Summary
La dissezione e la crescita delle cellule da una zona del cervello individuale facilita l'investigazione dei parametri cellulari e fisiologici. Descriviamo un metodo per la coltura di cellule primarie che produce neurone arricchito di culture in un ambiente privo di siero.
Abstract
Le proprietà fisiologiche dei neuroni dell'ippocampo sono comunemente indagati, soprattutto per il coinvolgimento dell'ippocampo nell'apprendimento e nella memoria. Primaria coltura delle cellule dell'ippocampo neuroscienziati permette di esaminare le attività e le proprietà dei neuroni in singole cellule e del livello singola sinapsi. In questo video ci dimostra come isolare e coltivare cellule primarie di ippocampo di ratti neonati. L'ippocampo possono essere isolati gli uni dagli animali appena nati nel più breve 2-3 minuti, e le culture può essere mantenuta per un massimo di due settimane. Ci sarà anche brevemente illustrare come utilizzare questi neuroni dell'ippocampo per l'imaging di calcio raziometrico. Anche se questo protocollo descrive il processo per l'ippocampo, con poca o nessuna modifica, può essere applicato ad altre regioni del cervello.
Protocol
Prima dell'isolamento dell'ippocampo
Prima di iniziare l'isolamento dell'ippocampo, assicurarsi che tutti gli strumenti sono sterili. Spray giù il cappuccio della cultura con il 70% di etanolo, e atto gli strumenti all'interno della cappa. Avrete bisogno di 6 - e 10 cm di piastre di Petri, sterile poli-L coprioggetto vetro rivestito, pipette e le punte, pipette monouso, e un pipettatore elettrica. Da questo punto in poi, ricordatevi di usare correttamente la tecnica sterile.
- Accendere il bagno d'acqua e fare in modo che viene riscaldato fino a 37 ° C.
- Le seguenti soluzioni che vengono conservati a 4 ° C saranno necessarie:
- Media modificato Eagle (MEM)
- Neurobasal
- Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS)
- Soluzione tampone borato
- Piruvato di sodio soluzione
- Sterile filtrata soluzione di glucosio al 20% in acqua distillata
- Assicurati di spruzzare tutte le bottiglie con il 70% di etanolo prima di metterli nel cofano.
- Prendete queste soluzioni congelato dal freezer e metterli in un bagno di acqua riscaldata:
- Un'aliquota di 5 ml di siero di cavallo
- A 1 ml di aliquota B-27 supplemento
- A 1 ml di aliquota 100X antibiotico (penicillina più streptomicina)
- E di 0,5 ml aliquota di L-glutammina
- Dopo le soluzioni sono scongelati, li tolga dal bagno d'acqua, spruzzi giù con il 70% di etanolo, e metterli nel cofano. Ora il medium placcatura e Neurobasal possono essere preparati.
- Dopo le soluzioni sono preparate, tappo i contenitori ermeticamente e metterli nella vasca 37 ° C per riscaldarsi durante l'esecuzione l'isolamento dell'ippocampo.
- Inoltre, prendere una aliquota della proteasi tripsina (2,5%) dal freezer e metterlo in bagno d'acqua. Tripsina sarà digerire l'ippocampo sezionato, che sarà isolato nella fase successiva.
- Prendete un tubo 15ml conica, riempirlo con HBSS, e l'etichetta con il gruppo di trattamento. E 'qui che isolato dell'ippocampo saranno raccolti nella fase successiva.
Isolamento dell'ippocampo
- Per iniziare l'isolamento dell'ippocampo, assicurarsi che i cuccioli appena nati sono pulite e hanno avuto la loro band il latte, placente e cordoni ombelicali rimosso dalla madre.
- Posizionare i cuccioli in piastre di Petri, spruzzare con il 70% di etanolo per la pulizia, e metterli nel cofano. Gli animali sono l'eutanasia immediatamente prima coltura.
- Per la sterilizzazione ulteriore prendere uno cucciolo dal piatto, immergere il cucciolo in etanolo al 70%, e poi in due lavaggi di HBSS sterile.
- Rimuovere la testa dal corpo con le forbici. Utilizzando le forbici stesso, tagliare attraverso la pelle e il cranio.
- Utilizzando un paio di pinzette bene, la buccia del cranio di distanza dal cervello e mettere il cervello in una piccola scatola di Petri che contiene una piccola quantità di HBSS sterile.
- Staccare gli emisferi cerebrali. L'ippocampo è una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale.
- Rimuovere l'ippocampo e il luogo in 3 ml di HBSS in una provetta da 15 ml. Ripetere questi passaggi con ogni cucciolo, e svolge ogni ippocampo isolato nel tubo da 15 ml. Ora, è tempo di dissociare il tessuto di singole cellule.
Dissociazione delle cellule dell'ippocampo
- Dopo tutto dell'ippocampo sono state isolate, riempire il tubo 15 ml a 4,5 ml con HBSS.
- Rimuovere la tripsina dal bagno d'acqua, spruzzare con l'etanolo, e posto nel cofano. Aggiungere 0,5 ml di tripsina al tubo, e incubare per 15 minuti a 37 ° C.
