Summary
Den dissekering och tillväxt av celler från en enskild hjärna område underlättar utredning av cellulära och fysiologiska parametrar. Vi beskriver en metod för primär cellodling som producerar neuron berikade kulturer i ett serum-fri miljö.
Abstract
De fysiologiska egenskaperna hos hippocampus nervceller är ofta utreds, särskilt på grund av inblandning av hippocampus i inlärning och minne. Primär hippocampus cellodling kan neuroforskare att granska verksamheten och egenskaper av nervceller i den enskilda cellen och enda synaps nivå. I den här videon kommer vi att visa hur man isolera och odla primära hippocampus celler från nyfödda råttor. Hippocampus kan vara isolerade från varandra nyfödda djurets så kort som 2 till 3 minuter och de kulturer kan bibehållas i upp till två veckor. Vi kommer också att kortfattat visa hur du använder dessa hippocampus neuroner för ratiometrisk kalcium avbildning. Även om detta protokoll beskriver processen för hippocampus, med liten eller ingen förändring, kan den tillämpas på andra regioner i hjärnan.
Protocol
Före hippocampus isolering
Innan du börjar hippocampus isolering, se till att alla verktyg är sterila. Spraya ner kultur huva med 70% etanol, och placera verktyg inne i huvan. Du behöver 6 - och 10-cm petriskålar, sterila poly-L belagt glas täckglas, pipetter och tips, engångspipetter, och en elektrisk pipett. Från och med nu, kom ihåg att använda rätt steril teknik.
- Sätt på vattenbad och se till att det värms upp till 37 ° C.
- Följande lösningar som lagras vid 4 ° C kommer att behövas:
- Modifierad Eagles Medium (MEM)
- Neurobasal
- Hanks buffrad saltlösning (HBSS)
- Boratbuffert lösning
- Natrium pyruvat lösning
- Sterila-filtreras 20% glukoslösning i destillerat vatten
- Se till att spraya alla flaskor ned med 70% etanol innan de placeras i huven.
- Ta dessa frysta lösningar ur frysen och placera dem i ett uppvärmt vattenbad:
- En 5 ml alikvot av hästserum
- En 1 ml alikvot av B-27 tillägg
- En 1 ml alikvot av 100X antibiotika (penicillin plus streptomycin)
- Och en 0,5 ml alikvot av L-glutamin
- Efter att lösningarna har tinat, ta dem ur vattenbadet, spraya ner dem med 70% etanol, och placera dem i luvan. Nu plåtar och Neurobasal mediet kan förberedas.
- Efter att lösningarna är förberedda, mössa behållarna ordentligt och placera dem i 37 ° C badet för att värma upp och samtidigt utför hippocampus isolering.
- Ta också en alikvot av det proteasresistenta trypsin (2,5%) ur frysen och placera den i vattenbadet. Trypsin kommer att smälta dissekeras hippocampus, som kommer att isoleras i nästa steg.
- Ta en 15ml koniskt rör, fylla den med HBSS, och märk den med den behandlade gruppen. Det är här som isolerade hippocampi kommer att samlas in i nästa steg.
Hippocampus Isolering
- För att börja hippocampus isolering, se till att nyfödda valpar är rena och har haft sina mjölk band, moderkakor, och sladdar navelsträng tas bort av sin mamma.
- Placera ungarna i en petriskål, spraya med 70% etanol för att rengöra, och placera dem i luvan. Djur avlivas omedelbart före odling.
- För ytterligare sterilisering ta en valp från skålen, doppa ungarna i 70% etanol, och sedan i två tvättar med steril HBSS.
- Ta bort huvudet från kroppen med en sax. Med samma sax, skär genom huden och skallen.
- Använda ett par fin pincett, skala skallen bort från hjärnan och placera hjärnan till en liten petriskål som innehåller en liten mängd steril HBSS.
- Dra av hjärnhalvorna. Hippocampus är en liten sjöhäst-formad struktur i den mediala tinningloben.
- Ta hippocampus och lägg i 3 ml HBSS i ett 15 ml rör. Upprepa dessa steg med varje valp, och placera varje isolerad hippocampus i 15 ml tub. Nu är det dags att skilja vävnaden till enstaka celler.
Hippocampus celler dissociation
- Efter alla hippocampi har isolerats, fylla 15 ml tub till 4,5 ml med HBSS.
