Name: Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 44 s
Description: Keşfedin fare embriyo korteksinden nöral kök hücre öncüleri izolasyon yöntemini. Laminin kaplama, doku diseksiyonu ve hücre kültürü teknikleriyle güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> E12.5 embriyo korteks Fare sinir öncüleri (NPC) izole edildi. </li><li> Deri ve mezenkimal katmanları disseke telencephalic veziküller çıkarıldı. </li><li> Veziküller, 37% 0.02 EDTA ve 20 dakika boyunca HBSS% 0,2 BSA ° C ile% 0.05 tripsin inkübe edildi. </li><li> Trypsinization HBSS 1 mg / ml soya tripsin inhibitörü eşit hacmi (Sigma T6522) tarafından durduruldu. </li><li> Doku yangın cilalı Pasteur pipetler öğütme birkaç tur kullanarak ayrışmış sindirir. </li><li> Hücreler HBSS içinde% 0.2 BSA ile bir kez yıkanmış ve 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml FGF2 (R &amp; D Sistemleri veya Peprotech), ve 2 ug / ml heparin (medya laminin-kaplı lamelleri 50.000 hücreleri / ml kaplama edildi Sigma). </li></ol>

<ol><li>Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+roles+of+CNS+dorsal+midline+cells+in+choroid+plexus+epithelial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation.</a> Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).</li>
<li>Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).</li>
</ol>

Yeteneğimizi embriyonik nöral kök hücreler, hasat, izole etmek ve kültür merkezi sinir sistemi gelişimi ve kök hücre biyolojisi anlayışımıza büyük gelişmeler ile mümkün olmuştur. Bu video E12.5 fare serebral korteks ve embriyonik nöral kök hücrelerin sonraki ayrıştırılmasıyla ve kültür diseksiyonu göstermektedir. Birçok diğer benzer yöntemlerle başarılı bir şekilde diğer araştırmacılar tarafından istihdam edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Düz İris Makası</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Orta Boy Makas</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Makas</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Eğri Pens</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr></tbody></table>

fare nöral kök hücre Öncüleri kültür

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

İlköğretim nöral kök hücre kültürleri, merkezi sinir sistemi gelişimi altında yatan mekanizmaları inceleyerek için yararlıdır. Kök hücre araştırmaları sinir sistemi anlayışımız artacak ve bize şu anda tedavisi mümkün olmayan beyin hastalıkları ve yaralanmalar için tedavi geliştirmek için izin verebilir. Buna ek olarak, kök hücreleri, sinir farklılaşma ve transdiferansiye mekanizmaları ve genetik ve çevresel sinyaller detaylı bir çalışma amaçlayan kök hücre araştırmaları için kullanılması gerektiğini, özellikle hücre tipleri içine hücreleri doğrudan uzmanlaşma. Bu video hücreleri embriyonik gün 12.5 fare dorsal önbeyin parçalara ayırma için kullanılan bir tekniktir göstermektedir. Diseksiyonu prosedür E12.5 fare embriyoları rahim, hasat, ince diseksiyon forseps ile &quot;deri&quot; kaldırma ve sonunda serebral korteks parçaları izole içerir. Diseksiyonu takiben, doku ve mekanik ayrışmış sindirilir. Yeniden süspanse ayrışmış hücreler daha sonra sinir kök hücrelerinin büyüme yana &quot;kök hücre&quot; medya kültürü vardır.

Bu video embriyonik farelerin gelişmekte olan korteks neuroprecursors izolasyonu için kullanılan yöntem açıklanır. , Embriyoların rahim kaldırarak, kortikal doku diseksiyon, ve sindirerek izole serebral korteks prosedür gösterilmiştir.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Primer nöral kök hücre kültürleri, merkezi sinir sistemi gelişiminin altında yatan mekanizmaları incelemek için faydalıdır. Kök hücre araştırmaları artacaktır...

