ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

ODELAY'in genel amacı, yüksek verimli bir şekilde koloniler halinde büyüyen bireysel hücrelerin büyüme fenotiplerini ölçmektir. Bu yöntem, genetik bozulmaların ve ilaç etkileşimlerinin herhangi bir koloni oluşturan mikroorganizmanın büyüme fenotipleri üzerindeki etkileri gibi mikrobiyoloji, genetik ve sistem biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. ODELAY'in temel avantajı, araştırmacının çok sayıda birey arasındaki popülasyon heterojenliğini doğrudan gözlemlemesini ve ölçmesini sağlamasıdır.

Agar kalıbını monte etmeden önce akrilik kalıpları %70 etanol ile temizleyin ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Üç alt parça ve iki dik parça vardır. Agar kalıbının montajına başlamak için, alttaki üç parçayı alın ve bunları, iki özdeş parça üçüncü parçayı sandviç yapacak şekilde birleştirin.

Taban parçalarını her iki tarafa sıkıştırmak için iki küçük bağlayıcı klips kullanın. Lazer eğrisinin doğru şekilde konumlandırıldığından emin olarak dikmeleri kalıba yerleştirin. Kalıbın üzerine temizlenmiş ve kurutulmuş bir cam sürgü yerleştirin ve diğer tarafa ikinci bir cam sürgü yerleştirirken yerinde tutun.

Kelepçe düzeneği daha büyük bir bağlayıcı klipsle yapın. Her iki sürgüyü de daha büyük bağlayıcı klipslerle sıkıştırın, her bir üst bağlayıcı klipsin akrilik ile örtüşen cam sürgü ile temas halinde olduğundan emin olun. Monte edilmiş kalıbı erimiş agar ile doldurmadan önce, kalıbın iç tarafı boyunca yaklaşık 70 mikrolitre erimiş agar ortamı pipetleyerek kenarların kapatıldığından emin olun.

Erimiş agarı kalıbın kenarı boyunca yavaşça pipetleyerek kalıbı içinde hava kabarcıkları hapsetmeden doldurun. Kalıp doldurulduktan sonra, yaklaşık 23 santigrat derece ortam sıcaklığında 40-60 dakika soğumaya bırakın. Bir sonraki adım kalıp ayırmadır.

Alt bağlayıcı klipsi çıkararak başlayın. Daha sonra üç sandviç parçadan oluşan kalıbın alt kısmını çıkarın. Slaytları sıkıştırarak tutun ve ardından bağlayıcı klipsleri dikkatlice çıkarın.

Kalıbı, kalıbın mavi noktalı tarafı yukarı bakacak şekilde tezgah üstünün kenarına yerleştirin. Her iki başparmağınızı da akriliğin altına ve ilk parmakları üst tarafa kalıbın iç kenarına doğru yerleştirin ve kalıp ara parçasını alt kenarı etrafında döndürüyormuş gibi başparmaklarla kalıba doğru yavaşça ve dikkatlice yukarı doğru itin. Sürekli ama yavaş yavaş artan basınç uygulayın.

Üst camın kalıp ara parçasını kapladığı bir çizgi boyunca bir kırılma ve bir hava kabarcığı görünmelidir. İlk kırılma çizgisini gördükten sonra, her iki başparmağınızla yukarı itmeye devam edin ve sabit baskı uygulayın. Agar camdan ayrılmaya başlamalıdır.

Kalıbı yukarı doğru döndürmeye devam edin. Cam tamamen serbest kaldıkça, onu tutun ve kalıptan tamamen çıkarın. Ardından, agarı hareket ettirmeden parçayı serbest bırakmak için benzer bir hareket kullanarak diğer kalıp parçasını çıkarın.

Slaytları, altında biraz steril yüksek saflıkta su bulunan steril bir uç kutusuna yerleştirin. Kutuyu kapatın ve ertesi gün kullanmak üzere gece boyunca 4 santigrat derecede saklayın. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi 96 oyuklu bir plakada suşları hazırlayarak başlayın.

Her kültürün 600 nanometresindeki optik yoğunluğu ölçmek için bir plaka okuyucu kullanma. Daha sonra, plakadaki kültürleri 600 nanometrede yaklaşık 0.1'lik bir optik yoğunluğa seyreltmek için otomatik bir seyreltme protokolü kullanın. Seyreltme programı ayarlandıktan sonra, plakaları, tüpleri ve uçları, güverte düzeninde belirtildiği gibi sıvı taşıma robotunun güvertesine yükleyin.

Seyreltme programını çalıştırmak için oynat düğmesine tıklayın. Doğru sayıda 50 mikrolitrelik uç ve doğru sayıda 300 mikrolitrelik uç seçin. Seyreltme tamamlandığında, seyreltme plakasını robottan çıkarın ve plakanın beş ila altı saat kurumasını önlemek için nemi koruyarak plakayı 30 santigrat derecede kültürleyin.

Kültür plakasının inkübasyonu tamamlanmadan yaklaşık bir ila iki saat önce, mikroskop için inkübasyon odalarını açın ve 30 santigrat derecede dengelenmelerine izin verin. Aynı otomatik seyreltme protokolünü kullanarak kültürü ikinci kez 600 nanometrede 0.01 ila 0.02 optik yoğunluğa seyreltin. Seyreltme plakasını metal bir dondurucu contası ile örtün ve plaka buzlu suda yüzerken 30 saniye boyunca bir buz banyosunda sonikat yapın.

