Blodtappning från den amerikanska Horseshoe Crab, Limulus Polyfemos

Summary

Den amerikanska hästsko krabba, Limulus Polyfemos, är utan tvekan den mest bekväma källa för stora mängder av blod av alla ryggradslösa. Blodet är enkel sammansättning, med endast en celltyp i den allmänna cirkulationen, det granulat amebocyte, och endast tre rikliga proteiner i plasma, hemocyanin, C-reaktivt protein och α2-makroglobulin. Blod samlas in från hjärtat och blodkroppar och plasma separeras genom centrifugering.

Abstract

Hästskon krabba har den bästa karaktäriserad immunsystemet av någon långlivade ryggradslöst. Studien av immunitet i Horseshoe krabbor har underlättats av den lätthet med att samla in stora mängder blod och från enkelheten i blodet. Hästsko krabbor visar bara en enda celltyp i den allmänna cirkulationen, det granulat amebocyte. Plasman har salthalten i havsvatten och endast tre rikliga proteiner, hemocyanin, andningsvägar protein, C-reaktiva proteiner, som fungerar i cytolytisk förstörelsen av främmande celler, inklusive bakterieceller, och α2-makroglobulin som hämmar proteaser av invaderande patogener. Blod samlas in genom direkt hjärt punktering under förhållanden som minimerar kontaminering av lipopolysackarid (alias, endotoxin, LPS), en produkt av gramnegativa bakterier. Ett stort djur kan ge 200 till 400 ml blod. För studiet av plasman, är blodceller omedelbart bort från plasma genom centrifugering och plasma kan sedan fraktioneras i dess olika proteiner. Blodkroppar är bekvämt studeras mikroskopiskt genom att samla in små mängder blod i LPS-fria isoton koksaltlösning (0,5 M NaCl) under förhållanden som medger direkt mikroskopisk undersökning genom att placera en mer LPS-fri täckglas på kulturen skålen ytan, då montering dem täckglas i enkla observation kammare efter cellbindning. En andra förberedelse för direkt iakttagelse är att samla in 3 – 5 ml blod i ett LPS-fri embryo skålen och sedan explantation fragment av aggregerade amebocytes till en kammare som smörgåsar vävnaden mellan en bild och en coverglass. I denna beredning, den rörliga amebocytes vandrar på coverglass ytan, där de kan vara svåra att upptäcka. Blodets förmåga att levra innebär aggregering av amebocytes och bildandet av ett extracellulärt klump av ett protein, coagulin, som frisätts från sekretoriska granuler av blodkroppar. Biokemiska analys av tvättade blodceller kräver att aggregering och degranulering inte förekomma, vilket kan uppnås genom att samla in blod i 0,1 volymer av 2% Tween-20, 0,5 M LPS-fri NaCl, följt av centrifugering av celler och tvätt med 0,5 M NaCl.

Protocol

Anatomiska funktioner i hästsko krabba relevant blödning (Fig. 1) Figur 1 De tre stora divisioner av kroppen, från främre till bakre, är prosoma (P), den opisthosoma (O), och den mellersta stjärtfenan (T) 1. Främre och laterala fria marginaler prosoma är flänsen. Den bakre-mest indrag av opis…

Discussion

Det finns fyra arter av hästsko krabba, Limulus Polyfemos från den östra kusten av Nordamerika och tre arter som sträcker sig från Japan till Bengaliska viken. Djuret identifieras som ett "levande fossil" eftersom anatomiskt liknande former har hittats som fossil från 445 miljoner år sedan ^27. Hästskon krabba representerar ett långlivat djur, som kräver 10 till 13 år att nå mognad och leva minst 20 år ^28. Även om det har utsatts för omfattande avverkning som bete för ål och conch fis…