Summary
Послеродовые модели крыс для гипоксически-ишемической травмы головного мозга является устоявшейся модели человеческого неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатией (ГИЭ). В этой статье мы опишем модель HIE в послеродовой крысят.
Abstract
Гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) является следствием системных асфиксии, происходящих при рождении. Двадцать пять процентов новорожденных с ГИЭ развиваются тяжелые и постоянные нейропсихологических последствий, в том числе умственная отсталость, церебральный паралич и эпилепсия. Результаты HIE являются разрушительными и постоянные, делая его критическим для определения и разработки терапевтических стратегий снижения повреждения мозга у новорожденных с ГИЭ. С этой целью новорожденных модели крыс для гипоксически-ишемического повреждения головного мозга была разработана для модели этого человека. HIE модель была впервые подтверждена Ваннуччи и др. 1 и с тех пор широко используется для выявления механизмов повреждения мозга в результате перинатальной гипоксии-ишемии 2 и для проверки потенциального терапевтического вмешательства 3,4. HIE модель состоит из двух этапов и включает в себя перевязки левой общей сонной артерии последующим воздействием гипоксической среде. Церебрального кровотока (CBF) в полушарии ипсилатерального к лигируют сонной артерии не уменьшается из-за потока крови через залога круга Уиллиса, однако с меньшим напряжения кислорода, БФК в ипсилатеральной полушарии значительно уменьшается, что приводит к односторонним ишемического повреждения . Использование 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (ТТК) для окрашивания и выявить ишемические ткани мозга была первоначально разработана для взрослых моделей грызунов ишемии головного мозга 5, и используется для оценки степени мозгового infarctin на ранних моментов времени до 72 часов после ишемического события 6. В этом видео, мы демонстрируем гипоксически-ишемического повреждения модель в постнатальном мозге крыс и оценки размера инфаркта использованием ТТС окрашивания.
Protocol
Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета в Стэнфордском университете и соблюдает Национального института здоровья руководящих принципов для использования подопытных животных.
Новорожденных модель HIE Крыса
- Сообщение день рождения (PND) 7 Sprague-Dawley крысят (Charles River Laboratories, Inc, Уилмингтон, Массачусетс), полностью анестезировали изофлуран (Aerrane, Baxter, Дирфилд, штат Иллинойс, 3-4% для индукции и 1-2% для обслуживание).
- Небольшой надрез в области шеи (дополнительная Тонкие Ирис Ножницы # 14088-10, Точная наука Инструменты Inc, Foster City, CA), чтобы выставить левой общей сонной артерии (ССА).
- ОСО лигируют с 5-0 шелковых шва (5-0 шелк, Ethicon, Somer, Нью-Джерси).
- Разрез закрыт с цианакрилатного клея (Элмерс Products Inc, Колумбус, Огайо). Разрез покрыта лентой и анестезия остановился. Щенки вернулись в свои плотины и позволило восстановиться в течение 1-2 часов.
- Щенки затем помещаются в гипоксической камере, которая содержит 8% кислорода сбалансированы с 92% азота в течение 100 минут при температуре 37 ° C. 8% oxygen/92% азота (Airgas, Сакраменто, Калифорния) потока через трубку в клетку мышь оснащена пластиковой крышкой. Крышка сделана в соответствии с клеткой и имеет два отверстия диаметром 2 см, один из которых на получение трубка подключена к 8% кислородный баллон газа, а другой позволяет газа в flowout. Камера помещается в ванну с водой и подогревается до использования и термометр внутри него должны зарегистрировать 37 ° С до начала гипоксии.
- В конце 100 минут гипоксии, щенки снова вернулся к своей плотины для восстановления.
- 24 часов после окончания гипоксии, щенки эвтаназии глубоким наркозом с изофлуран. Мозговая ткань является перфузии с холодным физиологическим раствором, после чего решение холодного 1% ТТС в фосфатном буферном растворе, рН 7,4 (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури). TTC должны храниться в защищенном от света.
- Мозги удаляются и охлаждается в течение 1-2 минут на льду, и четыре короны разделах 3 мм друг от друга (уровни 1-4) обрезаются, начиная рострально на уровне opticchiasm и воронки, соответствующие брегмы 1,8 ~ 2,0 мм уровне взрослом мозге мыши.
- Мозг ломтиками погружены в раствор ТТК и инкубировали при 37 ° С в течение 8 минут, а затем фиксация в 4% параформальдегид / PBS в течение ночи. Потому что ТТС светочувствительные, держать ломтиками вдали от света в это время.
- Разделы TTC окрашенных сканируются и оцифровываются. Использование изображения J (NIH, Bethesda, MD), следующие измеряются для каждого уровня: площадь миокарда (неокрашенных район), площадь ипсилатерального полушария, а площадь контралатерального полушария. Процентов инфаркта площади на срез вычисляется по формуле: (площадь инфаркта / область ипсилатерального полушария) или 1, 2, 3 и 4. Процентов объема инфаркта рассчитывается как сумма (1 + 2 + 3 + 4) * 3 мм. Области коры или полосатой травма также может быть отдельно количественно в подобной манере.
Представитель Результаты
Рисунок 1. Представитель HIE корональных уровней 1-4 окрашивали ТТК.
TTC окрашенных корональные разделы демонстрируют области миокарда (в белом).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Грызун послеродовой модель HIE является признанным модель, которая повторяет гипоксии мозга, происходящих в перинатальной периоде у новорожденных. Обширные гистологических и иммуноцитохимического исследования характеристик показал, что на 7 дней старый грызун имеет аналогичные зрелости мозга к модели третьего триместра человека 7 плода. Модель грызунов HIE была очень информативной для понимания механизмов травмы головного мозга от перинатальной гипоксии 2, где такие мероприятия, как переохлаждение были утверждены 3. Эта модель была первоначально совершенства у крыс и совсем недавно, адаптированных к мышам 8.
Есть определенные технические детали, которые требуют упоминания:
- Перед перевязкой ОСО, не забудьте удалить соединительной ткани и nervus блуждающего, которые могут запутать ОСО. С успешным перевязки ОСО, судно цвета выше перевязки сайт должен стать белым. Кроме того, он также рекомендовал, чтобы удвоить лигировать и вырезать в середине две перевязки сайта. Обложка разрез над лигируют ОСО с меткой ленту перед размещением щенка обратно с плотины.
- Максимальная продолжительность не более 10 минут анестезии для каждого щенка является оптимальным для ОСО перевязки и успешного результата.
- Рекуперации период после перевязки ОСО должна быть 90-120 минут. Если короче, щенки имеют меньше шансов выжить, а если больше будет больше изменчивость миокарда, тенденция к меньшим инфарктов.
- Температура имеет решающее значение. Всегда размещайте термометр в камере и поддержания температуры при 37 ° C. Длина гипоксия может варьироваться от 90 до 120 минут в зависимости от ситуации и степени серьезности травмы вы хотите достичь.
- TTC окрашивания применяется для анализа инфаркта объемом до 72 часов после HIE. Более точках выживаемость должна быть оценена секционирования и фиолетового окрашивания крезиловый, чтобы определить размер инфаркта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансируемая Американской ассоциации сердца и марте Dimes.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
- Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats. Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).
- Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury. Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).
- Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat. Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).
- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
- Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).