- Nel cofano, rimuovere il HBSS / tripsina soluzione dal tubo con una pipetta sterile, facendo attenzione a non disturbare il dell'ippocampo che si sono insediati sul fondo della provetta. Aggiungere 5 ml di HBSS al tubo e miscelare delicatamente. Incubare a 37 ° C per 5 minuti.
- Ripetere questo passaggio due volte, la rimozione del vecchio HBSS e la sostituzione con una soluzione fresca.
- Prelevare un 'aliquota di DNAsi I fuori dal freezer. Aggiungere 0,5 ml di DNasi al dell'ippocampo HBSS in 4,5 ml. La DNAsi è aggiunto a promuovere l'inattivazione dell'enzima.
- Triturare la soluzione (o pipetta su e giù) finché non è omogeneo. Fare attenzione a non introdurre bolle in omogenato.
- Determinare la vitalità cellulare con il metodo trypan esclusione blu.
- Prendete un piatto di 10 centimetri Petri contenente 6-8 vetrini, e aggiungere 10 ml di terreno placcatura. Pipettare il numero desiderato di cellule al piatto contenente il coprioggetto. Agitare delicatamente per disperdere le cellule, e assicurarsi che il coprioggetto non si sovrappongano.
- Permettono alle cellule di attaccare per 2-4 ore in un umidificata a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. Dopo aver confermato che le cellule sono vitali e hanno attaccato, trasferire i coprioggetti ai piatti singoli contenenti terreno Neurobasal. Luogo questi piatti nuovamente dentro l'incubatrice.
- Una volta alla settimana, sostituire un terzo del mezzo con freschi di media Neurobasal e le cure sperimentali, se necessario. Ora, le proprietà funzionali di queste cellule in coltura sono pronti per essere studiati.
Fura-2 Imaging di calcio di neuroni dell'ippocampo
- Dopo colture di neuroni dell'ippocampo sono state in vitro per 48 ore (ma non prima), gli esperimenti di imaging di calcio può avere inizio. A questo punto, questi neuroni dovrebbero avere iniziato a estendere i processi. La fascia di età ottimale per l'imaging calcio è dal primo giorno in vitro 3 a 7.
- Culture di carico con Fura-2 AM per 30 minuti a 37 ° C, dopo di che può essere ripreso sotto un obiettivo 20X usando una lampada ad arco allo xeno per eccitare il colorante indicatore di calcio e una fotocamera da 512 bit ccd, che campioni di ogni 150ms.
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Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato come una modifica del lavoro seminale di Gary Banker e Kim Goslin 1. Questo libro è una risorsa essenziale per chiunque sia interessato a cellule di coltura - non solo il neurone arricchito di culture descritte nel protocollo corrente.
I tre fattori più critici nella coltura delle cellule sono: la sterilità, la velocità, la scelta del mezzo utilizzato.
Sterilità - un flusso laminare / cappa sterile, condizioni asettiche, e una sterile incubatore sono obbligatori. Contaminazione in ogni passo è dannoso non solo per l'esperimento in corso si sta lavorando, ma anche il lavoro successivo che potrebbe essere stato pianificato. Dopo un incubatore di contaminazione, può richiedere settimane (o al mese) per farlo pulito e sterile. Contaminazione, anche se non immediatamente evidente a un livello visibile, sarà sicuramente influenzare la vitalità delle cellule e la fisiologia delle cellule. La sterilità è un imperativo.
Velocità - la salute delle cellule in coltura è fortemente legato alla quantità di tempo le cellule non sono in un clima e medio ambiente controllato. Pertanto, è essenziale che la quantità di tempo necessario per rimuovere le cellule dagli animali fino a quando le cellule sono nel mezzo di placcatura è al minimo. Poiché numerosi passaggi non può essere modificato (tempo in incubazione in tripsina o essere stati lavati), ciò che può essere alterato è la quantità di tempo necessario per rimuovere le cellule dal cervello. Praticare la dissezione spesso. La quantità di tempo necessario per questa fase deve essere riproducibile.
Scelta del mezzo - ci sono numerosi mezzi di proprietà, uno dei quali è Neurobasal. Prima della giorni di utilizzo Neurobasal, medio gliali condizionata (che dovevano essere fatte separatamente - questo è discusso nel libro di banchiere e Goslin 1) è stato richiesto. Indipendentemente da ciò, è importante che tu sappia cosa è il mezzo che viene utilizzato. Insieme a Neurobasal, un integratore come il B-27 è usato spesso. Assicurarsi che i componenti di queste medie e supplementi sono noti, in quanto potrebbero influenzare le proprietà delle cellule. È prassi normale nel mio laboratorio di utilizzare i livelli di free / carbone spogliato / medio rosso fenolo libero per evitare di ormoni steroidei (dato che una gran parte del lavoro svolto nel mio laboratorio indaga le azioni degli ormoni steroidei). Questo concetto - sapere cosa è nelle soluzioni in uso - è fondamentale per tutte le fasi di coltura delle cellule.
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Acknowledgments
JLN è stato sostenuto da MH 68347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