Bu, nöral öncül hücre izolasyonu, disosiasyonu ve kültürü işleminin ilk adımıdır. İlk olarak, doku kültürü için işlem görmemiş bir 24 kuyucuklu plakayı kaplayacağım.Hücrelerin yapışması için laminin ile kaplama yapacağım. Öncelikle, kuyucukları su ve poli-D-lisin karışımı ile kaplayacağım. Her kuyucuğa yaklaşık 450 µL ekleyeceğim.Şöyle yapacağım, plakanın yarısını, buradaki bu iki sırayı poly D lysine çözeltisi ile kapladım. ve burada, sadece çeker ocak içinde oda sıcaklığında beş dakika inkübe edeceğim. Beş dakikadır inkübe oluyor.Şimdi PDL solüsyonunu burada bir vakumla uzaklaştıracağım. Ev tipi vakum işlemi. Şimdi kuyucukları tekrar suyla, yaklaşık 450 µL ile durulayacağım.Suyla durulama işlemi için gerçekten herhangi bir inkübasyon süresi yoktur. Şimdi suyu aspire edeceğim. Ardından laminin solüsyonunu ekleyeceğim.Laminat, EM EM besiyerinde mililitre başına iki mikrogram konsantrasyonda çözülmüştür. Bu nedenle, her bir kuyucuğa 450 µL laminat çözeltisi ekleyeceğim; şu anda plastik kaplama yapıyorum. Bu kuyucuklarda kaplanmış lamel camlar da kullanabilirdiniz.Hücreleri, bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de en az dört saat inkübe edeceğim. Ayrıca, 45 derecelik açıyla bükülmüş iki adet ince pensetim ve yine 45 derecelik açıyla bükülmüş ince makaslarım var.Rahmin ilk diseksiyonu için bazı küt uçlu pensler ve dişide kesim yapmak için bazı büyük makaslar. Tamam, bu CD1 olan, normal bir dişi. Embriyonik gün 12,5 embriyolarla hamile.CO2 asfiksiyasyonu ve servikal dislokasyon yöntemlerini kullanarak hayvanı sakrifiye ettim. Şimdi rahmi ve ardından embriyoları çıkaracağım. Bu nedenle öncelikle abdomen bölgesini %70 etanol ile dezenfekte etmem gerekiyor.Büyük pensimle karnının orta kısmından ve alt yarısına doğru tutup bir kesi yapıyorum, aletlerimi bırakıp deriyi basitçe yırtarak karnı yeniden açıyorum ve aynı noktadan tutuyorum. Ortada başka bir kesi yapıp yanlara doğru keserek dişiyi açıyorum. Şu an embriyoları açığa çıkarıyorum.İşte embriyolarla şişmiş uterusu. Bu yüzden ilk kesiği yumurtalıkların hemen altına yapıyorum, bu sırada yağları temizliyorum ve yukarı doğru çekiyorum. O tarafı aşağıya yatırıyorum ve sadece embriyoların arasından tutuyorum.Embriyoların üst kısmından tutmanın dokuya zarar verebileceği açıktır. Bu durum oldukça belirgindir; zira embriyolar bir salkım üzüme benzerler.Üzümleri tekrar arasından kavrayarak, diğer tarafta yumurtalığın üzerinden kesin ve fazla kısımları temizleyin. Son kesim burada, orta kısımdan yapılacaktır. Tekrar, fazla kısımları temizliyorum.Embriyolarla birlikte uterus burada yer alıyor. Diseksiyon medyumum olarak PBS, %0,6 glikoz ve penisilin streptomisin kullanıyorum. Kanı temizlemek için öncelikle embriyoları diseksiyon medyumunda durulayacağım.Böylece diseksiyonum temiz oldu. Şimdi, embriyoları açığa çıkarmak için uterusun, yağ dokusunun karşı tarafındaki uzunluğu boyunca keseceğim. Yağ dokusu nerede?Göremediğiniz için diğer tarafta kalıyor. Burada açıkta kalmış bir embriyo var. Bunun mikroskop altında nasıl göründüğünü size gösterebilirim.Mikroskop altındaki görünüm şu şekildedir. Rahimle olan bu sınırı boyunca keseceğim. Karşı taraf ise yağ dokusudur.Buradaki yağları görebilirsiniz, yağı gerçekten görebiliyorum. Bu yüzden, tüm uzunluk boyunca yukarıdan aşağıya doğru keseceğim. Rahim boyunca aşağıya doğru ilerledikçe embriyoların dışarı çıkacağını görebilirsiniz.Biraz daha kuzeye. Ah, işte bir tane var. Muhteşem. Yani, yağlı embriyoların hemen dışarı çıktığı karşı taraftan kesiyorsunuz.Evet, hepsi öyle. Burada, bazen geri dönüp kaçırdığınız bir şeyi tekrar açmanız gereken birkaç nokta var. Şurası amniyon mu yoksa korion mu, işte burası korion.Amniyon, embriyonun içindedir ve onunla yakından ilişkilidir. Bakın, amniyonu buradan pek göremezsiniz. Embriyoyu çıkardığımda, bunların daha küçük olduğunu ve bunları kullanmayacağımı söyleyebilirim.Böylece tüm embriyolar açığa çıkmış oldu. Artık embriyolar burada açık durumda. Embriyonun üzerindeki katmanları soyacağım ve ardından hassas diseksiyon için embriyoyu temiz bir kaba aktaracağım.İşte ilk katman burada. Bunu çıkardığımda genellikle göbek kordonunu ararım. Bu oldukça sert bir dokudur.Ve aslında hayvanı göbek kordonundan kaldırabiliyorum. İşte tam burada. Onu gösterebilir misiniz?Evet, tam orada. Şuna bakın, evet, kırmızı damara, şu küçük şeye. Evet. Bu göbek kordonudur, abdomene bağlanır ve ben genellikle içeriye ulaşıp onu tutarım.Tamamdır. Şimdi embriyonun başındaki deriyi çıkaracağım. Bu işlem, hücreleri toplayacağım bölge olan serebral korteksi açığa çıkarıyor.