T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein komplekslerinin genel şeklini belirlemektir. Bu, protein kompleksi iyonları için kütle spektrometresi demir hareketlilik verilerinin elde edilmesi ve her bir şarj durumunun sapma süresi değerlerinin ölçülmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, doğal protein yapılarının hareketlilik ölçümlerini sağlamak için deney koşulları doğrulanır.

Daha sonra, ölçülen sapma süresi değerleri enine kesit alanları ile ilişkilendirilir. Sonuçlar, bilinmeyen üç boyutlu yapılara sahip proteinlerin veya protein komplekslerinin çarpışma kesit değerlerini belirler. Bu bilgiler, genel şekilleri, alt birim ambalajları ve topolojileri hakkında ipuçları sağlar.

Merhaba, ben Wiseman Bilimler Enstitüsü Biyolojik Kimya Bölümü, Mic Laboratuvarı'ndan Isaac Leski ve yine mi laboratuvarından Naam Kirschenbaum. Bugün, hibrit kütle spektrometresi ve demir hareketlilik enstrümanlarını kullanarak çarpışma kesitsel protein komplekslerini ölçme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, protein komplekslerinin genel şeklini ve ary organizasyonunu incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedür, demir hareketliliği, kütle spektrometresi veya protein komplekslerinin IMM MS analizine odaklanır. Numune hazırlama adımları, cihaz kalibrasyonu ve MS ve tandem MS optimizasyon prosedürleri, ilgili bir JO protokolünde gösterilmiştir.

Genel olarak, bu protokol, amonyum asetat gibi uçucu bir tamponda düşük mikromolar kompleks konsantrasyonlarını içerir. Nano akış başına bir ila iki mikrolitre tüketildiği göz önüne alındığında, MS koşullarının optimizasyonunu sağlamak için kılcal damar minimum hacim olarak 10 ila 20 mikrolitre hazırlayın. Bu prosedüre başlamak için, hareket eden dalgayı veya T dalgası sinap IMMS'yi, tri dalga ve basınçların hem IM hem de uçuş süresi için otomatik olarak ayarlandığı aşağıdaki çalışma hareketliliği modlarına ayarlayın: iyonların ayrılması, pozitif iyon alımı ve V modu, iyonların uçuş tüpü boyunca yolunu ayarlama ve buradaki tüm gazları yansıtma dönüşü.

Azot, IM ayırma için ve argon tuzak ve transfer bölgeleri için kullanılır. Önerilen başlangıç değerleri, IMS cihazı için dakikada 24 mililitre ve tuzak bölgesi için dakikada 1,5 mililitre gaz akışıdır. Ardından, bilinmeyen bir protein kompleksi için mast yük oranı toplama aralığını ayarlayın.

Başlangıçta geniş bir kütle aralığı kullanın, bu daha sonra istenen değerlere düşürülebilir, MS profilini buna göre ayarlayın. Büyük kompleksler için maksimum iletim verimliliği için, toplama kütlesi aralığı 1030 2000 MA şarj oranı ve MS profili otomatik olarak ayarlanmalıdır. Aksi takdirde, profil gösterilen tabloya göre ayarlanabilir.

RF ayarını kontrol edin ve gerekirse gösterildiği gibi büyük protein kompleksleri için uygun değerlere ayarlayın. Ardından, numuneyi yükleyin, kılcal voltaj ve düşük nano akış basıncı uygulayın. Püskürtmeler başladıktan sonra, nano akış basıncını minimum bir değere düşürmeye çalışın.

Ek olarak, kılcal damarın koniye göre konumunu ayarlayın, iyi çözülmüş MS Spektrumu elde etmek için MS edinim parametrelerini ayarlayın. Cihaz ve örnekleme konisi boyunca basınç gradyanını ve ayrıca ilgili JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ekstraksiyon konisi önyargı tuzağı ve transferinin potansiyel ayarlarını optimize edin. Bu parametreler örneğe bağlı olarak gösterilse de, peptitten protein komplekslerine kadar çeşitli demir kütlelerinin MS spektrumlarını elde etmek için kullanılan koşullar aşağıda verilmiştir.

Büyük iyonlar daha yüksek çarpışma enerjileri ve önyargı voltajı gerektirir. Kompleksin aktivasyonunu en aza indirmek için büyük protein komplekslerinin analizi için geri basıncın arttırılması da önerilir. Tepe noktasının konumunu değiştirmeden numune koni ekstraksiyonu, koni tuzağı ve önyargı voltajlarını yaklaşık 10 voltluk adımlarla kademeli olarak azaltmaya çalışın.

