ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

Summary

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。

Abstract

膜の生合成中に別の脂質合成経路の調整を検討するためには、膜の生合成は、迅速かつ誘導的に発生した実験システムで動作するように便利です。我々は、細胞が急速に粒子の貪食時の材料のラッピングとして失わ膜プールを補充するために膜脂質を合成としてラテックスビーズの貪食は、これらの目的のために実用的であることを見出した。ここでは、プロメガからデュアルグロルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アプローチと貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。

Protocol

細胞の文化

1. ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の保存培養は抗生物質のカクテル（ペニシリンのmlあたり100個および100μgを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で構成される"中"、で10cmの培養皿で増殖させるストレプトマイシン硫酸のml当たり）及び10％ウシ胎児血清（FBS）。
2. 実験用セルを設定するには、培地を吸引し、細胞をリン酸5mlで2回洗浄している生理食塩水（PBS）ソリューションをバッファ。
3. PBSを除去し、0.25％トリプシンを含む溶液0.6 mLで置き換えられます。
4. 細胞がデタッチし始めているまで、皿を37˚Cで約2分間インキュベートする。
5. 培地5.5 mlのトリプシンを中和するために添加し、細胞を、血球計でカウントされます。
6. 細胞を、1ml当たり32万細胞に希釈し、ポリリジンコートした96穴培養プレートにウェルあたり0.1ミリリットルで分配される。
7. 37˚C 8.8％CO2を含む大気中で組織培養インキュベーター中に皿を置き、24時間のために成長する。

トランスフェクション

1. トランスフェクションのための準備では、実験条件とどのようなプラスミドの量はトランスフェクションされるごとに実行するかを多くの複製を考慮する必要があります。我々は日常的に三連のすべての条件を実行し、ウェルあたりのプラスミドDNAの50〜100 ngの合計をト​​ランスフェ。プラスミドミックスは、少なくとも記者はホタルルシフェラーゼと構成的プロモーターからの制御を発現するプラスミドウミシイタケルシフェラーゼを発現するコンストラクト含める必要があります。
2. プラスミド溶液は1.5 mlのマイクロ遠心チューブにピペットと無血清および抗生物質を含まないDMEMのサンプルあたり10μLで補足されています。たとえば、20の井戸がそれぞれが50μgのDNAをトランスフェクトされる場合は、1μgのDNAに200μlのDMEMを加える。
3. DMEM / DNA溶液に、μgのDNA当り3μlの"トランジット293試薬"（Mirus）を追加します。 ＆上下にピペッティングして混合し、少なくとも10分間室温で試料を放置する。
4. この期間中、96ウェル培養プレートから培地を除去し、新鮮な培地Aの90μlのと交換してください
5. それぞれによくDMEM / DNA /トランジット293混合物の10μlを加える。
6. 37˚C 8.8％CO2を含む大気中で組織培養インキュベーター中に皿を置き、24時間のために成長する。

貪食

1. 培地B（DMEMとHamのF12培地に加えて抗生物質の1:1混合物と10％FBS）を加えたml当たりゼロから1 mgで0.75μmのラテックスビーズを含む懸濁液を準備する。
2. 96ウェル培養プレートからメディアを取り出して、培地Bのビーズ懸濁液0.1 mlを交換してください
3. 1000 × gで2分間プレートを回転させる
4. 次に、細胞を6〜16時間、37˚Cで培養されています。条件とルシフェラーゼを駆動するために使用されるプロモーターに依存し、増加したレポーター遺伝子の発現は、1〜3時間後に検出することができます。
5. 同じケースではそれが30〜60分間ビーズで細胞をインキュベートするために必要となる場合があります、その後、PBSで2回洗浄には取り込まれなかったビーズを除去し、時間の追加の期間の細胞をインキュベートする前に新鮮な培地を追加することです。

デュアルGloTMルシフェラーゼアッセイ

1. 注：このキットを使用するための我々のプロトコルは、メーカーが推奨することからいくつかの点で異なります。これは、サンプルごとに必要な試薬の量を減らすために変更されています。
2. -20˚Cで複数の小分けや店舗に1 M DTT、除算の溶液を調製します
3. の20mM Tris - HCl（pH7.8）中、10％（v / v）グリセロール、および0.5％（v / v）のトリトンX - 100を含む溶解バッファーを準備します。使用前に、一定量の実験に必要な量をと1xを0.5の最終濃度に1 M DTTを加えたプロテアーゼ阻害剤カクテルのmlあたり1μlを追加。残りのDTT溶液を再使用しないでください。
4. 初めてデュアルGloTMキットを使用する場合は、デュアルGloTMルシフェラーゼ基質（提供の一瓶に（キットに付属）デュアルGloTMルシフェラーゼバッファの一瓶の内容全体を転送することにより（ホタル）ルシフェラーゼ試薬を準備するキット付き）。 -20˚Cで10 mlのアリコートとストアに使用されていないルシフェラーゼ試薬を分ける
5. 組織培養インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、氷の上に置きます。吸引によってメディアを削除する、40μlをウェルあたりの溶解バッファーを追加して、氷上で30分間プレートを残す。
6. 白、不透明な96ウェルプレート（OptiplateTM - 96、パーキンエルマーカタログ番号6005290）のアリコート15μlをウェルあたりのルシフェラーゼ試薬、およびその後細胞溶解液の15μLを追加で。
7. 室温で10分間プレートをインキュベートし、マイクロプレートリーダーで発光をお読みください。
8. 使用直前に、1部デュアルGloTMストップ＆グロを追加することにより、ウミシイタケルシフェラーゼの基質溶液の適当量を準備®、100部に試薬（キットに付属）デュアルGloTMストップ＆グロ®バッファー（キットに付属）。
9. それぞれによく、10分間室温でインキュベートウミシイタケルシフェラーゼの基質溶液15μlのウェルあたりを、追加してから、再度発光を測定します。