Şimdi sol elimle, embriyonun arkasını delerek onu tam bu şekilde tutacağım. Onu plağın tabanına yaslayarak tutuyorum. Sağ elimle, forsepsle gözün altından, derinin altından girip orayı delerek deriyi yırtıp çıkaracağım.Böylece burada tutabileceğim bir kenara sahip oldum. Tamam. Ardından diğer dört adımımla karşıt kenarı tutup deriyi soyacağım ve genellikle altındaki mezenkim de beraberinde gelecektir. Böylece şu an sağ hemisferin açığa çıkmış olduğunu görebilirsiniz.Embriyoyu ters çevireceğim ve tutabileceğim başka bir kenar aramaya çalışacağım. İşte burada başka bir deri kenarı var. Onu ters çevirip soymaya devam edin.İşte oldu. Serebral korteksi açığa çıkarıyoruz. Şimdi, serebral korteksten parçalar almak için daha iyi bir konuma geçebilmek amacıyla başı basitçe koparacağım.Böylece pensle sıkıştırıp, altından diğer pensle ovarak doğrudan kesiyorum. İşte dorsal görünüm. Burada ön beynin dorsal görünümünü, serebral korteksin iki hemisferini, diensefalonu ve hemen burada orta beyni görebilirsiniz.Şimdi nöral kök hücre ilişkisi için parçaları alma aşamasındayız. Embriyoyu, şu şekilde sabit tutmak için sol forsepsimle kavrayacağım. Korteksten parçalar çıkarmak için uygun bir pozisyon ve açı belirleyelim.Şimdi ince makasımla girerek anterior serebral korteksi bu şekilde kesiyorum. Lateral kesimimi yapabilmek için bir delik açıyorum ve dorsal orta hatta yakın bir kesi yapıyorum, ancak korteksteki nöral öncülleri veya nöral öncülleri izole etmeye çalışırken orta hattaki hücrelerden kaçınıyorum. Böylece, serebral korteksten bir parça elde etmiş oluyoruz.Ve görebileceğiniz üzere, sağ tarafta bir kalınlaşma mevcut. Burası aslında lateral GIC çıkıntısının başlangıcıdır ve dorsal korteksteki öncüllerle ilgilendiğimiz için hazırlığımızda bunu istemiyoruz. Bu nedenle, burayı kesip çıkaracağım.Sizi sadece dorsal korteksteki hücrelerle baş başa bırakıyorum. Şimdi diğer tarafa geçeceğim. Aynı yöntemle.Sağ elini kullandığım için biraz daha zorlayıcı oluyor ancak yine de anterior kesiyi yapın ve makasınızı deliğe yerleştirin. Dorsal yan boyunca, lateral yan boyunca kesin. Bu kez gangliyonik kanıtların önüne geçmeye çalışacağım.İşte dorsal korteksin hemisferlerinden alınan iki parça. Şimdi, korteksleri, diğer yavruları diseke ederken bekleteceğim, içinde diseksiyon medyumu bulunan 15 ml'lik konik tüpe aktarmak için ucu kesilmiş bir P1000 pipet ucu kullanacağım. Şimdi bir parçayı çekiyorum.Şimdi korteksleri kaptan, diğer yavruları disseke ederken bekleyecekleri dissekleme medyası içeren 15 ml'lik konik tüpe aktarıyorum. Tüm batınla disseklemi tamamladım ve şimdi, az miktarda sıvı ve korteksler kalacak şekilde fazla dissekleme medyasını aspire edeceğim. Şimdi, yaklaşık 500 µL Trypsin ve EDTA ekleyerek tüpü 20 dakika boyunca 37 °C'lik su banyosuna yerleştireceğim.20 dakikalık inkübasyonun ardından, 500 µL soya fasulyesi trypan inhibitörü ekliyorum. Şimdi, çok küçük ağızlı, alevle cilalanmış bir pastoral pipet kullanarak hücreleri mekanik olarak ayıracağım veya disosiye edeceğim. Çok fazla hava kabarcığı oluşturmak istemiyorum, ancak oluşturursanız bu da sorun değildir.Yaklaşık beş ila 10 kez aşağı yukarı hareket ettirin; hücreler bir bulut şeklinde dağılmalıdır. Şimdi hücreleri 1000 RPM'de, 25 derecede bir dakika boyunca santrifüj edeceğim. Santrifüj işleminden sonra, zar zor görünen küçük bir pelet bırakacak şekilde fazla sıvıyı aspirasyonla uzaklaştıracağım.Bu konik tüpün alt kısmında küçük bir SA yayılması var gibi görünüyor. Pellet'i aspire etmemeye çok dikkat ederek, sadece az miktarda sıvı olduğunu düşünüyorum. Açıkçası, şu an pellet'e yıkama solüsyonu ekliyorum.Tamam, bin RPM'de, 25 derecede bir dakika daha santrifüjle. Yine, aspirasyon sonrası sadece hücre peleti ve çok az miktarda sıvı kalacak şekilde fazla sıvıyı aspire edeceğim. Ardından büyüme faktörleri içeren istediğim büyüme ortamını ekleyeceğim.Kültür deneyine özel olarak, ekleyeceğim hacim, kaç adet embriyoyu ve hangi yaşta disseke ettiğime bağlıdır. Bu nedenle, genellikle tüm E 12,5 embriyo batınları için yaklaşık 700 µL'ye kadar ekleme yapabilirsiniz. Hücrelerimi biraz daha konsantre etmek için buna yaklaşık 300 µL ekleyeceğim. Lamin kaplı plağımı inkübatörden çıkarıyorum.En az dört saat geçti. Şimdi lamine medyumu aspire edeceğim. Ardından büyüme medyumumla bir durulama yapacağım.Yaklaşık 300 µL ile durulama yapıyorum; ardından sıvıyı aspire edip 400 µL büyüme medyumu ekleyeceğim. Hema sitometre kullanarak hücrelerimi saydım ve bu 24 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa yaklaşık 100.000 hücre ekeceğim.Her deney, kuyuk başına farklı sayıda hücre gerektirir. Benim özel analizim için 100,000 hücre yeterli olmuştur. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 değerlerindeki doku kültürü inkübatörüne yerleştirip yaklaşık bir gün boyunca kültüre edeceğim.Lamineye yapışacaklar ve 24 saat sonra yayılacaklardır. Kendi özel analizim için istediğim büyüme faktörlerini ekleyeceğim.

