HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae

Bu prosedürün genel amacı, diploid tomurcuklanan maya hücrelerinde tek sarmallı diz çökme ile translokasyon oluşumunun genetik kontrolünü belirlemektir. Bu, önce kültürlerin belirli bir genotipe sahip tek kolonilerle aşılanması ve gece boyunca büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, kültürlere galaktoz ilavesi ile iki kromozom üzerinde ho endonükleaz ile eş zamanlı çift iplikçik kırılması oluşumunu indüklemektir.

Bu kültürlerin daha sonra seyreltilmesi, seçici ve seçici olmayan ortamlara kaplanır. Son adım, seçici ve seçici olmayan ortamlarda ortaya çıkan kolonileri sayarak translokasyon sıklığını belirlemektir. Sonuç olarak, farklı genotiplere sahip suşlarda ho ile uyarılmış translokasyon oluşumunun sıklığındaki değişiklikler yoluyla diz çökme olan tek iplikçik ile translokasyon oluşumunun genetik kontrolünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin etkileri, kanser hastalarının terapötik radyasyona maruz kalmasının sonuçlarına doğru uzanır, çünkü DNA çift iplikçik kırılmaları ve translokasyon oluşumu bu tedavi tedavisinin birincil sonuçlarıdır. Ho ile uyarılmış translokasyon frekanslarını belirleme prosedürüne başlamak için, 10 ila 20 bağımsız bir mililitre Y tepe gliserol laktat ortamı kültürünü istenen genotipin tek kolonileri ile aşılayın, kültürleri bir döndürücü üzerinde 30 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Kültürler istenen hücre yoğunluğuna ulaştığında, kültürlere %2'lik bir nihai konsantrasyona %20 galaktoz ekleyin. Galaktoz, kromozom üç üzerindeki geçmiş delta beş prim alelinde çift iplikçik kırılmalarını yönlendirecek olan ho endonükleazın ekspresyonunu indükleyecektir ve kromozom 15 üzerinde üç delta üç prim aleli vardır, bir döndürücü üzerinde 30 santigrat derecede dört saat inkübe edilir.

Bir sonraki adım, prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Kültürlerin dikkatli bir şekilde seyreltilmesi ve kaplanması zorunludur. Farklı genotipteki suşlar arasında istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalara izin vermek için yeterince tekrarlanabilir translokasyon frekansları elde edecek olsaydınız: Dört saat sonra, kültürlerin histidin içermeyen ortama ve ayrıca YPD td'ye uygun şekilde seyreltilmesi, plaka başına yaklaşık 100 ila 200 koloni, plakaları iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Koloniler ortaya çıktığında, translokasyon sıklığı belirlenebilir. Ho endonükleaz ekspresyonunun indüksiyonundan önce ve sonra kaplama verimlilikleri, her iki translokasyon kromozomunun varlığının veya yokluğunun DSB oluşumundan kurtulma yeteneğini etkileyip etkilemediğini gösterecektir. Bu, indüksiyon öncesi kaplama verimliliklerini belirlemek için hem kromozom üçünün hem de kromozom 15'in bir kopyasını parçalar.

İlk olarak, her gece kültüründen bir hücre alikotu çıkarın ve bir hemo sitometre ile sayarak hücre sayısını belirleyin. Daha sonra, koloniler ortaya çıkana kadar 30 santigrat derecede iki ila üç gün boyunca inkübe etmek için yaklaşık 100 ila 200 hücreyi YPD inkübe etmek için uygun bir seyreltme kullanın. Kalan kültürlere% 2'lik bir nihai konsantrasyona% 20 galaktoz ekleyin ve% 2'lik bir indüksiyon sonrası kaplama verimliliğini belirlemek için dört saat boyunca 30 santigrat derece inkübe edin.

Dört saatlik indüksiyondan sonra her kültürden bir hücre alikotunu çıkarın ve hemo sitometre ile hücre sayısını belirleyin: YPD üzerine uygun bir seyreltme kullanarak yaklaşık 100 ila 200 hücre sayın ve koloniler ortaya çıkana kadar 30 santigrat derecede iki ila üç gün inkübe edin. Plakalar üzerinde koloniler ortaya çıktığında, kaplama verimliliği belirlenebilir. Varsayılan translokasyon taşıyan klonlar southern blot ile incelenebilir.

Bu prosedür, her bağımsız denemeden tek bir tıslama artı rekombinant koloniden hazırlanan genomik DNA'yı kullanır, her DNA örneğinin yaklaşık dört mikrogramını BAM H ile sindirir, bir kısıtlama endonükleaz ayırır, ayrı BAM H, bir sindirilmiş fragmanları %0.7'lik bir aros she üzerinde sindirir ve daha sonra pozitif yüklü bir naylon membrana aktarır: 1.8 KİLOBAZ BMH, bir BMH, HIS içeren bir genomik klon ile rastgele hazırlama yoluyla elde edilen P 32 işaretli bir prob ile hibritlenmiştir. üç gen. DNA parçalarını oto radyografi veya fosfo görüntüleme ile görselleştirin. Varsayılan translokasyon taşıyan klonları incelemenin bir başka yolu da kromozom grafiği analizidir.

