Summary
O modelo de ratos pós-natal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral é um modelo bem estabelecido de humanos encefalopatia hipóxico isquêmica neonatal (HIE). Neste artigo, descrevemos o modelo de HIE em filhotes de ratos pós-natal.
Abstract
Encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) é a conseqüência de asfixia sistêmica que ocorre no nascimento. Vinte e cinco por cento dos recém-nascidos com EHI desenvolver seqüelas graves e permanentes neuropsicológicos, incluindo retardo mental, paralisia cerebral e epilepsia. Os resultados da HIE são devastadores e permanentes, tornando-se fundamental para identificar e desenvolver estratégias terapêuticas para reduzir a lesão cerebral em recém-nascidos com EHI. Para o efeito, o modelo de rato neonatal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral foi desenvolvido para este modelo condição humana. O modelo HIE foi validado por Vannucci et al 1 e desde então tem sido amplamente utilizado para identificar mecanismos de lesão cerebral resultante da isquemia perinatal hypoxia-2 e para testar potenciais intervenções terapêuticas 3,4. O modelo HIE é um processo em duas etapas e envolve a ligadura da artéria carótida comum esquerda, seguida da exposição a um ambiente hipóxico. Fluxo sangüíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral à artéria carótida ligada não diminui por causa do fluxo sanguíneo colateral através do polígono de Willis, no entanto com a tensão mais baixa de oxigênio, a CBF no hemisfério ipsilateral diminui significativamente e resulta em lesão isquêmica unilateral . O uso de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) a mancha e identificar o tecido cerebral isquêmico foi originalmente desenvolvida para modelos adultos de isquemia cerebral de roedores 5, e é usado para avaliar a extensão da infarctin cerebral em momentos iniciais até 72 horas após o evento isquêmico 6. Neste vídeo, demonstramos o modelo de lesão hipóxico-isquêmica no cérebro de ratos pós-natal ea avaliação do tamanho do infarto usando coloração TTC.
Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade de Stanford e age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso de animais experimentais.
Modelo de HIE neonatal Rat
- Dia pós natal (PND) 7 filhotes de ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) estão totalmente anestesiados com isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% para a indução e 1-2% para manutenção).
- Uma pequena incisão é feita no pescoço (Extra Fino Tesoura Iris # 14088-10, Fine Ciência Tools Inc, Foster City, CA) para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA).
- O CCA é ligada com um fio de seda 5-0 (5-0 seda, Ethicon, Somer, NJ).
- A incisão é fechada com cola de cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). A incisão é coberta com fita adesiva e anestesia é interrompida. Os filhotes são devolvidos aos seus barragem e permitiu a recuperação de 1-2 horas.
- Filhotes são então colocados em uma câmara hipóxica que contém oxigênio de 8% balanceada com nitrogênio 92% para 100 minutos a 37 ° C. 8% de gás nitrogênio oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) do fluxo através de um tubo na gaiola do mouse equipado com uma cobertura de plástico. A capa é feita para se ajustar à gaiola e tem dois furos de 2 cm de diâmetro, um dos quais para receber o tubo ligado ao tanque de oxigênio de 8% do gás e outra permite que o gás flowout. A câmara é colocada em um banho de água e é aquecido antes do uso e um termômetro dentro dele deve registrar 37 ° C antes do início da hipóxia.
- No final de 100 minutos de hipóxia, os filhotes são devolvidos de novo à sua barragem para a recuperação.
- 24 horas após o fim da hipóxia, os filhotes são sacrificados por anestesia profunda com isoflurano. Tecido cerebral é perfundido com solução salina fria, seguido de uma solução de frio TTC 1% em tampão fosfato pH, solução salina 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC devem ser mantidos ao abrigo da luz.
- Cérebros são removidos e resfriados por 1-2 minutos no gelo, e quatro cortes coronais 3 milímetros de distância (níveis 1-4) são cortados, começando rostralmente ao nível do opticchiasm e infundíbulo, correspondente ao bregma 1,8 ~ 2,0 mm de nível o cérebro do rato adulto.
- Fatias de cérebro são imersos numa solução TTC e incubados a 37 ° C por 8 minutos, seguido de fixação em paraformaldeído a 4% / PBS durante a noite. TTC porque é sensível à luz, manter fatias longe da luz durante este tempo.
- Os cortes corados TTC são escaneados e digitalizados. Usando Image J (NIH, Bethesda, MD), os seguintes são medidos para cada nível: área de infarto (área imaculada), a área do hemisfério ipsilateral, ea área do hemisfério contralateral. O percentual de infarto área por fatia é calculado como: (área de infarto / área do hemisfério ipsilateral) ou A 1, A 2, A 3 e A 4. Por cento do volume de infarto é calculada como a soma (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3mm. Áreas de lesão cortical ou estriado também pode ser quantificado separadamente de forma semelhante.
Resultados representante
Figura 1. HIE representativo níveis coronal 04/01 corados com TTC.
TTC manchada secções coronal demonstram área de infarto (em branco).
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Discussion
O roedor modelo HIE pós-natal é um modelo estabelecido que recapitula hipóxia cerebral que ocorrem no período peri-natal em recém-nascidos. Extensos estudos de caracterização histológica e imunocitoquímica têm demonstrado que o roedor 7 dias de idade tem a maturidade do cérebro análogo ao modelo um terceiro trimestre 7 feto humano. O modelo HIE roedor foi muito informativo para a compreensão dos mecanismos da lesão cerebral de peri-natal hipóxia 2, onde as intervenções, tais como hipotermia foram validados 3. Este modelo foi aperfeiçoado inicialmente em ratos e, mais recentemente adaptado para ratos 8.
Há detalhes técnicos específicos que merecem destaque:
- Antes de ligadura da CCA, certifique-se de remover o tecido conjuntivo e nervo vago que pode complicar a CCA. Com ligadura bem-sucedida do CCA, a cor do navio acima do local da ligadura deve virar branco. Alternativamente, também é recomendado para dobrar ligadura e corte no meio de dois sites ligadura. Cobrir a incisão sobre o CCA ligada com fita de etiquetas antes de colocar o filhote de volta com sua mãe.
- A duração máxima não superior a 10 minutos de anestesia para cada filhote é ideal para CCA ligadura e êxito.
- O período de recuperação após a ligadura CCA deve ser 90-120 minutos. Se menor, os filhotes têm menos chances de sobreviver, e se já haverá maior variabilidade de infarto, tendendo a infartos menores.
- Temperatura é crítica. Sempre coloque um termômetro na câmara e manter a temperatura a 37 ° C. O comprimento de hipóxia pode variar de 90 a 120 minutos, dependendo da situação e gravidade da lesão que pretende alcançar.
- Coloração TTC é aplicável para análise do volume de infarto até 72 horas após HIE. Pontos mais tempo de sobrevivência devem ser avaliados pelo seccionamento e coloração violeta cresil para determinar o tamanho do infarto.
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Acknowledgments
Financiado pela American Heart Association e March of Dimes.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
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