Optimum bir kütle spektrumu elde edildikten sonra, protein düzenekleri analiz edilirken sürüklenme süresi veya IM profili ayarlanmalıdır. Hem kütle hem de hareketlilik ölçümleri için en uygun koşullar genellikle uyumsuzdur. Bu nedenle, ikisi arasında uygun dengeyi kurmak önemlidir.

Genel olarak, demir hareketlilik grafiği, tepe noktaları tüm sürüklenme zaman aralığına dağıtılacak ve tepe profili pürüzsüz olacak şekilde optimize edilmelidir. Bir gian dağılımına yaklaşırken, önemli tepe asimetrisi, çoklu konformasyonların zayıf ayrılmasıyla ilişkili olabilir, T dalgası hızı, T dalgası yüksekliği ve IMS gaz akış hızı, hareketlilik ayrımını optimize etmek için ayarlanabilir. T dalgası hızının arttırılması, sürüklenme süresi dağılım profilini genişletir.

Artan T dalgası yükseklik değerleri onu daraltırken, benzer şekilde, dakikada minimum 10 mililitreden başlayan IMS gaz akışını artırmak, sürüklenme süresi profilini daha yüksek değerlere kaydırır, demir hareketlilik spektrumunu optimize etmek için çalışır. Üç değişkenden ikisini sabitleyerek ve üçüncüyü optimize ederek, T dalgası hızını saniyede 250 metreye ve gaz akışını dakikada 24 mililitreye ayarlayın. Daha sonra başlangıç noktası olarak yüksekliği üç volta ayarlayın ve kademeli olarak bir voltluk artışlarla artırın.

Yüksek öngerilim gerilimleri kullanıldığında, IMS gaz basıncının düşürülmesi ve bu şekilde öngerilim geriliminin düşürülmesi tavsiye edilir. Sonuç olarak, karmaşık aktivasyon ve ayrışma azalacaktır. Koşullar optimize edilmediğinde, sürüklenme süreleri spektrumunun ilk bölümünde ve kuyruk kenarında aynı tepe noktası olarak gözlemlendiğinde bir devrilme etkisi ortaya çıkabilir.

İyonlar IAM cihazından geçmediğinde, etkili bir şekilde yolculukları, bir sonraki demir paketin hareketlilik hücresine bırakılması için gereken süreden daha uzun sürebilir. Sonuç olarak, önceki paket itici bölgeye teslim edilmeden önce tuzak bölgesinden yeni bir iyon demeti salınır. Bu artefaktı ortadan kaldırmak için, T dalgası yüksekliğini artırın ve T dalgası hızını ve IMS basıncını azaltın.

Ek olarak, tuzak serbest bırakma süresi ayarlanabilir. Ayrıca, transfer T-dalgası yüksekliğinin en az beş volt olarak ayarlandığını doğrulamak önemlidir. Ayrıca iyonların IMS hücresine doğru sızmasını önlemek için.

Hareket kabiliyeti tuzağı yüksekliği maksimum seviyelerde tutulmalıdır. Transfer T dalgalarının düşük hızı ve yüksek genliği, sürüklenme süresi dağılım profilinin dalgalanmasına neden olabilir. Bu artefakt, pusha frekansı ile transfer T-dalgası hızı arasındaki kısmi senkronizasyon nedeniyle iyonların hareketlilik ayrımı transfer ve zorlu bölgeler boyunca sürdürülmediğinde meydana gelir.

Bu etkiyi ortadan kaldırmak için, itici süresi veya transfer T dalgası hızı ayarlanmalıdır. Pusha frekansı kütle aralığı ile ilgili olduğundan, bu artefakt yeniden ortaya çıkabilir. Bu parametre değiştirildiğinde.

T dalgası yüksekliği küçük bir etki yapar. Bununla birlikte, azaltılması dalgalanmaları ortadan kaldırmaya da yardımcı olabilir. Yukarıda belirtilen parametreler optimize edildikten sonra, yüksek düzeyde çözünürlük elde etmek için IMMS verileri elde edilebilir.

Ms. Peaks protein kompleksleri, artık su ve tampon bileşenlerinin sıyrılmasını teşvik etmek için genellikle kütle spektrometresi içinde aktive edilir. Bununla birlikte, aktivasyon enerjisi bir eşik değerin ötesine çıkarılırsa, doğal çözelti durumu yapısına karşılık gelmesi muhtemel olmayan birden fazla ara durum oluşturan kısmi açılma meydana gelebilir. Sonuç olarak, sürüklenme süresi zirvesi, katlanmamış yapıların hidrojenli popülasyonunu yansıtacak şekilde kaydırılabilir ve genişletilebilir.

