Summary
hypoxic ischemic मस्तिष्क चोट के लिए प्रसव के बाद चूहे मॉडल मानव नवजात hypoxic ischemic encephalopathy (जल्दी करना) के एक मॉडल अच्छी तरह से स्थापित है. इस अनुच्छेद में, हम प्रसवोत्तर चूहे पिल्ले में जल्दी मचाना के मॉडल का वर्णन.
Abstract
Hypoxic Ischemic encephalopathy (जल्दी करना) प्रणालीगत जन्म के समय होने वाली श्वासावरोध का परिणाम है. बीस जल्दी मचाना के साथ नवजात शिशुओं के पांच प्रतिशत गंभीर और स्थायी neuropsychological sequelae विकसित मानसिक मंदता, मस्तिष्क पक्षाघात और मिरगी सहित. जल्दी मचाना के परिणाम विनाशकारी और स्थायी हैं, की पहचान करने और चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए जल्दी मचाना के साथ नवजात शिशुओं में मस्तिष्क की चोट को कम करने के लिए महत्वपूर्ण बना. कि अंत करने के लिए, hypoxic ischemic मस्तिष्क चोट के लिए नवजात चूहे मॉडल इस मानव हालत मॉडल विकसित किया गया है. जल्दी करना मॉडल पहले Vannucci एट अल 1 द्वारा मान्य किया गया था और तब से बड़े पैमाने पर प्रसवकालीन hypoxia-ischemia 2 से उत्पन्न मस्तिष्क की चोट के तंत्र की पहचान करने और संभावित उपचारात्मक उपायों 3,4 परीक्षण किया गया. जल्दी करना मॉडल एक दो कदम प्रक्रिया है और बाएँ एक hypoxic पर्यावरण के लिए जोखिम के बाद आम मन्या धमनी की ligation शामिल है. Ligated मन्या धमनी ipsilateral गोलार्द्ध में सेरेब्रल रक्त प्रवाह (CBF) विलिस के चक्र के माध्यम से संपार्श्विक रक्त प्रवाह की वजह से कमी नहीं है, लेकिन कम ऑक्सीजन तनाव के साथ, ipsilateral गोलार्द्ध में CBF काफी घट जाती है और एकतरफा इस्कीमिक चोट में परिणाम . 2,3,5 triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) का उपयोग करने के लिए दाग और ischemic मस्तिष्क के ऊतकों की पहचान मूल कृंतक मस्तिष्क ischemia के 5 वयस्क मॉडल के लिए विकसित किया गया था, और जल्दी समय बिंदुओं पर 72 के लिए मस्तिष्क infarctin की हद का मूल्यांकन किया जाता है इस्कीमिक 6 घटना के बाद घंटे . इस वीडियो में, हम hypoxic इस्कीमिक प्रसवोत्तर चूहे के मस्तिष्क में चोट के मॉडल और रोधगलितांश टीटीसी धुंधला का उपयोग आकार के मूल्यांकन का प्रदर्शन.
Protocol
इस प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय और abides में प्रायोगिक पशुओं के इस्तेमाल के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा अनुमोदित किया गया था.
नवजात चूहा जल्दी मचाना मॉडल
- शामिल होने के लिए 3-4% और 1-2% के लिए, डाक प्रसव (PND) दिन 7 Sprague Dawley चूहे पिल्ले (चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं, Inc, Wilmington, एमए) isoflurane (Aerrane, बैक्सटर, Deerfield, आईएल के साथ पूरी तरह से anesthetized हैं अनुरक्षण).
- एक छोटा सा चीरा गर्दन में किया जाता है (अतिरिक्त पतला परितारिका कैंची 14088-10 # ललित विज्ञान उपकरण इंक, फोस्टर शहर, सीए) के लिए छोड़ दिया आम मन्या धमनी (सीसीए) का पर्दाफाश.
- सीसीए 5-0 रेशम सीवन (5-0 रेशम, Ethicon, Somer, न्यू जर्सी) के साथ ligated है.
- चीरा cyanoacrylate चिपकने वाला (Elmers उत्पाद इंक, कोलंबस, OH) के साथ बंद कर दिया है. चीरा टेप के साथ कवर किया जाता है और संज्ञाहरण बंद कर दिया है. पिल्ले उनके बांध को लौट रहे हैं और 1-2 घंटे के लिए स्वस्थ हो जाना करने की अनुमति दी.
- Pups तो एक hypoxic कक्ष है कि 8% 37 पर 100 मिनट के लिए 92% नाइट्रोजन के साथ संतुलित ऑक्सीजन होता है डिग्री सेल्सियस में रखा जाता है 8% oxygen/92% नाइट्रोजन गैस (Airgas, Sacramento, CA) एक प्लास्टिक कवर के साथ outfitted माउस पिंजरे में एक ट्यूब के माध्यम से प्रवाह. को कवर करने के पिंजरे के लिए फिट करने के लिए बना है और व्यास में 2 सेमी की दो छेद है, जिनमें से एक 8% ऑक्सीजन गैस टैंक और दूसरे से जुड़े ट्यूब प्राप्त गैस flowout करने की अनुमति देता है. कक्ष एक पानी के स्नान में रखा जाता है और है पहले से गरम करने के लिए उपयोग करने के लिए और एक थर्मामीटर के अंदर hypoxia के शुरू होने से पहले 37 ° C रजिस्टर करना होगा.
- Hypoxia के 100 मिनट के अंत में, पिल्ले फिर वसूली के लिए उनके बांध को लौट रहे हैं.
