Summary
De postnatale rat model voor hypoxisch-ischemische hersenschade is een goed uitgewerkt model van de menselijke neonatale hypoxische ischemische encefalopathie (HIE). In dit artikel beschrijven we het model van HIE in post-natale rattenjongen.
Abstract
Hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE) is het gevolg van de systemische verstikking optreedt bij de geboorte. Vijfentwintig procent van de pasgeborenen met HIE ontwikkelen ernstige en permanente neuropsychologische gevolgen, waaronder mentale retardatie, cerebrale parese, en epilepsie. De uitkomsten van HIE zijn verwoestende en permanent, waardoor het van cruciaal belang voor identificeren en te ontwikkelen therapeutische strategieën om hersenletsel te verminderen bij pasgeborenen met HIE. Daartoe heeft de neonatale rat model voor hypoxisch-ischemische hersenschade is ontwikkeld om deze menselijke conditie model. Het HIE-model werd voor het eerst gevalideerd door Vannucci et al. 1 en is sindsdien op grote schaal gebruikt om de mechanismen van hersenletsel als gevolg van perinatale hypoxie-ischemie 2 te identificeren en te testen potentiële therapeutische interventies 3,4. Het HIE-model is een twee stappen proces en de ligatie van de linker a. carotis communis, gevolgd door de blootstelling aan een hypoxische omgeving. Cerebrale bloedstroom (CBF) in het halfrond ipsilaterale om de geligeerde halsslagader niet afnemen als gevolg van het onderpand bloedstroom via de cirkel van Willis, maar met een lagere zuurstofspanning, de CBF in de ipsilaterale hemisfeer vermindert aanzienlijk en resulteert in een eenzijdige ischemische schade . Het gebruik van 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) om vlekken en identificeren ischemisch hersenweefsel werd oorspronkelijk ontwikkeld voor volwassen modellen van knaagdieren cerebrale ischemie 5, en wordt gebruikt om de mate van cerebrale infarctin te evalueren in de vroege tijdstippen tot 72 uur na de ischemische gebeurtenis 6. In deze video, tonen we aan de hypoxische-ischemische schade model in postnatale hersenen van de rat en de evaluatie van de grootte van het infarct met behulp van TTC vlekken.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Stanford University en houdt zich aan de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van proefdieren.
Neonatale Rat HIE model
- Postnatale dag (PND) 7 Sprague-Dawley ratten pups (Charles River Laboratories, Inc, Wilmington, MA) zijn volledig verdoofd met isofluraan (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL, 3-4% voor de inductie en 1-2% voor onderhoud).
- Een kleine incisie gemaakt in de nek (Extra Thin Iris Schaar # 14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA) aan de linkerkant gemeenschappelijke halsslagader (CCA) bloot te leggen.
- De CCA is geligeerd met een 5-0 zijden hechtdraad (5-0 zijde, Ethicon, Somer, NJ).
- De incisie wordt gesloten met cyanoacrylaat lijm (Elmers Products Inc, Columbus, OH). De incisie is bedekt met tape en anesthesie is gestopt. De pups zijn terug naar hun moeder en mogen om te herstellen voor 1-2 uur.
- Pups worden dan geplaatst in een zuurstofarme kamer die 8% zuurstof in balans met 92% stikstof voor 100 minuten bij 37 ° C bevat 8% oxygen/92% stikstofgas (Airgas, Sacramento, CA) stromen via een buis in de kooi muis voorzien van een plastic hoes. De hoes is gemaakt om te passen aan de kooi en heeft twee gaten van 2 cm in diameter, waarvan een op de buis is aangesloten op de 8% zuurstof gas tank en een ander te ontvangen laat het gas flowout aan. De kamer is geplaatst in een waterbad en wordt opgewarmd voor gebruik en een thermometer binnen moet 37 ° C registreren voor de start van de hypoxie.
- Aan het einde van 100 minuten van hypoxie, zijn de pups weer terug naar hun moeder voor herstel.