Çözelti faz yapılarıyla tutarlı sapma süresi verilerini elde etmek için, IM ayrımından önce iyonları hızlandırmak için kullanılan voltajları dikkatli bir şekilde kontrol etmek önemlidir, bu nedenle, sürüklenme süresi spektrumu üzerindeki etkiyi izlerken kılcal ve koni voltajını kademeli olarak arttırmak önemlidir. Ayrıca, yüksek MS çözünürlüğü için, tuzak voltajı yerine transferin arttırılması tercih edilir. Önce IM cihazı, ardından transfer bölgesi ve TOF analizörü konumlandırılır.

Aktivasyon, IM ölçümünü takip ettiğinden, IM için etkilenmeden kalırken, MS doğruluğu, veri toplamanın kompleksin doğal yapısını koruyan koşullar altında gerçekleştirilmesini sağlamak için artırılabilirken, tek bir optimize edilmiş parametre kümesine bağlı kalmak yerine bir dizi deneysel ve çözüm koşulu üzerinden veri toplamak önemlidir. Bu nedenle, kondenstop çarpışma voltajını kademeli olarak artırın ve demir hareketlilik profili üzerindeki etkiyi izlerken 10 volt aralıklarla veri elde edin. Son olarak, katlanmamış onayları tanımlamak ve elde edilen verileri değerlendirmek için, numuneyi iki ila yedi pH aralığında asetik asit ile titre ederek protein kompleksinin ayrışmasını manuel olarak indükleyin ve verileri kaydedin, T dalgası IMS sistemindeki verileri analiz etmeye devam edin, bir sapma süresi kalibrasyon yaklaşımı ile tanımlanan kesit alanları, bilinen kesit değerlerine sahip Cain proteinleri kullanarak.

İlk olarak, her biri 10 mikromolar olan denatüre kalibreli protein çözeltileri hazırlayın. 49, 49 0.2 hacim oranında su metanol asetik asitte at sitokrom C atı, kalp miyoglobin ve sığır ubikitini kullanın. Ardından, hedef protein veya protein kompleksi için kullanılan tam olarak aynı cihaz koşulları altında kalibre proteinler için IMMS verilerini alın, IM ayırma ayarlarını korumak için tüm voltajları ve basınç değerlerini aynı tutun.

Verileri aldıktan sonra, her bir yük için deneysel sapma süresi değerini çıkarın. Cain proteinlerinin durumu, MOVZ'nin gözlemlenen iyonun ana yük oranı olduğu ve C'nin gelişmiş görev döngüsü EDC gecikme katsayısı olduğu aşağıdaki denklemi kullanarak kalibre sürüklenme zamanlarının T asal D'nin her birini düzeltir. Tipik olarak 1,4 ile 1,6 arasındaki değeri enstrümana bağlıdır.

EDC değeri, sistem içinde bir edinme ayarı, bir edinme kurulum sekmesi içinde gösterilir, hem demir yükü durumu hem de azaltılmış kütle için kalibre kesitlerinin her birini düzeltir. Omega C düzeltilmiş kesit olduğunda, omega literatür kesitidir, Z demir yüküdür. M durumu, kain iyonunun moleküler ağırlığıdır ve MG, demirin moleküler ağırlığıdır.

Tipik olarak T prime D'nin nitrojen plop thelan'ı omega C'nin thelan'ına karşı olan arka plan gazı.Elde edilen eğri aşağıdaki denkleme karşılık gelir. X ve A parametreleri, grafiği doğrusal bir ilişkiye uydurarak çıkarılabilir. X eğimi, üstel orantı faktörüne karşılık gelir ve A, belirlenen uyum sabitini temsil eder.

Uyum korelasyon katsayısı R karesini hesaplayın. R kare için kabul edilebilir değerler 0,95'ten büyüktür. Daha düşük bir korelasyon katsayısı değeri, proteinin tam açılmamasından, numunenin yaşlanmasından kaynaklanabilir.

Farklı kalibreli proteinler için kullanılan farklı deneysel koşullar, gürültülü spektrum ve verilerin eksik işlenmesi veya hesaplama hatası. Belirlenen üstel faktör X'i kullanarak ca sapma süresini düzeltin ve omega C'yi T asal D'ye karşı yeniden düzenleyerek hesaplamalarınızı doğrulayın. 0.95'ten daha yüksek değerler, daha önce açıklanan adımlara benzer şekilde beklenmelidir, hedef protein veya protein kompleksinin ölçülen sapma süresini düzeltin ve hesaplanan üstel faktör X'i kullanarak hedef protein veya protein kompleksinin sürüklenme süresini kalibre edin. Her deney koşulu için bu adımları tekrarlayın.