- Ta bort trypsin från vattenbadet, spraya med etanol och placera i luvan. Tillsätt 0,5 ml trypsin till röret, och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- I huven, ta bort HBSS / trypsin lösning från röret med en steril pipett försiktigt så att inte störa hippocampi som har slagit till botten av röret. Tillsätt 5 ml av HBSS till röret och snurra försiktigt. Inkubera vid 37 ° C i 5 minuter.
- Upprepa detta steg två gånger, ta bort den gamla HBSS och ersätta med färsk lösning.
- Tag en alikvot av DNAse jag ut från frysen. Tillsätt 0,5 ml av DNas till hippocampi i 4,5 ml HBSS. Den DNAse läggs för att främja enzym inaktivering.
- Mal sönder lösning (eller pipettera upp och ner) tills den är homogen. Var noga med att inte införa bubblor i homogenatet.
- Bestäm cellviabiliteten med trypan blå utanförskap metod.
- Ta en 10 cm petriskål med 6 till 8 täckglas, och tillsätt 10 ml plätering medium. Pipettera önskat antal celler för att skålen innehåller täckglas. Rotera flaskan försiktigt för att skingra celler, och se till att täckglasen inte överlappar varandra.
- Låt cellerna att fästa i 2-4 timmar i en fuktig 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Efter att ha bekräftat att cellerna är livskraftig och har fäst, överföra täckglasen till enskilda rätter som innehåller Neurobasal medium. Placera dessa rätter tillbaka in i inkubatorn.
- En gång i veckan byter en tredjedel av de medel med färska Neurobasal medelstora och experimentella behandlingar som behövs. Nu, den funktionella egenskaperna hos dessa celler i kulturen är redo att studeras.
Fura-2 Kalcium avbildning av hippocampus nervceller
- Efter odlade hippocampus nervceller har in vitro vid 48 timmar (men inte tidigare) kan kalcium avbildning experiment börja. Vid denna tidpunkt bör dessa nervceller har börjat utöka processer. Den optimala åldern för kalcium avbildning är från dag in vitro 3 till 7.
- Ladda kulturer med Fura-2 AM för 30 minuter vid 37 ° C, varefter de kan avbildas i en 20X mål med hjälp av en Xenon båge lampa att excitera färgen kalcium indikatorn och en 512 bitars CCD-kamera, som prover varje 150ms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utvecklades som en modifikation av det nyskapande arbete Gary Banker och Kim Goslin 1. Denna bok är en viktig resurs för alla som är intresserade odla celler - inte bara neuron-berikade kulturer som beskrivs i det nuvarande protokollet.
De tre mest kritiska faktorerna i cellodling är: sterilitet, hastighet, valet av medium som används.
Sterilitet - ett laminärt flöde / steril huva, aseptiska förhållanden, och en steril inkubator krävs. Föroreningar vid varje steg är skadar inte bara den nuvarande experiment du arbetar med, men även den efterföljande arbete som kan ha varit planerat. Efter en inkubator blir förorenad kan det ta veckor (eller en månad) för att få den ren och steril. Förorening, medan inte självklart på en synlig nivå, kommer definitivt att påverka cellernas livskraft och cell fysiologi. Sterilitet är absolut nödvändigt.
Hastighet - är hälsa odlade cellerna starkt knutna till den tid cellerna inte är i en atmosfär och medelstora kontrollerad miljö. Därför är det viktigt att den tid som krävs för att avlägsna celler från djur till cellerna i bordläggningen mediet är på ett minimum. Eftersom många steg inte kan ändras (tid i inkubering i trypsin eller spolas), vad som kan ändras är den tid som krävs för att avlägsna celler från hjärnan. Öva dissektion ofta. Den tid som krävs för detta steg måste upprepas.
Val av medium - det finns många egna medier, varav en är Neurobasal. Innan dagars användning Neurobasal, gliaceller betingad medium (som behövde göras separat - är detta diskuteras i boken av Banker och Goslin 1) krävdes. Oavsett, är det viktigt att du vet vad som finns i det medium som används. Tillsammans med Neurobasal, ett tillägg som B-27 används ofta. Se till att beståndsdelar av dessa medel och kosttillskott är kända, eftersom de kan påverka egenskaperna hos cellerna. Det är praxis i mitt labb använder serum ledig / träkol avskalade / fenolrött free medel för att undvika steroidhormoner (med tanke på att en stor del av det arbete som utförs i mitt labb undersöker de åtgärder av steroidhormoner). Detta koncept - vet vad som finns i de lösningar som du använder - är avgörande för alla steg i cellodling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JLN stöddes av MH 68.347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
