Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Yani bu, nöral öncü hücre izolasyonu, ayrışması ve kültürlemenin ilk adımıdır. İlk önce 24 kuyulu bir plaka kaplayacağım. Doku kültürü için tedavi edilmez.

Hücrelerin yapışması için onu bir laminin ile kaplayacağım. Bu yüzden önce onu su ve poli de lizin karışımıyla kaplayacağım. Kuyu başına yaklaşık 450 mikrolitre ekleyeceğiz.

Bu yüzden sadece yapacağım, yani plakanın yarısını, buradaki iki sırayı poli D lizin çözeltisi ile kapladım. Ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca sadece buradaki kaputta kuluçkaya yatıracağım. Yani beş dakikadır kuluçkaya yatıyor.

Burada sadece PDL solüsyonunu bir vakumla çıkaracağım. Ev vakum eylemi. Şimdi kuyuları tekrar suyla durulayacağım, yaklaşık 450 mikrolitre.

Su durulama için gerçekten inkübasyon süresi yok. Sadece devam edeceğim ve suyu aspire edeceğim. Bu yüzden şimdi laminat çözeltisini ekleyeceğim.

Laminat, mil başına iki mikrogram hızla EM EM ortamına çözülür. Bu yüzden her birine 450 mikrolitre laminat solüsyon ekleyeceğim, şu anda plastik kaplıyorum. Bu kuyularda kaplamalı kapak fişleri de olabilir.

Hücreleri 37 derecede bir doku kültürü inkübatöründe en az dört saat inkübe edeceğim. Bu yüzden 45 derecelik bir açıyla bükülmüş iki İnce forsepsim var. Ayrıca 45 derecelik bir açıyla bükülmüş ince bir makasım var.

Sadece uterusun ilk diseksiyonu için bazı künt forsepsler ve dişide kesmek için bazı büyük makaslar. Pekala, bu bir CD, normal bir kadın. Embriyonik 12 buçuk gün embriyolarına hamile.

Onu zaten CO2 boğulması ve servikal çıkık kullanarak feda ettim. Ve şimdi rahmi ve ardından embriyoları çıkaracağım. Bu yüzden önce karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte etmem gerekiyor.

Büyük forsepslerimi karnının ortasından ve alt yarısına doğru tutuyorum, bir kesik yapıyorum, aletlerimi yere koyuyorum ve sadece cildi yırtıyorum, karnı tekrar açığa çıkarıyorum, aynı yerden tutuyorum. Ortada başka bir kesim yapın ve dişiyi açarak yanlamasına kesin. Şimdi embriyoları açığa çıkarıyorum.

İşte onun rahmi, embriyolarla şişmiş. Bu yüzden ilk kesimi yumurtalıkların hemen altından yapıyorum, yol boyunca yağları kesiyorum ve yukarı doğru çekiyorum. O tarafı aşağı yatırıyorum ve sadece embriyoların arasına giriyorum.

Açıkçası, embriyoların üstüne tutunmak dokuya zarar verebilir. Ve bu çok açık. Bir üzüm dizisine benziyorlar.

Üzümlerin arasından tekrar tutun, diğer taraftaki yumurtalığın üstünü kesin ve yağı kesin. Son kesim burada ortada yapılacaktır. Yine yağları kesiyorum.

Embriyoların olduğu rahim var. Yani diseksiyon iltihabım PBS ve %0.6 glukoz ve penisilin streptomisin. İlk önce sadece kanı çıkarmak için embriyoları diseksiyon ortamında durulayacağım.

Yani diseksiyonum temiz. Bu yüzden embriyoları ortaya çıkarmak için rahim boyunca yağın karşısındaki boynu boyunca keseceğim. Yağ nerede?

Diğer taraftadır çünkü onu göremezsin. Yani burada açıkta kalan bir embriyo var. Size bunun kapsamda nasıl göründüğünü gösterebilirim.

İşte kapsam altında nasıl göründüğü. Rahmin bu tarafını keseceğim. Karşı taraf, yağ.

Buradaki yağa bakın, şişmanı gerçek görebiliyorum. Bu yüzden sadece keseceğim, uzunluğu sonuna kadar dolduracağım. Ve gördüğünüz gibi, ben rahimden aşağıya doğru uzanırken embriyolar dışarı çıkacak.

