Summary
هنا ، نحن تصف إجراءات لدراسة التغيرات في البلعمة التي يسببها التعبير الجيني مع نهج مراسل الجين luciferase المستندة إلى استخدام مزدوج GloTM نظام الفحص Luciferase من Promega.
Abstract
لدراسة مسارات مختلفة من التنسيق توليف الدهون أثناء نشوء حيوي غشاء من المفيد للعمل مع نظام تجريبي حيث نشوء حيوي الغشاء يحدث بسرعة وبطريقة محرض. لقد وجدنا أن البلعمة من الخرز اللاتكس هو عملي لهذه الأغراض كخلايا توليف الدهون بسرعة لتجديد الغشاء غشاء برك كما فقدت التفاف المواد خلال الإحاطة الجسيمات. هنا ، نحن تصف إجراءات لدراسة التغيرات في البلعمة التي يسببها التعبير الجيني مع نهج مراسل الجين luciferase المستندة إلى استخدام مزدوج بالشبكة نظام الفحص Luciferase من Promega.
Protocol
خلية ثقافة
- تزرع الثقافات المخزون الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) خلايا في 10 سم ، والأطباق الثقافة في "وسيط" ، ويتألف من متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) تستكمل مع مزيج من المضادات الحيوية (100 وحدة لكل مل من البنسلين وميكروغرام 100 لكل مل من كبريتات ستربتومايسين) و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS).
- لإنشاء خلايا للتجربة ، وامتص المتوسط قبالة ، ويتم غسل الخلايا مرتين مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل.
- ثم تتم إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها 0.6 مل من محلول يحتوي على 0.25 ٪ التربسين.
- وحضنت الطبق في 37 ˚ مئوية لمدة حوالي 2 دقيقة حتى الخلايا بدأت فصلها.
- 5.5 مل من المتوسط هو إضافة إلى تحييد التربسين ويتم عد الخلايا مع عدادة الكريات.
- وتضعف الخلايا إلى 320000 خلية لكل مل والاستغناء عند 0.1 مل لكل بئر في المغلفة متعدد الليزين 96 - جيدا لوحة الثقافة.
- مكان الطبق في منديل حاضنة الثقافة في 37 ˚ C مع جو CO2 تحتوي على 8.8 ٪ وتنمو لمدة 24 ساعة.
Transfections
- في التحضير للtransfections ، ينبغي النظر فيه كم هي متماثلة التي يتعين القيام بها في الظروف التجريبية وما مبالغ البلازميد سوف تكون transfected. نقوم بشكل روتيني في جميع الظروف وثلاث نسخ transfect مجموعه من 50 إلى 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد لكل بئر. وينبغي أن يمزج البلازميد على الأقل مراسل بناء معربا عن يراعة luciferase والتحكم البلازميد luciferase Renilla من التعبير عن مروج التأسيسية.
- وpipetted حلول البلازميد في أنابيب microcentrifuge 1.5 مل وتستكمل مع 10 ميكرولتر لكل عينة من المصل DMEM حرة وخالية من المضادات الحيوية. على سبيل المثال ، إذا كان 20 بئرا لتكون هي كل transfected 50 ميكروغرام مع الحمض النووي ، إضافة إلى 200 DMEM ميكروليتر DNA ميكروغرام 1.
- إلى الحل DMEM / إضافة 3 ميكروليتر DNA "العابر 293 كاشف" (Mirus) في الحمض النووي ميكروغرام. مزيج من قبل pipetting ارتفاعا وانخفاضا ، والسماح للعينات تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
- خلال هذه الفترة ، وإزالة وسائل الإعلام من 96 لوحة والثقافة ، وكذلك استبدال 90 ألف ميكرولتر من متوسطة جديدة
- إضافة إلى كل جانب 10 ميكرولتر من الخليط DMEM 293 / DNA / العبور.
- مكان الطبق في منديل حاضنة الثقافة في 37 ˚ C مع جو CO2 تحتوي على 8.8 ٪ وتنمو لمدة 24 ساعة.
البلعمة
- إعداد المعلقات المحتوية B المتوسطة (خليط من 01:01 DMEM ولحم الخنزير والمتوسطة بالاضافة الى المضادات الحيوية F12 و 10 ٪ FBS) ، بالإضافة إلى 0.75 ميكرون ، الخرز اللاتكس عند مستوى الصفر ، إلى 1 مغ لكل مليلتر.
- إزالة وسائل الإعلام من 96 لوحة والثقافة ، وكذلك استبدال بنسبة 0.1 مل من الايقاف في حبة متوسطة B.
- تدور في لوحة لمدة 2 دقيقة في 1000 × ز
- ثم يتم استزراع خلايا في 37 ˚ مئوية لمدة 6-16 ساعات. تبعا للظروف والمروج المستخدمة في محرك الأقراص يمكن الكشف luciferase ، مراسل الجين زادت التعبير بعد 1-3 ساعات.
- في نفس الحالات قد يكون من الضروري لاحتضان الخلايا مع حبات لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، ثم نفذ 2 يغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة الخرزات الفردية ، وإضافة جديدة وسائل الاعلام قبل تفرخ الخلايا لفترات إضافية من الزمن.
الفحص المزدوج GloTM Luciferase
- ملاحظة : لدينا بروتوكول لاستخدام هذه المجموعة يختلف في بعض النواحي من تلك الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. وقد تم تعديل ذلك لتقليل كمية من الكواشف المطلوبة لكل عينة.
- يعد حل DTT M 1 ، تقسيمها إلى aliquots صغيرة متعددة وتخزينها في -20 جيم ˚
- تعد منطقة عازلة تحلل تحتوي على 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (7.8 درجة الحموضة) ، و 10 ٪ (V / V) الجلسرين ، و 0.5 ٪ (V / V) تريتون X - 100. قبل الاستخدام ، قسامة مبلغ اللازمة للتجربة وإضافة 1 مل من ميكرولتر في DTT M 1 زائد البروتياز كوكتيل مثبط للتركيز النهائي من 0.5 إلى 1X. لا إعادة استخدام الحل DTT متبقية.
- عند استخدام طقم ثنائي GloTM للمرة الأولى ، إعداد الكاشف (اليراع) Luciferase بنقل محتويات زجاجة واحدة من الاحتياطي Luciferase المزدوجة GloTM (بشرط مع عدة) لزجاجة واحدة من الركيزة Luciferase المزدوجة GloTM (شريطة مع عدة). تقسيم الكاشف Luciferase غير المستخدمة إلى 10 ميلي aliquots وتخزينها في -20 جيم ˚
- إزالة لوحة 96 - جيدا من نسيج الثقافة الحاضنة ووضعه على الجليد. إزالة وسائل الاعلام والطموح ، إضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من تحلل العازلة ، ثم يترك لوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- في كامد ، أبيض 96 - جيدا لوحة (OptiplateTM - 96 ، رقم الكتالوج بيركن إلمر 6005290) قسامة 15 ميكرولتر لكل بئر من Luciferase الكاشف ، ثم إضافة 15 ميكرولتر من lysate الخلية.
- احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ثم قراءة التلألؤ في microplate القارئ.
- على الفور قبل استخدامه ، وإعداد مبلغ مناسب من Renilla حل الركيزة luciferase بإضافة جزء 1 المزدوجة وإيقاف GloTM بالشبكة ®؛ الكاشف (بشرط مع عدة) إلى 100 جزء المزدوجة وإيقاف GloTM بالشبكة ® العازلة (بشرط مع عدة).
- إضافة إلى كل جانب 15 ميكرولتر لكل بئر من الحل الركيزة luciferase Renilla ، يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ثم قياس التألق مرة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