culture-of-mouse-neural-stem-cell-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada fare epidermal nöral krest kök hücreleri (EPI-NCSC) izole etmek için yöntem gösteriyor. Tekniği içerir mikro diseksiyon, bıyık kıl follikülleri, şişlik izole ve doku kültürü içine placeing. 4 gün - 3 gün içinde EPI-NCSC alt tabaka üzerine çıkıntı eksplantlar göç etmeye başlar.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

Bu video protokolü, embriyonik gün 14-fare beyninde ganglion eminences nöral kök hücrelerin izolasyonu ve genişleme için neurosphere testinin uygulama göstermektedir.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC'ler) nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) in vitro olarak üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. mESC'ler, embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra yapışık bir kültürde retinoik asit tedavisi yoluyla NPC'lere farklılaşmaya yönlendirilir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Erişkin nöral kök hücrelerin (aNSC'ler) genişletilmesi için kültür sistemlerinin kurulması, aNSC'lerin tedavi için incelenmesine ve uygulanmasına olanak sağlar. Subkallozal bölge (SCZ) son zamanlarda yetişkin farelerde yeni bir nöroblast oluşturan bölge olarak kabul edilmiştir. Burada, SCZ-aNSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Keşfedin fare embriyo korteksinden nöral kök hücre öncüleri izolasyon yöntemini. Laminin kaplama, doku diseksiyonu ve hücre kültürü teknikleriyle güvenilir bir protokol sunar.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Daha fazla video keşfet