Bilinmeyen protein veya protein kompleksinin kesit alanını tanımlarken, her deneyin en az üç kez tekrarlanmasını ve çarpışma kesit değerleri belirlendikten sonra bu üçlü ölçümlerin standart sapmasının belirlenmesini öneririz. Kompleksin topolojik veya düzenlemelerini tahmin etmek için modelleme yaklaşımları kullanılır. Bu, deneysel çarpışma kesit değerlerinin, oluşturulan model yapılarından hesaplanan siliko Omega değerlerine genel olarak sığdırılmasıyla yapılır, bu alan hala ilk yıllarındadır ve bu yaklaşımı genel ve çok çeşitli komplekslere uygulanabilir hale getirmek için daha fazla geliştirme gerekmektedir.

Sığır hemoglobininin tetramerik formunun yüzey temsili burada gösterilmiştir. Oksijen taşıyıcı hemoglobin kompleksi, yukarıda belirtilen yaklaşım için bir örnek teşkil edebilir. Hemoglobin, alfa beta dimerlerinin bir dimerini oluşturan, sırasıyla mavi ve kırmızı renkli iki alfa ve iki beta alt biriminden oluşan tetramerik bir protein kompleksidir.

Hemoglobinin IMMS spektrumu burada gösterilmektedir. Kompleksin elde edilen IM ms spektrumu, alfa beta dimer ve alfa ve beta monomerik alt birimlerin kütlelerine uyan, bozulmamış kompleks ve minör yük serisine karşılık gelen bir majör yük serisi dağılımını ortaya çıkarır. Farklı hemoglobin formlarının teorik ve ölçülen CCS'si burada gösterilmektedir.

Omega değerlerini hesaplamak için dimerik ve tetramerik formların çeşitli yük durumları için alınan sürüklenme süresi değerleri kullanıldı. Bunlar teorik değerlerle karşılaştırıldı. Bir tetramerik kompleksin üç birleşme olasılığı olduğu göz önüne alındığında: ya döngüsel dihedral ya da zincir benzeri salmastralar.

Bir dimerden bir tetramere geçerken omegadaki artışı hesaplayarak, yapısal organizasyon tahmin edilebilir. Önceki çalışmalar ve kendi deneylerimiz, ölçülen ccss ile kristal yapılı verilerden elde edilen protein yüzey alanları arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Bu korelasyon, farklı paketleme formları için bir dimere kıyasla bir tetramerin yüzey alanında beklenen artışı hesaplamak için kullanılabilir.

Bu, her bir alt birim asferik nesne dikkate alınarak yapılır. Zincir benzeri bir montaj, tetramer CCS'yi yaklaşık iki kat artıracak, C, dört veya D iki salmastra ise sırasıyla yaklaşık 1.5 ve 1.67'lik bir artış sağlayacaktır. Hemoglobinin tetramerik ve DME formlarının ölçülen CCS değerleri arasında hesaplanan oran 1.57 artı veya eksi 0.03 idi.

Bu sayı, doğal yapının doğrusal olarak organize edilmediğini, ancak döngüsel veya dihedral tetramer olarak daha kompakt bir biçimde düzenlendiğini göstermektedir. Hemoglobinin çözülmüş kristal yapısı üzerinde aynı hesaplamayı tekrarlarken, tetramerik yüzey alanlarının DME formlarına oranı 1.63 idi, bu da D iki simetrisine uyuyor. Açıkçası, bu geometrik model basitleştirildi ve protein alt birimleri sadece küresel değil.

Bununla birlikte, bu hesaplama, IMMS'nin bilinmeyen yüksek çözünürlüklü yapılara sahip komplekslerin paketlenmesini ortaya çıkarmak için sahip olduğu heyecan verici potansiyeli göstermektedir. Az önce size protein ve protein komplekslerinin sürüklenme süresini nasıl ölçeceğinizi ve çarpışma kesit değerlerini nasıl hesaplayacağınızı gösterdim. Bu prosedürü yaparken, hedef protein veya protein kompleksleri için kullanılan aynı koşulları kullanarak kalibre proteinler için IMMS verilerini elde etmek önemlidir.

Ayrıca, bu deneylerin en az üç kez tekrarlanmasını ve bu üçlü ölçümlerin standart sapmasının belirlenmesini şiddetle tavsiye ederiz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.