عدم تداخل coverslips.
- السماح للخلايا تعلق لمدة 2-4 ساعات في ترطيب حاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. بعد التأكد من أن الخلايا هي قابلة للتطبيق ويكون المرفقة ، نقل coverslips إلى الأطباق التي تحتوي على الفرد المتوسط Neurobasal. مكان هذه الأطباق العودة إلى الحاضنة.
- مرة واحدة في الأسبوع ، واستبدال ثلث المتوسط مع المتوسطة Neurobasal الطازجة وعلاجات تجريبية ، حسب الحاجة. الآن ، والخصائص الفنية لهذه الخلايا في الثقافة على استعداد لدراستها.
Fura - 2 التصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون
- بعد قرن آمون العصبية مثقف تم في المختبر لمدة 48 ساعة (ولكن ليس في وقت سابق) ، يمكن أن تبدأ تجارب التصوير الكالسيوم. عند هذه النقطة ، يجب أن تبدأ هذه الخلايا العصبية لتوسيع العمليات. الفئة العمرية الأمثل للتصوير من الكالسيوم يوميا في المختبر 3-7.
- تحميل مع الثقافات Fura - 02:00 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وبعد ذلك يمكن تصوير ما تحت الهدف 20X باستخدام مصباح قوس زينون لإثارة صبغ المؤشر الكالسيوم وكاميرا CCD 512 بت ، والتي العينات كل 150ms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير هذا البروتوكول بمثابة تعديل للعمل منوية من بانكر غاري وكيم Goslin 1. هذا الكتاب هو موردا أساسيا للراغبين في زراعة الخلايا -- وليس فقط الثقافات عصبون التخصيب هو موضح في البروتوكول الحالي.
العوامل الثلاثة الأكثر أهمية في استنبات الخلايا هي : العقم ، وسرعة ، واختيار الوسيلة المستخدمة.
هناك حاجة إلى تدفق الصفحي / هود العقيمة ، والظروف العقيم ، وحاضنة العقيمة -- العقم. تلوث في أي خطوة تضر ليس فقط على التجربة الحالية التي تعمل عليها ، ولكن أيضا في الأعمال اللاحقة التي قد يكون تم التخطيط لها. بعد تصبح حاضنة ملوثة ، قد يستغرق أسابيع (أو في الشهر) للحصول عليه تنظيفها ومعقمة. تلوث ، في حين لم يتضح على الفور على المستوى المرئي ، وسوف يؤثر بالتأكيد بقاء الخلية وفسيولوجيا الخلية. العقم أمر حتمي.
السرعة -- مرتبط بقوة على صحة الخلايا المستزرعة إلى مقدار الوقت الخلايا ليست في جو وبيئة محكومة المتوسط. لذا ، فمن الضروري أن كمية الوقت اللازم لإزالة الخلايا من الخلايا الحيوانية حتى في المدى المتوسط الطلاء هو في حده الأدنى. لأنه لا يمكن تغيير العديد من الخطوات (في الوقت يحتضنها التربسين أو يجري غسلها) ، ما يمكن تغييره هو مقدار الوقت اللازم لإزالة الخلايا من الدماغ. تشريح الممارسة في أغلب الأحيان. مقدار الوقت المطلوب لهذه الخطوة تحتاج إلى استنساخه.
اختيار المتوسطة -- هناك العديد من وسائل الملكية ، واحدة منها هي Neurobasal. قبل أيام من استخدام ، الدبقية Neurobasal المتوسطة مكيفة (الذي يحتاج الى ان يكون على حدة -- ويناقش هذا الأمر في كتاب من قبل مجلة بانكر وGoslin 1) هو مطلوب. بغض النظر ، فمن المهم أن تعرف ما هو على المدى المتوسط والذي يتم استخدامه. جنبا إلى جنب مع Neurobasal ، ملحق مثل B - 27 ويستخدم كثير من الأحيان. تأكد من أن من المعروف أن مكونات هذه المكملات والمتوسطة ، لأنها قد تؤثر على خصائص الخلايا. فمن الممارسة القياسية في مختبري لاستخدام المصل متوفر / الفحم / الفينول الحمراء جردت المتوسطة مجانا لتجنب هرمونات الستيرويد (نظرا لأن جزءا كبيرا من العمل المنجز في مختبري تحقق في أفعال هرمونات الستيرويد). هذا المفهوم -- معرفة ما هو في الحلول التي تستخدم -- أمر حاسم بالنسبة لجميع الخطوات في استنبات الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد JLN بواسطة MH 68347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
