Summary
解剖や個々の脳領域からの細胞の増殖は、細胞と生理的パラメータの調査を容易にします。我々は、無血清環境でのニューロンに富んだ文化を生産する主要な細胞培養のための方法を説明します。
Abstract
海馬ニューロンの生理学的特性は、一般的には、特に理由の学習と記憶における海馬の関与が、研究されています。主海馬細胞の培養は、神経科学者は、個々の細胞と単シナプスレベルでのニューロンの活性および特性を調べることができます。このビデオでは、我々は、新生児ラットから主海馬細胞を分離し、成長する方法を紹介します。海馬は2〜3分ほどの短い内の各新生児の動物から単離することが、文化は最大2週間のために維持することができます。我々はまた、簡単にレシオメトリックカルシウムイメージングのためのこれらの海馬神経細胞を使用する方法について説明します。このプロトコルは、修正なしに少しと、海馬のためのプロセスを説明しながら、それは脳の他の地域に適用することができます。
Protocol
海馬分離に先立って
海馬の分離を開始する前に、すべてのツールが無菌であることを確認してください。 70％エタノールで文化のフードを下にスプレーし、及びフード内のツールを配置します。と10cmのシャーレ、滅菌ポリ- Lコーティングされたガラス製カバースリップ、ピペッターやヒント、使い捨てピペット、および電動ピペッター - あなたは6が必要になります。この時点から、適切な無菌操作を使用することを忘れないでください。
- 水浴の電源を入れ、それを37℃にまで加熱されていることを確認してください
- 4℃で保存されている以下のソリューション° Cが必要になります。
- 改変イーグル培地（MEM）
- Neurobasal
- ハンクス緩衝生理食塩溶液（HBSS）
- ホウ酸塩緩衝液
- ピルビン酸ナトリウム液
- 蒸留水で滅菌濾過20％グルコース溶液
- フードにそれらを配置する前に、70％エタノールですべてのボトルを下に散布することを確認してください。
- 冷凍庫から、これらの冷凍のソリューションを取ると温水浴中にそれらを配置します。
- ウマ血清、5 mLを
- B - 27サプリメントを1mlのアリコート
- 100X抗生物質を1mlのアリコート（ペニシリンプラスストレプトマイシン）
- L -グルタミンのと0.5mlのアリコート
- ソリューションが融解した後、水浴からそれらを取り出して70％エタノールでそれらを吹きかけ、そしてフードの中に置いてください。今すぐメッキとNeurobasal培地を調製することができる。
- ソリューションの準備が完了した後、海馬の分離を行いながらウォームアップするためにしっかりと容器にフタをし、37℃の槽の中に置いてください。
- また、冷凍庫の外プロテアーゼトリプシン（2.5％）のアリコートを取り、水浴に入れてください。トリプシンは、次のステップで分離されて解剖海馬を、ダイジェストになります。
- 、15ミリリットルコニカルチューブを取るHBSSでそれを入力し、治療群とそれにラベルを付ける。それは、孤立した海馬は、次のステップで収集されることをここにある。
海馬アイソレーション
- 海馬の分離を開始するには、新生児の子犬が汚れていないと、そのミルクのバンド、胎盤、およびその母親によって削除臍帯を持っていることを確認してください。
- きれいに、そしてボンネットに配置する70％エタノールで、ペトリ皿にスプレーして子犬を置きます。動物は、培養前に即座に安楽死させる。
- さらに殺菌のために一皿から子犬を取る、70％エタノールに子犬を浸し、次に滅菌HBSS中で2回洗浄に。
- はさみで本体からヘッドを取り外します。同じハサミを使って、皮膚や頭蓋骨を介してカット。
- 離れて脳から頭蓋骨をはがし、細かいピンセットを使用し、滅菌HBSSを少量含まれている小型のシャーレに脳を置く。
- 大脳半球バックピール。海馬は、内側側頭葉にある小さな、タツノオトシゴの形をした構造です。
- 15 mlのチューブにHBSS 3mlに海馬と場所を削除します。各子犬にこれらのステップを繰り返し、15 mlチューブにそれぞれの分離された海馬を置きます。今、それは単一の細胞に組織を解離する時間です。
海馬細胞解離
- すべての海馬が分離された後、HBSSで4.5 mlに15 mlのチューブを埋める。
- 水浴、エタノールでスプレー、そしてフードの場所からトリプシンを削除します。チューブにトリプシンの0.5 mlを加え、そして37℃で15分間反応させます℃に
- フードでは、チューブの底に沈殿している海馬を乱さないように注意しながら、滅菌ピペットでチューブからHBSS /トリプシン溶液を除去。優しくチューブと渦巻きにHBSSを5mlを追加。 ℃で5分間37℃インキュベートする。
