ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

ODELAY'in genel amacı, koloni oluşturan tekil hücrelerin büyüme fenotiplerini yüksek verimli bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem; genetik perturbasyonların ve ilaç etkileşimlerinin, koloni oluşturan herhangi bir mikroorganizmanın büyüme fenotipleri üzerindeki etkileri gibi mikrobiyoloji, genetik ve sistem biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. ODELAY'in temel avantajı, araştırmacının çok sayıda birey arasındaki popülasyon heterojenliğini doğrudan gözlemlemesine ve nicelleştirmesine olanak tanımasıdır.

Agar kalıbını birleştirmeden önce akrilik kalıpları %70 etanol ile temizleyin ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Üç adet alt parça ve iki adet dik parça bulunmaktadır. Agar kalıbının montajına başlamak için üç alt parçayı, iki özdeş parça üçüncü parçayı sandviç şeklinde kavrayacak şekilde birleştirin.

Alt parçaları her iki yandan sabitlemek için iki küçük ataşlı klips kullanın. Lazer eğrisinin doğru konumlandırıldığından emin olarak dikmeleri kalıba yerleştirin. Kalıbın üzerine temizlenmiş ve kurutulmuş bir lam yerleştirin ve diğer tarafa ikinci bir lam yerleştirirken bunu sabit tutun.

Düzeneyi daha büyük bir binder klips ile sabitleyin. Her bir üst binder klipsin akriliği örtecek şekilde lam ile temas ettiğinden emin olarak her iki lamı da daha büyük binder klipslerle sıkıştırın. Montajı tamamlanmış kalıbı erimiş agar ile doldurmadan önce, kalıbın iç kenarları boyunca yaklaşık 70 µL erimiş agar besiyeri pipetleyerek kenarların mühürlendiğinden emin olun.

Erimiş agarı kalıbın kenarı boyunca yavaşça pipetleyerek, içeride hava kabarcıkları kalmayacak şekilde kalıbı doldurun. Kalıbı doldurduktan sonra, yaklaşık 23 °C ortam sıcaklığında 40-60 dakika boyunca soğumaya bırakın. Bir sonraki adım kalıbın ayrılmasıdır.

Alt kısımda bulunan bağlayıcı klipsi çıkararak başlayın. Ardından, üç katmanlı parçadan oluşan kalıbın alt kısmını çıkarın. Lamları sıkıştırarak tutun ve ardından bağlayıcı klipsleri dikkatlice çıkarın.

Mavi noktanın bulunduğu taraf yukarı bakacak şekilde kalıbı tezgahın kenarına yerleştirin. Her iki başparmağınızı akriliğin altına, işaret parmaklarınızı ise kalıbın iç kenarına doğru üst kısma yerleştirin ve kalıp ara parçası alt kenarı etrafında döndürülüyormuş gibi başparmaklarınızla kalıba karşı yavaşça ve dikkatlice yukarı doğru itin. Sabit ancak yavaşça artan bir basınç uygulayın.

Kalıp ara parçasına temas eden üst cam boyunca bir kırılma ve bir hava kabarcığı oluşmalıdır. İlk kırılma hattı görüldükten sonra, her iki başparmağınızla yukarı doğru itmeye devam edin ve sabit bir basınç uygulayın. Agar, camdan ayrılmaya başlamalıdır.

Kalıbı yukarıya doğru döndürmeye devam edin. Cam tamamen serbest kaldığında, onu tutun ve kalıptan tamamen çıkarın. Ardından, agarı hareket ettirmeden parçayı kaldırmak için benzer bir hareketle diğer kalıp parçasını çıkarın.

Slaytları, tabanında bir miktar steril yüksek saflıkta su bulunan steril bir uç kutusuna yerleştirin. Kutuyu kapatın ve ertesi gün kullanmak üzere gece boyunca 4 °C'de saklayın. Bu prosedüre, suşları metin protokolünde açıklandığı şekilde 96 kuyucuklu bir plakada hazırlayarak başlayın.

Her bir kültürün 600 nanometredeki optik yoğunluğunu ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Ardından, plakadaki kültürleri 600 nanometrede yaklaşık 0,1 optik yoğunluğa getirmek için otomatik bir seyreltme protokolü uygulayın. Seyreltme programı kurulduktan sonra; plakaları, tüpleri ve uçları, dek düzeninde belirtildiği şekilde sıvı taşıma robotunun dek yüzeyine yerleştirin.

Seyreltme programını çalıştırmak için oynat düğmesine tıklayın. Doğru sayıda 50 µL uç ve doğru sayıda 300 µL uç seçin. Seyreltme işlemi tamamlandığında, seyreltme plakasını robottan çıkarın ve plakanın kurumasını önlemek için nemi koruyarak 30 °C'de beş ila altı saat boyunca kültüre edin.

Kültür plakasının inkübasyonu tamamlanmadan yaklaşık bir ila iki saat önce, mikroskobun inkübasyon odalarını açın ve 30 °C'de dengeye gelmelerini sağlayın. Aynı otomatik dilüsyon protokolünü kullanarak kültürü, 600 nm'de 0,01 ila 0,02 optik yoğunluğa gelecek şekilde ikinci kez dilüe edin. Dilüsyon plakasının üzerini metal bir dondurucu sızdırmazlık kapağıyla kapatın ve plaka buzlu suyun üzerinde yüzerken, buz banyosunda 30 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.

Dört adet 96 kuyucuklu düz tabanlı plakayı bir, iki, üç ve dört şeklinde etiketleyin. Dilüsyon plakasındaki sonikasyon uygulanmış her bir kültürden 150 µL'yi şu düzene göre düz tabanlı plakalara aktarın: Kuyucuk A1'den D6'ya kadar olanları, Birinci Plaka'nın C4'ten F9'a kadar olan kuyucuklarına aktarın.