Biraz daha kuzeyde. Oh, bir tane var. Muhteşem. Yani sadece dışarı çıkan yağ embriyolarının karşısındaki tarafı kesiyorsunuz.

Evet, hepsi öyle. Burada bazen geri dönmeniz ve kaçırdıysanız bir şeyler açmanız gereken bir çift. Yani bu amniyon mu yoksa bu koryon mu ve, bu corion.

Amniyon, içinde, embriyo ile yakından ilişkilidir. Bakın, buradan amniyonları gerçekten göremezsiniz. Emyo embriyosunu çıkardığımda, bunların daha küçük olduğunu ve bunları kullanmayacağını söyleyebilirim.

Ama, yani açıkta kalan tüm embriyolar var. Şimdi burada açığa çıkan embriyolarım var. Katmanları embriyodan soyacağım ve daha sonra ince diseksiyon için embriyoyu temiz bir tabağa aktaracağım.

İşte ilk katman. Onu çıkardıktan sonra, genellikle göbek kordonunu ararım. Bu oldukça sert bir doku.

Ve aslında hayvanı göbek kordonu ile kaldırabilirim. İşte tam orada. Bunu gösterebilir misiniz?

Evet, tam orada. Sadece, evet, kırmızı gemiyi, fanny şeyini görün. evet. İşte bu göbek kordonu ve karın içine yapışıyor ve ben genellikle sadece uzanıp onu tutuyorum.

İşte başlıyoruz. Şimdi embriyonun kafasındaki deriyi çıkaracağım. Serebral korteksi açığa çıkarıyor, hücreleri buradan alacağım.

Bu yüzden sol elimle, embriyonun arkasını delerek onu bu şekilde tutacağım. Onu tabağın dibine doğru tutuyorum. Sağ elimle, forsepslerimle gözümün altında, derinin altında içeri gireceğim, onu deleceğim ve sonra koparacağım.

Şimdi burada yakalayabileceğim bir avantajım var. Tamam. Ve sonra diğer dört adımımla, karşı kenarı tutun ve cildi soyacağım ve genellikle alttaki mezenşim onunla birlikte gelir. Şimdi sağ yarımkürenin bir kuzeye maruz kaldığını görebilirsiniz.

Embriyoyu çevireceğim ve kapmak için başka bir kenar bulmaya çalışacağım. Yani derinin başka bir kenarı var. Ters çevirin, soymaya devam edin.

İşte başlıyoruz. Serebral korteksi açığa çıkarmak. Şimdi sadece kafamı kıstıracağım, bu da serebral korteksin parçalarını çıkarmak için daha iyi bir pozisyona gelmemi sağlayacak.

Bu yüzden sadece forsepslerimle çimdikliyorum, altındaki diğer forsepslerle ovuyorum, hemen kesiyorum. Ve bir sırt görünümü var. Burada ön beynin dorsal görünümünü, serebral korteksin iki yarım küresini, boya sefalonunu ve sonra buralarda orta beynin görüntüsünü görebilirsiniz.

İşte nöral kök hücre derneği için parçaları alıyor olun. Şimdi embriyoyu sol forsepsimle tutup bu şekilde tutacağım. Korteksin parçalarını kesmek için bana iyi bir pozisyon ve açı verin.

Şimdi ince makasımla içeri gir ve ön serebral korteksi bu şekilde kesiyorum. Bana bir delik açayım ki yanal kesimimi yapabileyim ve dorsal orta hatta yakın bir kesim yapayım, ancak kortekste bulunan nöro öncülleri veya nöro öncülleri izole etmeye çalışan orta hat hücrelerinden kaçınırım. Bu bir, serebral korteksten bir parça.

Ve gördüğünüz gibi, burada sağ tarafta bir kalınlaşma var. Şimdi bu aslında yanal GIC üstünlüğünün başlangıcıdır, ki bu bizim hazırlığımızda istemiyoruz, çünkü dorsal korteksten gelen öncüllerle ilgileniyoruz. Bu yüzden devam edeceğim ve bunu keseceğim.

Sizi sadece dorsal korteksten gelen hücrelerle baş başa bırakıyorum. Şimdi diğer tarafa geçeceğim. Aynı yöntem.

