Summary

Забор крови из американского Подкова Краб, Limulus Полифема

Published: October 13, 2008
doi:

Summary

Американская подковы краба, Limulus Полифема, вероятно, является наиболее удобным источником для большого количества крови любого беспозвоночных. Кровь простой по составу, только с одним камерного типа в общую циркуляцию, гранулированных амебоцит, и только три обильных белков в плазме, гемоцианин, С-реактивного белка, и α2-макроглобулина. Кровь собирается из сердца и клеток крови и плазмы центрифугированием.

Abstract

Подковы краба имеет лучшие характеризуется иммунная система любого долгоживущих беспозвоночных. Изучение иммунитета у мечехвостов способствовало легкости в сборе больших объемов крови и от простоты крови. Мечехвостов показать только один тип ячейки в общую циркуляцию, гранулированных амебоцит. Плазме содержания соли в морской воде, и только три обильных белков, гемоцианин, дыхательной белок, С-реактивного белка, которые функционируют в цитолитического уничтожение чужеродных клеток, в том числе бактериальной клетки и α2-макроглобулина, который ингибирует протеазы вторжение болезнетворных микроорганизмов. Кровь собирается прямой пункции сердца в условиях, которые сводят к минимуму загрязнение липополисахарида (ака, эндотоксин, ЛПС), продукт грам-отрицательных бактерий. Большое животное может принести 200 – 400 мл крови. Для изучения плазмы, клеток крови, немедленно удаляются из плазмы путем центрифугирования и плазмы может быть фракционированного на составляющие ее белки. Клетки крови удобно изучать микроскопически, собирая небольшие объемы крови в LPS-свободный изотонический солевой раствор (0,5 М NaCl) в условиях, допускающих прямое микроскопическое исследование, поставив один из более ЛПС без coverglasses на поверхности блюда культуры, то установка этих coverglasses в простых камер наблюдения следующие ячейки привязанности. Второй подготовки к непосредственному наблюдению является сбор 3 – 5 мл крови в LPS-свободный эмбрион блюдо, а затем культивирующий в искусственной среде фрагменты агрегированных amebocytes к камере, что бутерброды ткани между предметным и покровного стекла. В этой подготовке, подвижных amebocytes мигрировать на поверхность покровного стекла, где они могут легко быть соблюдены. Систему свертывания крови включает в себя совокупность amebocytes и формирование внеклеточного сгусток белка, coagulin, который выделяется из секреторных гранул из клеток крови. Биохимический анализ отмытых клеток крови, что требует агрегации и дегрануляции не происходит, что может быть осуществлено путем сбора крови в 0,1 объемах 2% Твин-20, 0,5 М ЛПС без NaCl, с последующим центрифугированием клеток и мытье 0,5 М NaCl.

Protocol

Анатомические особенности подковы краба, имеющие отношение к кровотечение (рис. 1) Рисунок 1 Три основных отдела тела, спереди назад, являются головогруди (P), opisthosoma (O), и тельсона …

Discussion

Есть четыре вида подковы краба, Limulus Полифема с восточного побережья Северной Америки и три вида, которые варьируются от Японии до Бенгальского залива. Животных определяется как "живое ископаемое", потому что анатомически подобные формы были найдены в ископаемом состоянии от 445 миллионо…

Acknowledgements

Оригинальные исследования, описанные выше была поддержана NSF гранта 0344630.

References

  1. Lochhead, J. H., Brown, F. A. Selected Invertebrate Types. , 360-381 (1950).
  2. Shuster, C. N. The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review. US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , (1978).
  3. Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga. Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).
  4. Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties. J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).
  5. Levin, J., Ornberg, R. L., Cohen, W. D. Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology. , 259-260 (1985).
  6. Liang, S. M., Liu, T. Y. Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).
  7. Soderhall, K., Smith, V. J. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution. Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).
  8. Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes. Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).
  9. Armstrong, P. B., Rickles, F. R. Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte. Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).
  10. Iwanaga, S., Kawabata, S., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. 3, (1998).
  11. Armstrong, P. B. The American Horseshoe Crab. , 288-309 (2003).
  12. Iwanaga, S. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).
  13. Levin, J. The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems. Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).
  14. Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria. J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).
  15. James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).
  16. Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab. J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).
  17. Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer. , 276-17796 (2001).
  18. Armstrong, P. B. A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins. J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).
  19. Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).
  20. Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot. Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).
  21. Armstrong, P. B. Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro. Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).
  22. Armstrong, P. B. Motility of the Limulus blood cell. J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).
  23. Armstrong, P. B. Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces. J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).
  24. Armstrong, P. B., Cohen, W. D. Blood Cells of Marine Invertebrates. Lab. Animal. , 253-258 (1985).
  25. Smith, S. A., Berkson, J. Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus). Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).
  26. Leibovitz, L., Lewbart, G. A., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. The American Horseshoe Crab. , 245-275 (2003).
  27. Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits. Palaeontology. 51, 1-9 (2008).
  28. Shuster, C. N., Sekiguchi, K., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. . The American Horseshoe Crab. , 103-132 (2003).
  29. Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study. Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 .
  30. Patten, W. The Evolution of the Vertebrates and Their Kin. P. Blakiston’s Son and Co. , 195-209 (1912).

Play Video

Cite This Article
Armstrong, P., Conrad, M. Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus. J. Vis. Exp. (20), e958, doi:10.3791/958 (2008).

View Video