- 24 uur na het einde van hypoxie, worden pups gedood door diepe anesthesie met isofluraan. Hersenweefsel is geperfuseerd met koud fysiologisch zout, gevolgd door een oplossing van koud 1% TTC in fosfaat-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC moet worden gehouden beschermd tegen licht.
- Hersenen worden verwijderd en gekoeld voor 1-2 minuten op ijs, en vier coronale secties 3 mm uit elkaar (niveaus 1-4) worden versneden, te beginnen rostraal op het niveau van de opticchiasm en infundibulum, die overeenkomt met de bregma 1.8 ~ 2.0 mm niveau van de volwassen hersenen van muizen.
- Brain plakjes worden ondergedompeld in TTC-oplossing en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 8 minuten, gevolgd door fixatie in 4% paraformaldehyde / PBS gedurende de nacht. Omdat de TTC is lichtgevoelig, houd plakjes uit de buurt van het licht in deze tijd.
- De TTC gekleurde coupes worden gescand en gedigitaliseerd. Met Image J (NIH, Bethesda, MD), de volgende zijn gemeten voor elk niveau: gebied van infarct (ongekleurde gebied), het gebied van de ipsilaterale hemisfeer, en het gebied van de contralaterale hemisfeer. Het percentage infarct oppervlakte per stuk wordt als volgt berekend: (gebied van infarct / gedeelte van ipsilaterale hemisfeer) of A 1, A 2, A 3 en A 4. Het percentage volume van infarct wordt berekend als de som (A 1 + A 2 + 3 + A A 4) * 3 mm. Gebieden van corticale of striatale letsel kunnen ook afzonderlijk worden gekwantificeerd op een vergelijkbare manier.
Representatieve resultaten
Figuur 1. Vertegenwoordiger HIE coronale niveaus 1-4 gekleurd met TTC.
TTC gekleurde coronale secties tonen gebied van infarct (in wit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het knaagdier postnatale HIE model is een model dat vastgesteld recapituleert cerebrale hypoxie zich in de peri-natale periode bij pasgeborenen. Uitgebreide histologische en immunocytochemische karakterisering studies hebben aangetoond dat het zeven dagen oude knaagdier de analoge hersenen volwassenheid om een derde trimester menselijke foetus 7 model. Het knaagdier HIE model is zeer leerzaam voor het begrijpen van de mechanismen van de hersenen letsel als gevolg van perinatale hypoxie 2, waar interventies zoals hypothermie zijn gevalideerd 3. Dit model was in eerste instantie geperfectioneerd in ratten en meer recent aangepast aan de muizen 8.
Er zijn specifieke technische details die vermelden bevel:
- Voor ligatie van het CCA, moet u het bindweefsel en nervus vagus die verstrikt CCA te verwijderen. Met succesvolle ligatie van het CCA, moet het schip kleur boven de ligatie website wit. Als alternatief is het ook aan te raden om dubbele ligeren en in het midden van twee ligatie plaatse werden omgehakt. Dek de incisie over de geligeerde CCA met label tape voor het plaatsen van de pup terug met het moederdier.
- Een maximale duur van niet meer dan 10 minuten van de anesthesie voor elke pup is optimaal voor CCA ligatie en succesvol resultaat.
- De herstelperiode na de CCA ligatie moet worden 90-120 minuten. Indien korter, pups hebben minder kans om te overleven, en als er langer meer variabiliteit van infarct te zijn, neigt naar kleinere infarcten.
- Temperatuur is van cruciaal belang. Plaats altijd een thermometer in de kamer en de temperatuur op 37 ° C. De lengte van hypoxie kan variëren van 90 tot 120 minuten, afhankelijk van de situatie en de ernst van de verwondingen die u wilt bereiken.
- TTC kleuring is van toepassing voor de analyse van infarct volume tot 72 uur na de HIE. Langere overlevingstijd punten dient te worden beoordeeld door het snijden en cresyl violet vlekken op de infarctgrootte te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Gefinancierd door American Heart Association en de March of Dimes.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
- Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats. Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).
- Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury. Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).
- Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat. Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).
- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
- Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).