A7 ile D12 arasındaki kuyucukları İkinci Plakanın C4 ile F9 arasındaki kuyucuklarına. E1 ile H6 arasındaki kuyucukları Üçüncü Plakanın C4 ile F9 arasındaki kuyucuklarına. Ve E7 ile H12 arasındaki kuyucukları Dördüncü Plakanın C4 ile F9 arasındaki kuyucuklarına aktarın.

Bu prosedüre başlamak için agaroz lamı lam haznesine doğru şekilde yerleştirin. Ardından, 96 kuyucuklu düz tabanlı plakaları tablo üzerine kadran sırasına göre yerleştirin. Soldan sağa doğru Bir, İki, Üç ve Dört numaralı plakalar.

Dört boş pipet ucu kutusuna, her kutunun içteki 24 kuyucuğu dolu olacak şekilde uçları yerleştirin. Beşinci bir kutuda, C10 konumuna bir uç ve A1, A12, H1 ve H12 konumlarına uçları kesilmiş uçlar yerleştirin. Bu dört kesik uç, uç plakası kelepçesi için stabilite sağlayacaktır.

Başlangıç koordinatını hizalamak için daha sonra kullanılacak olan agarozda bir delik açmak amacıyla, ilk uç zımbasını robot kontrol spotlama programının başlangıç noktasına yerleştirin. İlk kuadrantı spotlamak için Plaka Bir'i sıvı taşıma robotuna yerleştirin. Kapağı çıkarın ve spotlama programına devam edin.

Tüm lekelerin mevcut olduğundan emin olun. Kullanılan uçları biyotehlike konteynerine boşaltın ve robota yeni uçlar yerleştirin. Lekelerin yaklaşık bir milimetre çapına gelene kadar kuruması için yaklaşık 30 saniye bekleyin ve ardından programa devam edin.

Birinci Plakayı İkinci Plaka ile değiştirin ve damlatma programına devam edin. Dört kadranın tamamına damlatma yapıldığında ve damlalar kuruduğunda, lam odası kapağını tekrar takın ve düzeneği ters çevirin. Lam odasının üst tarafına bir cam lam yerleştirin.

Öncelikle lam odasını mikroskoba yerleştirin. Zaman ayarlı mikroskopi, özel olarak tasarlanmış bir betik çalıştırılarak gerçekleştirilir. Geçirgen ışık panjuru açmak için panjura, ardından yüksek kamera hızını başlatmak için odak düğmesine tıklayın.

"Go Origin" seçeneğine tıklayın ve agar üzerine delinmiş olan başlangıç işaretini bulmak için sahneyi hareket ettirin; ardından E7 alanına damlatılmış hücrelere odaklanmak için hafifçe sağa kaydırın. Başlangıç deliğine geri dönün ve bunu görüş alanının merkezine getirin. "Set" butonuna basarak başlangıcı bu değere ayarlayın. H18 konumuna gidin ve bu konuma en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklama yapın.

Ardından L7 konumuna gidin ve bu konuma en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklama yapın. Son olarak E7 konumuna gidin ve bu konuma en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklama yapın. Merkezdeki ve E12, H12 ve L12 noktalarındaki kenarlardaki odağı kontrol edin; z değeriyle belirtilen odak z değerleri, otomatik odaklama aralığının artı veya eksi değerinden büyükse otomatik odaklama aralığını ayarlayın.

"Reset" düğmesine ve ardından ODELAY'e basın. Verileri kaydetmek için dizini seçin. Mikroskop, 48 saat boyunca veya program kapatılana kadar veri toplayacaktır.

Bu temsili hızlandırılmış çekim görüntüleri, damlatma işleminden sonraki sıfırıncı saat, üçüncü saat, altıncı saat ve dokuzuncu saatlerde katı besiyerinde büyüyen maya hücrelerini göstermektedir. Burada, hızlandırılmış çekim görüntüleri işlendikten sonra iki maya suşunu karşılaştıran temsili bir veri seti sunulmuştur. Nispeten düzenli iki katına çıkma süreleri, iyi hazırlanmış agaroz lamı yansıtmaktadır; ancak lag süreleri, optimal olmayan otomatik odaklama ayarları nedeniyle önemli ölçüde farklılık göstermektedir.

Tüm iki katlanma sürelerinin birbiriyle örtüştüğü ve gecikme sürelerinin tutarlı göründüğü daha tutarlı bir veri seti burada gösterilmektedir. Uzmanlaşıldığında, ODELAY kurulumu uygun şekilde gerçekleştirilirse üç ila dört saat içinde tamamlanabilir. Tekrarlanabilir ODELAY ölçümleri için en kritik adımlar, besiyerinin tutarlı bir şekilde hazırlanması ve lamlar ayrılırken besiyerinin mekanik olarak deforme edilmesinin önlenmesidir.

ODELAY oldukça hassas bir analizdir. Örneğin; yaygın olarak kullanılan nokta tabanlı analizlerin büyüme kusurunu ortaya çıkarmak için mayanın 37 santigrat derecede kültüre edilmesini gerektirdiği durumlarda, ODELAY oda sıcaklığındaki sıcaklık duyarlı maya suşlarındaki büyüme kusurlarını gözlemleyebilir. ODELAY mayada geliştirilmiş olsa da, bu yöntem, mikroorganizmaların davranışlarını anlamak için geniş bir çevresel ve genetik koşullar yelpazesini araştırmak amacıyla patojenler dahil koloni oluşturan tüm organizmalar için uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, katı besiyerlerinde koloni oluşturan tek hücreli mikroorganizmaların büyüme fenotiplerini ölçmek için ODELAY yönteminin nasıl uygulanacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Mikroorganizmalarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve çalışılan organizmalara uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.