Den hypoxisk ischemisk encefalopati Modell av perinatal Ischemi

Summary

Den postnatala råttmodell för hypoxisk-ischemisk hjärnskada är en väl etablerad modell för mänskliga neonatal hypoxisk ischemisk encefalopati (HIE). I denna artikel beskriver vi en modell av HIE i postnatal råttungar.

Abstract

Hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE) är en följd av systemisk syrebrist uppstår vid födseln. Tjugofem procent av de nyfödda med HIE utveckla allvarliga och permanenta neuropsykologiska sequelae, inklusive psykisk utvecklingsstörning, cerebral pares och epilepsi. Resultaten av HIE är förödande och permanent, vilket gör det viktigt att identifiera och utveckla terapeutiska strategier för att minska hjärnskada hos nyfödda barn med HIE. För detta ändamål har den nyfödda råttor modell för hypoxisk-ischemisk hjärnskada har utvecklats för att modellera denna människans villkor. Den HIE modellen först valideras av Vannucci m.fl. ¹ och har sedan dess i stor utsträckning användas för att identifiera mekanismerna bakom hjärnskador till följd av perinatala hypoxi-ischemi ² och för att testa potentiella terapeutiska ingrepp ^3,4. Den HIE modellen är en process i två steg och innebär ligation av vänster gemensamma halspulsådern följt av exponering för en hypoxisk miljö. Cerebralt blodflöde (CBF) i halvklotet ipsilaterala till knyts ihop halspulsådern minskar inte på grund av de säkerheter blodflödet genom kretsen av Willis, men med lägre syre spänningar, minskar CBF i ipsilaterala halvklotet avsevärt och resulterar i ensidiga ischemisk skada . Användningen av 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) att färga och identifiera ischemisk hjärnvävnad utvecklades ursprungligen för vuxna modeller av gnagare cerebral ischemi ^5, och används för att bedöma omfattningen av cerebral infarctin i tidiga tidpunkter upp till 72 timmar efter ischemisk händelse ^6. I denna video visar vi de hypoxisk-ischemisk skada modell i postnatala råtta hjärnan och utvärdering av infarkt storlek med hjälp av TTC färgning.

Protocol

Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Stanford University och står fast vid National Institutes of Health riktlinjer för användningen av försöksdjur.

Nyfödda råttor HIE modell

1. Postnatal dag (PND) 7 Sprague-Dawley råttungar (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) är helt sövda med isofluran (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL, 3-4% för induktion och 1-2% för underhåll).
2. Ett litet snitt görs i halsen (Extra Thin Iris sax # 14.088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA) för att avslöja vänster gemensamma halspulsådern (CCA).
3. CCA är knyts ihop med en 5-0 silke sutur (5-0 silke, Ethicon, Somer, NJ).
4. Snittet avslutas med cyanoakrylatlim (Elmers Products Inc, Columbus, OH). Snittet är täckt med tejp och anestesi stoppas. Valparna är tillbaka till moderdjuret och tillåts återhämta sig i 1-2 timmar.
5. Valpar placeras sedan i en hypoxisk kammare som innehåller 8% syre balanserad med 92% kväve för 100 minuter vid 37 ° C. 8% oxygen/92% kvävgas (Airgas, Sacramento, CA) flöde via en slang in i musen buren utrustad med ett plasthölje. Locket är tillverkat för att passa till buren och har två hål på 2 cm i diameter, kan en av dem för att få röret anslutas till 8% syrgas tank och annan gas till flowout. Kammaren placeras i ett vattenbad och värms upp före användning och en termometer inuti det måste registrera 37 ° C innan hypoxi.
6. I slutet av 100 minuter av syrebrist, är ungarna tillbaka igen till sin mor för återvinning.
7. 24 timmar efter utgången av syrebrist, är ungar avlivades av djup anestesi med isofluran. Hjärnvävnaden perfusion med kallt vanlig koksaltlösning, följt av en lösning av kall 1% TTC fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC måste hållas skyddas från ljus.
8. Brains tas bort och kyls i 1-2 minuter på is, och fyra koronala avsnitt 3 mm från varandra (nivåer 1-4) skärs, med början rostrally i nivå med de opticchiasm och infundibulum, motsvarande bregma 1,8 ~ 2,0 mm nivå den vuxna musen hjärnan.
9. Hjärnan skivor är nedsänkta i TTC lösning och inkuberas vid 37 ° C i 8 minuter, följt av fixering i 4% paraformaldehyd / PBS natten. Eftersom TTC är ljuskänsligt, håll skivor borta från ljus under denna tid.
10. TTC färgade snitt skannas och digitaliseras. Använda bilder i J (NIH, Bethesda, MD) följande mäts för varje nivå: område av infarkt (ofärgade område), den del av ipsilaterala halvklotet, och den del av kontralaterala hemisfären. Det procent infarktområdet per skiva beräknas som: (området infarkt / område ipsilaterala halvklotet) eller A _1, A _2, A ₃ och A _4. Andelen volym infarkt beräknas som summan (A ₁ + A ₂ + A ₃ + A ₄₎ * 3mm. Områden av kortikal eller striatala skada kan också vara för sig kvantifieras på ett liknande sätt.

Representativa resultat

Figur 1. Representant HIE koronalt nivåer 1-4 färgade med TTC.

TTC färgade koronalt sektioner visa område av infarkt (i vitt).

Discussion

Den gnagare postnatal HIE modell är en etablerad modell som rekapitulerar cerebral hypoxi inträffar i perinatal period nyfödda. Omfattande histologiska och immuncytokemiska karakterisering studier har visat att 7 dagar gamla gnagare har motsvarande hjärnan mognad för att modellera en tredje trimestern människofoster ^7. Den gnagare HIE modellen har varit mycket informativ för att förstå mekanismerna bakom hjärnskador från perinatal hypoxi ^2, där insatser såsom hypotermi har validerats ^3. Denna modell var ursprungligen fullkomnade i råttor och på senare tid anpassats till möss ^8.

Det finns specifika tekniska detaljer som förtjänar omnämnande:

1. Innan ligation av CCA, se till att ta bort bindväv och nervus vagus som kan trassla in CCA. Med framgångsrika ligation av CCA bör fartyget färgen ovanför ligation platsen blir vita. Alternativt är det också rekommenderas att dubbla ligate och skär i mitten av två ligering webbplats. Täck över snittet under de knyts ihop CCA med etikett tejp innan du lägger valpen tillbaka med sin mor.
2. Högst av högst 10 minuter av anestesi för varje valp är optimal för CCA ligation och framgångsrikt resultat.
3. Den återhämtning tiden efter CCA ligation bör vara 90-120 minuter. Om kortare, ungarna är mindre troligt att överleva, och om längre tid kommer det att finnas mer variation för infarkt, går mot mindre infarkter.
4. Temperaturen är kritisk. Placera alltid en termometer i kammaren och hålla temperaturen vid 37 ° C. Längden på hypoxi kan variera från 90 till 120 minuter beroende på situation och graden av skada du vill uppnå.
5. TTC färgning gäller för analys av infarkt volym upp till 72 timmar efter HIE. Längre överlevnadstid punkter bör bedömas av sektionering och Cresyl violett färgning för att bestämma infarkt storlek.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley Rat Pups	Animal	Charles River Laboratories
Isoflurane	Surgery	Baxter Internationl Inc.
8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas	Surgery	Airgas
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Reagent	GIBCO, by Life Technologies
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148