Summary
Die Dissektion und das Wachstum der Zellen von einem einzelnen Bereich des Gehirns erleichtert Untersuchung zellulärer und physiologischer Parameter. Wir beschreiben ein Verfahren zur Primär-Zellkultur, die Neuron-angereicherten Kulturen produziert in einem Serum-freien Umgebung.
Abstract
Die physiologischen Eigenschaften von Neuronen im Hippocampus werden häufig untersucht, vor allem wegen der Beteiligung des Hippocampus beim Lernen und Erinnern. Primäre hippocampale Zellkultur ermöglicht Neurowissenschaftler die Aktivität und Eigenschaften von Neuronen in den einzelnen Zellen und einzelne Synapse-Ebene zu untersuchen. In diesem Video zeigen wir, wie zu isolieren und zu wachsen primäre Zellen des Hippocampus von neugeborenen Ratten. Der Hippocampus kann von jedem neugeborenen Tieren in so kurz wie 2-3 Minuten isoliert werden, und die Kulturen kann beibehalten werden bis zu zwei Wochen. Wir werden auch kurz zeigen, wie diese Neuronen im Hippocampus für ratiometrische Calcium-Imaging verwenden. Während dieses Protokoll beschreibt den Prozess für den Hippocampus, mit wenig bis gar keine Änderung, kann es auf andere Regionen des Gehirns eingesetzt werden.
Protocol
Vor Hippocampus Isolation
Vor Beginn der Hippocampus Isolation, um sicherzustellen, dass alle Werkzeuge, die steril sind. Spray auf der Kultur Haube mit 70% Ethanol, und legen Sie die Werkzeuge in der Motorhaube. Sie benötigen 6 - und 10-cm-Petrischalen, steril Poly-L beschichteten Deckgläsern, Pipetten und Spitzen, Einweg-Pipetten und einem elektrischen Pipette. Von diesem Punkt an, denken Sie daran, richtige sterile Technik zu verwenden.
- Schalten Sie das Wasserbad und stellen Sie sicher, dass es bis zu 37 ° C erhitzt
- Die folgenden Lösungen, die bei 4 ° C gelagert werden benötigt werden:
- Modifiziertem Eagle-Medium (MEM)
- Neurobasal
- Hanks Salzlösung (HBSS)
- Boratpufferlösung
- Natriumpyruvat Lösung
- Sterilfiltriert 20% Glucose-Lösung in destilliertem Wasser
- Achten Sie darauf, alle Flaschen abspritzen mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in der Motorhaube.
- Nehmen Sie diese gefrorenen Lösungen aus der Tiefkühltruhe und legen Sie sie in einem beheizten Wasserbad:
- Ein 5 ml Aliquot Pferdeserum
- Ein 1 ml Aliquot B-27 Ergänzung
- Ein 1 ml Aliquot 100X Antibiotika (Penicillin und Streptomycin)
- Und ein 0,5 ml Aliquot von L-Glutamin
- Nachdem die Lösungen aufgetaut haben, nehmen sie aus dem Wasserbad, sprühen Sie sie mit 70% Ethanol, und legen Sie sie in der Motorhaube. Nun ist die Beschichtung und Neurobasalmedium hergestellt werden kann.
- Nachdem die Lösungen bereit sind, verschließen Sie die Behälter dicht und legen Sie sie in den 37 ° C-Bad zum Aufwärmen während der Durchführung der Hippocampus Isolation.
- Auch wird ein aliquoter der Protease Trypsin (2,5%) aus der Tiefkühltruhe und legen Sie sie in das Wasserbad. Trypsin wird verdauen seziert Hippocampus, die im nächsten Schritt isoliert werden.
- Nehmen Sie einen 15 ml konische Röhre, füllt sie mit HBSS, und beschriften Sie sie mit der behandelten Gruppe. Es ist hier, dass isolierte hippocampi im nächsten Schritt werden gesammelt.
Hippocampus Isolation
- Zu Beginn des Hippocampus Isolation, stellen Sie sicher, neugeborenen Welpen sind sauber und haben ihre Milch Bands, Plazenta, Nabelschnur von ihrer Mutter entfernt.
- Platzieren Sie den Welpen in einer Petrischale, Spray mit 70% Ethanol zu reinigen, und legen Sie sie in der Motorhaube. Die Tiere werden unmittelbar vor der Kultivierung eingeschläfert.
- Für weitere Sterilisation nehmen einen Welpen aus der Schüssel, tauchen die Welpen in 70% Ethanol und dann in zwei Wäschen von sterilen HBSS.
- Entfernen Sie den Kopf vom Körper mit einer Schere. Mit der gleichen Schere, schnitt durch die Haut und den Schädel.
- Mit einer feinen Pinzette, schälen den Schädel weg vom Gehirn und Ort des Gehirns in eine kleine Petrischale, dass eine kleine Menge von sterilem HBSS enthält.
- Ziehen Sie die Hemisphären. Der Hippocampus ist eine kleine, Seepferdchen-förmige Struktur im medialen Temporallappen.
- Entfernen Sie den Hippocampus und in einen 3 ml HBSS in einem 15 ml-Tube. Wiederholen Sie diese Schritte mit jedem Welpen, und legen Sie jeweils isoliert Hippocampus in die 15 ml Tube. Nun ist es Zeit, das Gewebe, einzelne Zellen zu distanzieren.
Hippocampus-Zelle Dissoziation
- Nachdem alle hippocampi isoliert wurden, füllen die 15 ml Tube zu 4,5 ml mit HBSS.
- Entfernen Sie das Trypsin aus dem Wasserbad, Spray mit Ethanol, und in der Kapuze. 0,5 ml Trypsin auf die Tube, und Inkubation für 15 Minuten bei 37 ° C.
