Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Summary

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Abstract

De studie van de coördinatie van de verschillende lipiden synthese wegen tijdens membraan biogenese is het nuttig om te werken met een experimenteel systeem waarbij membraan biogenese treedt snel op en in een induceerbare manier. We hebben ontdekt dat fagocytose van latex bolletjes is praktisch voor deze doeleinden als cellen snel synthetiseren membraanlipiden tot membraan zwembaden verloren als verpakkingsmateriaal tijdens deeltje verzwelging te vullen. Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-Glo Luciferase Assay System van Promega.

Protocol

Cel Cultuur

1. Stock culturen van humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen worden gekweekt in 10-cm cultuur gerechten in 'medium A', bestaande uit Medium Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) aangevuld met een cocktail van antibiotica (100 eenheden per ml penicilline en 100 ug per ml streptomycine sulfaat) en 10% foetaal bovine serum (FBS).
2. Voor het instellen van cellen voor een experiment, het medium afgezogen en de cellen worden gewassen twee keer met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-oplossing.
3. Het PBS wordt dan verwijderd en vervangen door 0,6 ml van een oplossing die 0,25% trypsine.
4. De schotel wordt geïncubeerd bij 37 ˚ C voor ongeveer 2 minuten totdat de cellen beginnen te los te maken.
5. 5,5 ml van het medium A wordt toegevoegd aan het trypsine te neutraliseren en de cellen worden geteld met een hemocytometer.
6. Cellen zijn verdund tot 320.000 cellen per ml en afgeleverd op 0,1 ml per putje in een polylysine gecoate 96-well plaat cultuur.
7. Zet de schaal in een weefselkweek incubator bij 37 ˚ C met een atmosfeer die 8,8% CO2 en te groeien voor 24 uur.

Transfecties

1. Bij de voorbereiding van transfecties, moet worden beschouwd als hoeveel herhalingen moeten worden uitgevoerd per experimentele condities en welke bedragen van plasmide zullen worden getransfecteerd. We routinematig uitvoeren van alle voorwaarden in drievoud en transfecteren een totaal van 50 tot 100 ng van het plasmide DNA per goed. Plasmide mixen moet minstens een reporter construct uiten vuurvlieg luciferase en een controle plasmide dat Renilla luciferase van een constitutieve promotor.
2. Plasmide oplossingen zijn gepipetteerd in 1,5 ml microcentrifugebuizen en aangevuld met 10 ul per steekproef van serum-vrij en antibiotica-vrij DMEM. Als er bijvoorbeeld 20 putten zijn elk te worden getransfecteerd met 50 ug DNA, voeg 200 ul DMEM tot 1 ug DNA.
3. Om de DMEM / DNA-oplossing toe te voegen 3 pl 'Transit 293 reagens' (Mirus) per ug DNA. Meng door pipetteren op en neer en laat de monsters staan ​​bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten.
4. Tijdens deze periode, verwijdert u het afdrukmateriaal uit de 96-well plaat en cultuur te vervangen door 90 ul vers medium A.
5. Aan elk putje toe te voegen 10 pi van het DMEM / DNA / Transit 293 mengsel.
6. Zet de schaal in een weefselkweek incubator bij 37 ˚ C met een atmosfeer die 8,8% CO2 en te groeien voor 24 uur.

Fagocytose

1. Worden suspensies bereid met medium B (een 1:1 mengsel van DMEM en Ham's F12 medium plus antibiotica en 10% FBS) plus 0,75-um latex kralen op nul tot 1 mg per ml.
2. Verwijder de media uit de 96-well plaat en cultuur te vervangen door 0,1 ml van de kraal suspensies in medium B.
3. Spin de plaat gedurende 2 min bij 1000 x g.
4. De cellen worden vervolgens gekweekt bij 37 ˚ C gedurende 6 tot 16 uur. Afhankelijk van de omstandigheden en de promotor worden gebruikt om te rijden luciferase, verhoogde reporter-gen expressie kan worden gedetecteerd na 1 tot 3 uur.
5. In dezelfde gevallen kan het nodig zijn om de cellen te incuberen met kralen voor 30 tot 60 minuten, doe dan twee wasbeurten met PBS van feitelijke kralen te verwijderen, en voeg vers medium voor het incuberen van de cellen voor een periode van tijd.

Dual-GloTM Luciferase Assay

1. Let op: ons protocol voor het gebruik van deze kit verschilt in sommige opzichten van die aanbevolen door de fabrikant. Het is aangepast aan de hoeveelheid van de reagentia die nodig per monster te verminderen.
2. Bereid een oplossing van 1 M DTT, te splitsen in meerdere kleine porties en bewaar bij -20 ˚ C.
3. Bereid een lysis buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) glycerol en 0,5% (v / v) Triton X-100. Voorafgaand aan het gebruik, aliquot een bedrag dat nodig is voor het experiment en voeg 1 ui per ml van 1 M DTT plus proteaseremmer cocktail tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 tot 1x. Niet opnieuw het overgebleven DTT oplossing.
4. Wanneer u de Dual-GloTM kit voor de eerste keer, de voorbereiding van de (Firefly) Luciferase Reagent door de overdracht van de volledige inhoud van een fles van de Dual-GloTM Luciferase Buffer (geleverd bij de kit) om een ​​fles Dual-GloTM Luciferase Substrate (op voorwaarde dat met de kit). Verdeel de ongebruikte Luciferase Reagent in 10 ml porties en bewaar bij -20 ˚ C.
5. Verwijder de 96-well plaat uit de weefselkweek incubator en plaats het op ijs. Verwijder de media door aspiratie, voeg 40 ul per putje van lysis buffer, en laat de plaat op ijs gedurende 30 minuten.
6. In een witte, ondoorzichtige 96-well plaat (OptiplateTM-96, Perkin Elmer catalogus nummer 6005290) aliquot 15 ul per putje van Luciferase reagens, en voeg 15 ul van cellysaat.
7. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 min en lees dan de luminescentie in een microplaat reader.
8. Vlak voor het gebruik, bereiden een passend bedrag van Renilla luciferase substraat-oplossing door het toevoegen van een deel Dual-GloTM Stop & Glo ®; Reagens (geleverd bij de kit) om 100 delen Dual-GloTM Stop & Glo ® Buffer (geleverd bij de kit).
9. Aan elk putje toe te voegen 15 ul per putje van de Renilla luciferase substraat-oplossing, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna weer te meten van de luminescentie.