- 古いHBSSを除去し、新鮮な溶液と置き換えて、二度この手順を繰り返します。
- 私は冷凍庫からDNアーゼのアリコートを取り出してください。 4.5ミリリットルのHBSSで海馬にDNaseの0.5 mlを追加します。 DNアーゼ、酵素不活性化を促進するために追加されます。
- ソリューションをひいて粉にする（または、上下にピペッティング）が均一になるまで。ホモジネートに気泡を導入しないように注意してください。
- トリパンブルー排除法で細胞の生存を決定する。
- 6から8までカバースリップを含む10cmペトリ皿を取る、とメッキの培地10mlを追加してください。カバースリップを含む皿に希望のセル数をピペット。細胞を分散し、カバースリップが重複していないことを確認して静かに渦巻く。
- 細胞は5％CO 2で加湿37℃インキュベーターで2〜4時間のために添付することができます。細胞は生存可能であり、接続されていることを確認した後、Neurobasal培地を含む個々の皿にカバースリップを転送する。インキュベーターに戻し、これらの皿を置きます。
- 週に一度、必要に応じて、新鮮なNeurobasal培地と実験的な治療で培地の3分の1を交換してください。今、培養中のこれらの細胞の機能的特性についても研究する準備が整いました。
海馬ニューロンのフラ-2カルシウムイメージング
- 培養海馬神経細胞が48時間（ただし、それ以前）のためにin vitroでされた後、カルシウムのイメージング実験を開始することができます。この時点で、これらのニューロンは、プロセスを拡張し始めているはず。カルシウムイメージングに最適な年齢範囲は 、in vitro 3日〜7です。
- フラ-2と文化をロードすると、37℃で30分間午前℃で、それらがどのサンプルカルシウム指示薬染料および512ビットのCCDカメラを励起するキセノンアークランプを使用して20倍対物レンズ、すべての150msの下でイメージングすることができる後。
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Discussion
このプロトコルは、ゲイリーバンカーと金ゴズリン1の精液の仕事の修正として開発されました。この本は、培養細胞に興味を持つ人にとって不可欠な資源です - だけでなく、ニューロンに富んだ文化が現在のプロトコルで説明しています。
細胞培養における三大重要な要素は、次のとおりです。不妊、速度、使用する培地の選択。
無菌性 -層流/無菌フード、無菌条件、および滅菌インキュベーターが必要です。任意のステップで汚染だけでなく、あなたが作業している現在の実験だけでなく、計画されている可能性がその後の仕事にとって有害です。インキュベーターが汚れた後は、それが洗浄と滅菌を取得するのに数週間を（または月）かかることがあります。汚染は、目に見えるレベルではすぐに明らかではないが、間違いなく細胞の生存率と細胞生理に影響を与えます。無菌性は不可欠です。
速度 -培養細胞の健康を強く細胞が大気とメディア制御された環境ではない時間の量に関連付けられています。したがって、それは細胞がメッキの媒体になるまで、動物から細胞を除去するために必要な時間が最小になることが重要です。多数のステップが変更できるか、（トリプシンでインキュベートまたは洗浄されている時間）を変更することはできませんので、脳から細胞を除去するために必要な時間です。多くの場合、解剖を練習。このステップの所要時間は、再現性にする必要があります。
媒体の選択 -数多くの独自のメディア、のいずれかが存在するがNeurobasalです。 Neurobasal、グリアの馴化培地を使用しての日の前に（別々に行われるために必要な-これはバンカーとゴズリン1が本の中で説明されていることは）必要とされた。関係なく、それはあなたが使用されている培地に何があるかを知ることが重要です。 Neurobasal、そのようなB - 27などのサプリメントと一緒に頻繁に使用されます。彼らは、細胞の性質に影響を与える可能性があるとして、これらの培地とサプリメントの成分が知られていることを確認してください。それは、ステロイドホルモンを（私の研究室で行われる作業の大部分はステロイドホルモンの作用を調査することを考えれば）避けるために、無血清/木炭除去/フェノールレッドを含まない培地を使用する私の研究室で標準的な方法です。このコンセプトは- あなたが使用しているソリューションで何かを知って -細胞培養のすべてのステップが重要です。
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Acknowledgments
JLNは、MH 68347によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