Sağ elini kullandığım için biraz daha garip oluyor ama yine de ön kesimi yapın, makasınızı deliğe sokun. Sırt tarafı, yan taraf boyunca kesin. Bu sefer çetenin manik kanıtlarından kaçınmaya çalışacağım.

İşte dorsal korteksin yarım kürelerinden iki parça. Bu yüzden şimdi, korteksleri, çöpün geri kalanını incelerken oturacakları diseksiyon ortamı içeren 15 millik konik bir tüpe aktarmak için kesilmiş bir P 1000 pipet ucu kullanacağım. Bu yüzden şimdi sadece bir parça emeceğim.

Bu yüzden şimdi korteksleri çanaktan, çöpün geri kalanını incelerken oturacakları diseksiyon ortamını içeren 15 mil konik içine aktarıyorum. Bu yüzden tüm çöpü parçalara ayırdım Ve şimdi fazla diseksiyon ortamını aspire edeceğim, az miktarda sıvı ve nezaket bırakacağım. Şimdi yaklaşık 500 mikrolitre Trix ve EDTA ekleyeceğim ve tüpü 20 dakika boyunca 37 derecelik bir su banyosuna yerleştireceğim.

Bu yüzden 20 dakikalık inkübasyondan sonra 500 mikrolitre soya fasulyesi tripan inhibitörü ekliyorum. Şimdi, çok küçük bir deliğe sahip alevle parlatılmış bir mera pipeti kullanarak hücreleri mekanik olarak yineleyeceğim veya ayıracağım. Çok fazla hava kabarcığı tanıtmak istemiyorum, ama yaparsanız, bu da sorun değil.

Yaklaşık beş ila 10 kez yukarı ve aşağı gidersiniz ve hücrelerin bir buluta dağılması gerekir. Şimdi hücreleri 1000 RPM'de, bir dakika boyunca 25 derece döndüreceğim. Hücreleri döndürdükten sonra, fazla sıvıyı aspirasyonla çıkaracağım ve zar zor görülebilen küçük bir pelet bırakacağım.

Bu konik tüpün dibinde küçük bir SA yayması gibi görünüyor. Sadece küçük bir miktar sıvıya inanıyorum, peleti aspire etmemeye çok dikkat ediyorum. Açıkçası şimdi pelete yıkama solüsyonu ekliyorum.

Tamam, bin RPM'de bir dakika boyunca 25 derece başka bir dönüş. Yine, aspirasyondan sonra sadece hücre peletini ve çok az miktarda sıvıyı bırakarak fazla sıvıyı aspire edeceğim. İstediğim büyüme ortamını büyüme faktörleri ile ekleyeceğim.

Açıkçası kültür deneyine özgü olarak, ekleyeceğim hacim kaç tane embriyoyu diseke ettiğime ve hangi yaşta olduğuma bağlı. Bu nedenle, tipik olarak, E 12 buçuk embriyonun tamamı için, yaklaşık 700 mikrolitreye kadar ekleyebilirsiniz. Bunun için hücrelerimi biraz daha konsantre etmek için yaklaşık 300 mikrolitre ekleyeceğim Laminat kaplı Plakamı inkübatörden çıkarmak için.

En az dört saat oldu. Ve şimdi laminat medyayı aspire edeceğim. Ve şimdi büyüme medyamla bir durulama yapacağım.

Yaklaşık 300 mikrolitre ile duruluyorum ve büyüme ortamından 400 mikrolitre aspire edip ekleyeceğim. Bu yüzden hücrelerimi bir Hema sitometresi kullanarak saydım ve kuyu başına yaklaşık 100.000 hücre plakalayacağım. Bu 24 kuyulu plakada.

Her deney, oyuk başına farklı sayıda hücre gerektirir. Benim özel tahlilim için, 100.000 iyi çalışıyor. Hücreleri 37 derece %5 CO2 olan doku kültürü inkübatörüne koyacağım ve yaklaşık bir gün kültürlemelerine izin vereceğim.

Laminata yapışacaklar ve 24 saat sonra yayacaklar. Özel tahlilim için büyüme faktörlerine arzumu ekleyeceğim.