Dört adet 96 kuyulu düz tabanlı plakayı bir, iki, üç ve dört olarak etiketleyin. Her sonikasyonlu kültürün 150 mikrolitresini bu deseni takip ederek seyreltme plakasından düz tabanlı plakalara aktarın. A1'den D6'ya kadar olan kuyular, Birinci Plakanın C4 ila F9 kuyularına.

A7'den D12'ye kadar olan kuyular, İkinci Plaka'nın C4 ila F9 kuyularına. E1'den H6'ya kadar olan kuyular, Üçüncü Levha'nın C4 ila F9 kuyularına. Ve E7'den H12'ye kadar olan kuyular, Plaka Dört'ün C4 ila F9 kuyularına.

Bu işleme başlamak için, agaroz sürgüsünü sürgü haznesine doğru şekilde yerleştirin. Daha sonra, 96 kuyu düz tabanlı plakayı kadran sırasına göre masanın üzerine yerleştirin. Plakalar Bir, İki, Üç ve Dört, soldan sağa.

Uçları, her bir uç kutusunun iç 24 kuyusu uçlarla dolu olacak şekilde dört boş uç kutusuna yerleştirin. Beşinci bir kutuya, bir ucu C10 konumuna ve uçları A1, A12, H1 ve H12 konumlarında kesilmiş olacak şekilde yerleştirin. Bu dört kesilmiş uç, uç plakası kelepçesi için stabilite sağlayacaktır.

Daha sonra orijin koordinatını hizalamak için kullanılacak agarozda bir delik açmak için ilk uç zımbasını robot kontrol tespit programının başlangıç yerine yerleştirin. İlk çeyreği tespit etmek için Plaka Bir'i sıvı işleme robotunun üzerine yerleştirin. Kapağı çıkarın ve lekeleme programına devam edin.

Tüm noktaların mevcut olduğundan emin olmak için kontrol edin. Kullanılmış uçları biyolojik tehlike kabına boşaltın ve robotun üzerine yeni uçlar yerleştirin. Lekelerin yaklaşık bir milimetre çapında kuruması için yaklaşık 30 saniye bekleyin ve ardından programa devam edin.

Birinci Plakayı İkinci Plaka ile değiştirin ve tespit programına devam edin. Dört kadranın tümü tespit edildiğinde ve lekeler kuruduğunda, kayar hazne kapağını değiştirin ve cihazı ters çevirin. Kaydırma bölmesinin üst tarafına bir cam sürgü yerleştirin.

Önce slayt haznesini mikroskoba yükleyin. Hızlandırılmış mikroskopi, özel olarak tasarlanmış bir komut dosyası çalıştırılarak gerçekleştirilir. İletilen ışık deklanşörünü açmak için deklanşöre ve ardından yüksek kamera hızını başlatmak için odak düğmesine tıklayın.

Go Origin'e tıklayın" ve agarda delinen orijin işaretini bulmak için sahneyi hareket ettirin, ardından E7 alanında tespit edilen hücrelere odaklanmak için hafifçe sağa hareket edin. Başlangıç zımbasına geri dönün ve görüş alanında ortalayın. Ayarla" düğmesine basarak orijini bu değere ayarlayın. H18 konumuna gidin ve bu konuma en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklanın.

Ardından L7 konumuna geçin ve bu konuma en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklanın. Son olarak, E7 konumuna gidin ve bu konuma en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklanın. Merkezdeki ve kenarlardaki odağı kontrol edin: E12, H12 ve L12 noktaları, z değeriyle gösterilen odak z değerleri otomatik netleme aralığının artı veya eksisinden büyükse otomatik netleme aralığını ayarlayın.

Sıfırla" düğmesine basın ve ardından ODELAY'e basın. Verilerin kaydedileceği dizini seçin. Mikroskop 48 saat boyunca veya program kapanana kadar veri toplayacaktır.

Bu temsili hızlandırılmış görüntüler, lekelenmeden sonra sıfır saat, üç saat, altı saat ve dokuz saat olarak katı ortamda büyüyen maya hücrelerini gösterir. Burada, timelapse görüntüleri işlendikten sonra iki maya türünü karşılaştıran temsili bir veri seti gösterilmektedir. Nispeten tekdüze ikiye katlama süreleri, iyi hazırlanmış agaroz slaytını yansıtır, ancak gecikme süreleri, optimum olmayan otomatik odaklama ayarları nedeniyle önemli ölçüde değişir.

Burada, tüm ikiye katlama sürelerinin iyi bir şekilde örtüştüğü ve gecikme sürelerinin tutarlı göründüğü daha tutarlı bir veri seti gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, ODELAY'in kurulumu, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse üç ila dört saat içinde yapılabilir. Tekrarlanabilir ODELAY ölçümleri için en kritik adımlar, ortamın tutarlı bir şekilde hazırlanması ve kızakları ayırırken ortamın mekanik olarak deforme edilmesinden kaçınmaktır.

ODELAY çok hassas bir testtir. Örneğin, yaygın olarak kullanılan nokta bazlı tahlillerin bir büyüme kusurunu ortaya çıkarmak için mayanın 37 santigrat derecede kültürlenmesini gerektirdiği oda sıcaklığında sıcaklığa duyarlı maya suşlarındaki büyüme kusurlarını gözlemleyebilir. ODELAY mayada geliştirilmiş olsa da, yöntem, mikroorganizmaların davranışlarını anlamak için çok çeşitli çevresel ve genetik koşulları keşfetmek için patojenler de dahil olmak üzere koloni oluşturan herhangi bir organizmaya uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, katı ortamlarda koloniler oluşturan tek hücreli mikroorganizmaların büyüme fenotiplerini ölçmek için ODELAY'in nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Mikroorganizmalarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve çalışılan organizmalara uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.