- Hypoxia के अंत के बाद 24 घंटे, पिल्ले isoflurane के साथ गहरे संज्ञाहरण द्वारा euthanized हैं. मस्तिष्क ऊतक ठंड सामान्य नमक के साथ perfused है, फॉस्फेट में ठंड 1% टीटीसी के एक समाधान द्वारा पीछा खारा, 7.4 पीएच (सिग्मा रासायनिक कं, सेंट लुइस, MO) buffered. टीटीसी प्रकाश से सुरक्षित रखा जाना चाहिए.
- दिमाग हटा दिया है और बर्फ पर 1-2 मिनट, और चार राज्याभिषेक 3 मिमी के अलावा (स्तर 1-4) वर्गों के लिए ठंडा कटौती कर रहे हैं, 1.8 bregma करने के लिए इसी opticchiasm और infundibulum के स्तर पर rostrally शुरुआत ~ 2.0 मिमी का स्तर वयस्क माउस मस्तिष्क.
- मस्तिष्क स्लाइसें टीटीसी समाधान में डूब रहे हैं और 37 में incubated डिग्री सेल्सियस 8 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde / रातोंरात पीबीएस में निर्धारण के बाद. क्योंकि टीटीसी प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, स्लाइस इस समय के दौरान प्रकाश से दूर रखना.
- टीटीसी दाग वर्गों स्कैन कर रहे हैं और डिजीटल. रोधगलन (अस्थिर क्षेत्र) के क्षेत्र, ipsilateral गोलार्द्ध के क्षेत्र, और contralateral गोलार्द्ध के क्षेत्र: छवि (एनआईएच, Bethesda, एमडी) जम्मू, निम्न प्रत्येक स्तर के लिए मापा जाता है का उपयोग करना. प्रतिशत infarcted टुकड़ा प्रति क्षेत्र के रूप में गणना की है: (रोधगलितांश / ipsilateral गोलार्द्ध के क्षेत्र के क्षेत्र) या एक 1, 2, 3, और 4 एक. रोधगलितांश की प्रतिशत मात्रा (एक 1 + 2 + 3 + 4 ए) 3mm * राशि के रूप में गणना की है. Cortical या striatal चोट के क्षेत्र को भी अलग से एक समान तरीके में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. टीटीसी के साथ प्रतिनिधि जल्दी करना राज्याभिषेक 1-4 दाग स्तर .
टीटीसी दाग राज्याभिषेक वर्गों रोधगलितांश के क्षेत्र (सफेद) में प्रदर्शित करता है.
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Discussion
कृंतक प्रसव के बाद जल्दी करना मॉडल एक स्थापित मॉडल कि recapitulates मस्तिष्क hypoxia के नवजात शिशुओं में पेरी प्रसव की अवधि में होने वाली है. व्यापक histological और immunocytochemical लक्षण वर्णन अध्ययन से दिखा दिया है कि 7 दिन पुराने कृंतक अनुरूप मस्तिष्क परिपक्वता के लिए एक तीसरी तिमाही मानव भ्रूण 7 मॉडल है . कृंतक जल्दी मचाना मॉडल बहुत जानकारीपूर्ण पेरी प्रसव 2 hypoxia है, जहां ऐसे हाइपोथर्मिया के रूप में में हस्तक्षेप 3 मान्य किया गया है से मस्तिष्क की चोट के तंत्र को समझने के लिए किया गया है. इस मॉडल को शुरू चूहों में सिद्ध किया गया था और अधिक हाल ही में 8 चूहों को अनुकूलित.
वहाँ विशिष्ट तकनीकी जानकारी का उल्लेख है कि वारंट हैं:
- सीसीए के ligation के पहले, संयोजी ऊतक और वेगस nervus जो सीसीए उलझाना सकता है निकालने के लिए सुनिश्चित हो. सीसीए के सफल ligation के साथ, ligation साइट के ऊपर पोत रंग सफेद बारी चाहिए. वैकल्पिक रूप से, यह भी ligate डबल और दो ligation साइट के बीच में कटौती की सिफारिश की है. अपने बांध के साथ पिल्ला वापस रखने से पहले लेबल टेप के साथ ligated सीसीए पर चीरा कवर.
- एक पिल्ला के लिए संज्ञाहरण के 10 से अधिक नहीं मिनट की एक अधिकतम अवधि सीसीए ligation और सफल परिणाम के लिए इष्टतम है.
- सीसीए ligation के बाद आरोग्यलाभ की अवधि 90-120 मिनट होना चाहिए. यदि छोटे पिल्ले को कम जीवित होने की संभावना हैं, और अगर अब infarction के अधिक परिवर्तनशीलता हो सकता है, छोटे दौरे की ओर प्रवृत्त होगा.
- तापमान महत्वपूर्ण है. हमेशा कक्ष में एक थर्मामीटर जगह और 37 के तापमान पर बनाए रखने डिग्री सेल्सियस hypoxia की लंबाई 90 से 120 स्थिति और चोट की गंभीरता आप हासिल करना चाहते हैं पर निर्भर करता है मिनट के लिए भिन्न हो सकते हैं.
- टीटीसी धुंधला जल्दी मचाना के बाद 72 घंटे तक रोधगलितांश मात्रा का विश्लेषण के लिए लागू होता है. अब अस्तित्व समय अंक सेक्शनिंग और cresyl वायलेट धुंधला रोधगलितांश आकार निर्धारित करने के लिए द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
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Acknowledgments
अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन और ऑफ डाइम्स के मार्च के द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
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