Забор крови из американского Подкова Краб, Limulus Полифема
Summary
Американская подковы краба, Limulus Полифема, вероятно, является наиболее удобным источником для большого количества крови любого беспозвоночных. Кровь простой по составу, только с одним камерного типа в общую циркуляцию, гранулированных амебоцит, и только три обильных белков в плазме, гемоцианин, С-реактивного белка, и α2-макроглобулина. Кровь собирается из сердца и клеток крови и плазмы центрифугированием.
Abstract
Подковы краба имеет лучшие характеризуется иммунная система любого долгоживущих беспозвоночных. Изучение иммунитета у мечехвостов способствовало легкости в сборе больших объемов крови и от простоты крови. Мечехвостов показать только один тип ячейки в общую циркуляцию, гранулированных амебоцит. Плазме содержания соли в морской воде, и только три обильных белков, гемоцианин, дыхательной белок, С-реактивного белка, которые функционируют в цитолитического уничтожение чужеродных клеток, в том числе бактериальной клетки и α2-макроглобулина, который ингибирует протеазы вторжение болезнетворных микроорганизмов. Кровь собирается прямой пункции сердца в условиях, которые сводят к минимуму загрязнение липополисахарида (ака, эндотоксин, ЛПС), продукт грам-отрицательных бактерий. Большое животное может принести 200 – 400 мл крови. Для изучения плазмы, клеток крови, немедленно удаляются из плазмы путем центрифугирования и плазмы может быть фракционированного на составляющие ее белки. Клетки крови удобно изучать микроскопически, собирая небольшие объемы крови в LPS-свободный изотонический солевой раствор (0,5 М NaCl) в условиях, допускающих прямое микроскопическое исследование, поставив один из более ЛПС без coverglasses на поверхности блюда культуры, то установка этих coverglasses в простых камер наблюдения следующие ячейки привязанности. Второй подготовки к непосредственному наблюдению является сбор 3 – 5 мл крови в LPS-свободный эмбрион блюдо, а затем культивирующий в искусственной среде фрагменты агрегированных amebocytes к камере, что бутерброды ткани между предметным и покровного стекла. В этой подготовке, подвижных amebocytes мигрировать на поверхность покровного стекла, где они могут легко быть соблюдены. Систему свертывания крови включает в себя совокупность amebocytes и формирование внеклеточного сгусток белка, coagulin, который выделяется из секреторных гранул из клеток крови. Биохимический анализ отмытых клеток крови, что требует агрегации и дегрануляции не происходит, что может быть осуществлено путем сбора крови в 0,1 объемах 2% Твин-20, 0,5 М ЛПС без NaCl, с последующим центрифугированием клеток и мытье 0,5 М NaCl.
Protocol
Discussion
Есть четыре вида подковы краба, Limulus Полифема с восточного побережья Северной Америки и три вида, которые варьируются от Японии до Бенгальского залива. Животных определяется как "живое ископаемое", потому что анатомически подобные формы были найдены в ископаемом состоянии от 445 миллионо…
Acknowledgements
Оригинальные исследования, описанные выше была поддержана NSF гранта 0344630.
References
- Lochhead, J. H., Brown, F. A. Selected Invertebrate Types. , 360-381 (1950).
- Shuster, C. N. The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review. US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , (1978).
- Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga. Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).
- Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties. J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).
- Levin, J., Ornberg, R. L., Cohen, W. D. Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology. , 259-260 (1985).
- Liang, S. M., Liu, T. Y. Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).
- Soderhall, K., Smith, V. J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution. Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).
- Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes. Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).
- Armstrong, P. B., Rickles, F. R. Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte. Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).
- Iwanaga, S., Kawabata, S., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. 3, (1998).
- Armstrong, P. B. The American Horseshoe Crab. , 288-309 (2003).
- Iwanaga, S. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).
- Levin, J. The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems. Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).
- Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria. J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).
- James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).
- Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab. J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).
- Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer. , 276-17796 (2001).
- Armstrong, P. B. A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins. J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).
- Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).
- Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot. Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).
- Armstrong, P. B. Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro. Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).
- Armstrong, P. B. Motility of the Limulus blood cell. J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).
- Armstrong, P. B. Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces. J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).
- Armstrong, P. B., Cohen, W. D. Blood Cells of Marine Invertebrates. Lab. Animal. , 253-258 (1985).
- Smith, S. A., Berkson, J. Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus). Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).
- Leibovitz, L., Lewbart, G. A., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. The American Horseshoe Crab. , 245-275 (2003).
- Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits. Palaeontology. 51, 1-9 (2008).
- Shuster, C. N., Sekiguchi, K., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. . The American Horseshoe Crab. , 103-132 (2003).
- Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study. Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 .
- Patten, W. The Evolution of the Vertebrates and Their Kin. P. Blakiston’s Son and Co. , 195-209 (1912).