Kromozomlar ilk olarak, seçilen tıslama artı aros tıkaçlarındaki rekombinantlardan, ayrı kromozomlardan, kontur kenetlenmiş homojen bir elektrik alanında %1'lik bir aros jeli üzerinde veya 14 santigrat derecede şeften hazırlanır. Aşağıdaki parametreler kullanılır: birinci blok 14 santigrat derece, 72. anahtarlama süresi ve altı volt santimetrede 15 saat, ikinci blok, 14 santigrat derece, 122. anahtarlama süresi ve santimetre başına altı voltta 11 saat. Elektroforezin tamamlanmasının ardından, jeli 30 dakika boyunca AUM bromür ile boyayarak, ardından UV ile ışınlayarak ve damıtılmış su ile kromozomları kılcal hareket ile pozitif yüklü bir zara alıkoyarak ve damıtarak kromozomları görselleştirin.

Denatüre etme koşulları, tıslama içeren 1.8 kilobaz bam H, bir bam H, bir genomik klon ile rastgele hazırlama ile elde edilen P 32 etiketli prob ile hibritleşir. Üç gen, oto radyografi veya fosfo görüntüleme ile kromozomları görselleştirir. Kromozomal translokasyonların sıklığı, histamin fototrofik kolonilerinin sayısının, YPD üzerine kaplama yapılarak belirlenen toplam canlı hücre sayısına bölünmesiyle hesaplanabilir.

Bu örnekte, hesaplanan rekombinasyon frekansı yaklaşık% 3'tür. Ho ile uyarılmış translokasyon frekansları için test, tek iplikçik ile çift iplikçik kopmalarını onarma yeteneğindeki farklılıkları karşılaştırmak için farklı genotiplerin suşları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu temsili grafikte gösterildiği gibi bir diz çökme. RAD 51 delta null homozigot ile hem seçici hem de seçici olmayan translokasyon frekansları, hem indüksiyon öncesi hem de sonrası vahşi tip suş ile karşılık gelen koşullar kullanılarak elde edilenlerden istatistiksel olarak farklıydı.

Verimlilikler, bu tabloda gösterildiği gibi, hemo sitometre sayısı ile belirlenen kültürdeki toplam canlı koloni oluşturan hücre sayısının, indüksiyon öncesi ve sonrası kaplama ile belirlenen kültürdeki toplam hücre gövdesi sayısına bölünmesiyle belirlenir. Yabani tip hücreler için verimlilikler önemli ölçüde farklı değildi, bu da her iki translokasyon kromozomunun varlığının veya yokluğunun hayatta kalma yeteneğini etkilemediğini düşündürmektedir. DSB oluşumu.

Varsayılan translokasyon taşıyan klonlar genomik southern blot analizi ile incelenebilir. Translokasyon oluşumundan önce ve sonra ilgili kromozomların grafiksel bir temsili burada gösterilmiştir. BAM H tarafından üretilen ilgili dizileri içeren kısıtlama fragmanlarının boyutları, ana ve rekombinant suşlardan genomik DNA'nın bir sindirimi ve 1.8 kilobaz BAM H ile hibridizasyon yoluyla lekeler üzerinde ortaya çıkar.

Üç genomik klonu, güney blot analizi için kilobaz çiftleri halinde listelenmiştir. Genomik DNA, BMH bir endonükleaz ile sindirilir ve 1.8 kilobaz olarak adlandırılan bir P 32'ye hibritlenir. Bu tanı parçalarını görselleştirmek için HIS üç sondası.

0.8 kilobaz HIS üç delta 201.7 kilobaz tıslama üç delta üç asal dört kilobaz T 3 15 5 kilobaz T 15 üç ve sekiz kilobaz tıslama üç delta beş asal parça. Şerit A, ana diploiddir. B şeridi bir tıslama artı karşılıklı olmayan translokasyon rekombinantıdır ve C şeridi bir his artı karşılıklı translokasyondur.

Rekombinant kromozomal BLO analizi, translokasyon taşıyan klonları incelemek için de kullanılabilir. Aros tıkaçlarında hazırlanan sağlam kromozomlar şef elektroforezi ile ayrılır ve jel bir iridyum bromür ile boyanır ve UV ışığı altında görüntülenir. Ayrılan kromozomlar daha sonra naylon haline getirilir ve P 32 etiketli 1.8 kilobaz ile hibritlenir.

1.1 megabaz bozulmamış kromozomu görselleştirmek için yaptığı üç probu; 15.8 megabaz T, 15 üç translokasyon kromozomu, 0.6 megabaz T, üç 15 translokasyon kromozomu ve 0.3 megabaz sağlam kromozom üç. Lane A, dağıtılan üst öğedir. Lane B, A his artı resiprokal olmayan translokasyon rekombinantıdır ve Lane C, his artı resiprokal translokasyon rekombinantıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, çoklu ho uyarımlı çift iplikçik kırılmalarını takiben translokasyon oluşum sıklığının nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.