- In der Haube, entfernen Sie die HBSS / Trypsin-Lösung aus der Tube mit einer sterilen Pipette, darauf achten, daß der Hippocampus, die den Boden des Röhrchens niedergelassen haben zu stören. 5 ml HBSS auf die Tube und vorsichtig schwenken. Bei 37 ° C für 5 Minuten.
- Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, Entfernen der alten HBSS und Ersetzen durch frische Lösung.
- Nehmen Sie ein Aliquot von DNAse I aus der Tiefkühltruhe. 0,5 ml DNase zum hippocampi in 4,5 ml HBSS. Die DNAse wird hinzugefügt, um Enzyminaktivierung fördern.
- Man reibt die Lösung (oder Pipette nach oben und unten), bis sie homogen ist. Achten Sie darauf, Blasen in das Homogenat einzuführen.
- Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypanblau-Ausschluss-Verfahren.
- Nehmen Sie einen 10 cm Petrischale mit 6 bis 8 Deckgläser und 10 ml Plating-Medium. Pipette die gewünschte Anzahl von Zellen, um die Schüssel mit dem Deckgläschen. Vorsichtig zu zerstreuen die Zellen, und stellen Sie sicher das Deckgläschen nicht überschneiden.
- Lassen Sie die Zellen für 2-4 Stunden in einer feuchten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 zu befestigen. Nach der Bestätigung, dass die Zellen lebensfähig sind und angebracht ist, übertragen Sie die Deckgläser auf einzelne Gerichte mit Neurobasalmedium. Legen Sie diese Gerichte wieder in den Inkubator.
- Einmal in der Woche, ersetzen ein Drittel des Mediums mit frischem Neurobasalmedium und experimentelle Behandlungen, wie gebraucht. Nun sind die funktionellen Eigenschaften dieser Zellen in Kultur bereit, untersucht werden.
Fura-2 Calcium Imaging von Hippocampus-Neuronen
- Nach kultivierten Hippocampus-Neuronen in vitro für 48 Stunden (aber nicht früher) gewesen sein, können Kalzium-Imaging Experimente beginnen. An diesem Punkt sollten diese Neuronen begonnen, Prozesse zu verlängern. Die optimale Altersgrenze für Kalzium-Imaging wird vom ersten Tag an in vitro von 3 bis 7.
- Legen Sie Kulturen mit Fura-2 AM für 30 Minuten bei 37 ° C, wonach sie unter einem 20x-Objektiv mit einer Xenon-Bogenlampe, die Kalzium-Indikator-Farbstoff und einem 512 Bit CCD-Kamera, die Proben alle 150 ms erregt abgebildet werden können.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde als eine Änderung der grundlegenden Arbeit von Gary Banker und Kim Goslin 1 entwickelt. Dieses Buch ist eine wesentliche Ressource für alle, die Kultivierung von Zellen interessiert - nicht nur das Neuron-angereicherten Kulturen in der aktuellen Protokoll beschrieben.
Die drei wichtigsten Faktoren in der Zellkultur sind: Sterilität, Geschwindigkeit, die Wahl des Mediums verwendet.
Sterilität - eine Laminar-Flow / sterile Haube, aseptischen Bedingungen und einer sterilen Brutkasten benötigt werden. Kontamination bei jedem Schritt schadet nicht nur dem aktuellen Experiment auf dem Sie arbeiten, sondern auch die nachfolgenden Arbeiten, die geplant haben kann. Nach einem Inkubator kontaminiert wird, kann es Wochen dauern (oder ein Monat), um es zu reinigen und steril. Kontamination, die zwar nicht sofort ersichtlich auf eine sichtbare Ebene wird definitiv Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen und Zellphysiologie. Sterilität ist zwingend erforderlich.
Speed - die Gesundheit der kultivierten Zellen ist stark an die Zeit, die die Zellen nicht in einer Atmosphäre und mittlere kontrollierten Umgebung gebunden. Daher ist es wichtig, dass die benötigte Zeit, um Zellen vom Tier zu entfernen, bis die Zellen in der Beschichtung Medium auf ein Minimum. Da zahlreiche Schritte nicht verändert werden können (time in Inkubation in Trypsin oder gewaschen) werden, was verändert werden kann ist die Menge an Zeit benötigt, um die Zellen aus dem Gehirn zu entfernen. Üben Sie die Dissektion häufig. Die Zeit für diesen Schritt erforderlich muss reproduzierbar sein.
Wahl des Mediums - es gibt eine Vielzahl an geschützten Medien, von denen einer Neurobasal. Vor den Tagen mit Neurobasal, Glia-konditioniertem Medium (die separat gemacht werden musste - dies ist in dem Buch von Banker und Goslin 1 erörtert) erforderlich war. Egal, es ist wichtig, dass Sie wissen, was in dem Medium, das verwendet wird. Zusammen mit Neurobasal, eine Ergänzung, wie B-27 wird oft verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Bestandteile dieser mittel-und Nahrungsergänzungsmittel bekannt sind, da sie die Eigenschaften der Zellen beeinflussen können. Es ist gängige Praxis in meinem Labor zu serumfreien / Kohle ausgezogen / Phenolrot-freiem Medium nutzen, um Steroidhormone (vorausgesetzt, dass ein großer Teil der Arbeit in meinem Labor durchgeführt die Aktionen der Steroidhormone untersucht) zu vermeiden. Dieses Konzept - wissen, was in den Lösungen, die Sie verwenden - ist entscheidend für alle Schritte in der Zellkultur.
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Acknowledgments
JLN wurde von MH 68347 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
