Name: T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: Öğrenin, T-dalgası iyon hareketlilik-kütle spektrometrisi ile protein komplekslerinin üç boyutlu yapısını ve çarpışma kesit alanlarını belirlemeyi. Bu yöntem, alt birim paketlenmesi ve topolojisi hakkında bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Sharon grup üyeleri, eleştiri ve el yazması katkıları için teşekkür ederim. Biz destek için Morasha ve Bikura Programlar, İsrail Bilim Vakfı (Grant No 1823-1807 ve 378/08), Biomembrane Araştırma Josef Cohn Minerva Merkezi, Yeni bilim adamları için Chais Aile Fellows Programı, İbrahim minnettarız Sonia Rochlin Vakfı; Wolfson Aile Charitable Trust, Helen ve Milton A. KimmelKimmelman Merkezi Biyomoleküler Yapı ve Meclis için; Shlomo ve Sabine Beirzwinsky emlak; Meil ​​de Botton Aynsley, ve Karen Siem Reap, İngiltere.

<ol><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li>
<li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure%3A+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li>
<li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Mass+Spectrom+%28Chichester%2C+Eng%29%22%5BJournal%5D)">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li>
<li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS%3A+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li>
<li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li>
<li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li>
<li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li>
<li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived%2C+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections%3A+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li>
<li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+information+from+ion+mobility+measurements%3A+effects+of+the+long-range+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li>
<li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li>
</ol>

Burada açıklanan protokol genel şekli, altbirimlerine ambalaj ve topoloji hakkında bilgi sağlamak amacı ile, bilinmeyen bir üç boyutlu yapıya sahip protein ya da protein kompleksleri çarpışma kesiti tanımlamanıza olanak sağlar. Bu amaçla yapısal detayları için bu değerleri dönüştürmek için gerekli olan çarpışma kesiti değerleri bir kez tasvir edilmektedir. Bu işlem ek deneysel çabalarının yanı sıra, aşağıda kısaca ele alınmıştır hesaplamalı analiz, gerektirir. Başlamak için, bilinen yapılara sahip, protein ya da protein kompleksleri analiz etmek için tavsiye edilir. Bu ölçümler metodoloji yararlı bir kalite kontrol sağlayabilir ve satın parametrelerin doğruluğu, teorik ve ölçülen Ω değerleri karşılaştırarak değerlendirmesini sağlayacaktır. Teorik kesit alanları kristal yapısı hesaplanabilir operatör ihtiyaçlarına göre izin veren açık kaynak kod düzenleme FORTRAN tabanlı yazılım MOBCAL 15,16 yazılım kullanarak koordine etmektedir. Bu tür hesaplamalarda çalışan için giriş yapısı başına yapılan hesaplamalar iteratif sayısı arttı ve koordinat dosyaları içeren çok sayıda atomların 1 kabul edilir olduğundan bu programı değiştirmek için gereklidir. Çok bileşenli derlemeleri içinde alt birimden topolojik düzenlemeler tanımlamak için bir IM-MS stratejisi son zamanlarda 4,6 sürülmüştür. Bu yöntem, küçük parçalara protein meclislerinin disosiasyon yolların izlenmesi içerir. Bu disosiasyon meclislerinin &quot;yapı blokları&quot; yansıtıcı subcomplexes bir dağıtım doğurur, çözüm aşaması koşulları kontrollü ayar ile elde edilir. Ω değerleri sağlam bir kompleks ve demontaj ürünler hem de eş zamanlı ölçümü, sonra protein kompleksleri topolojik modelleri hesaplamak için kullanılan yapısal sınırlamalar üretir. Bu metodoloji altında yatan temel varsayım oluşturulan subcomplexes kendi anadili gibi teyitleri korumak ve aslında son yıllarda yapılan çalışmalarda, demontaj ürünlerin çözüm yapısını sürdürmüş olduğunu göstermiştir ve ya çözüm ya da gaz fazlarında önemli bir yeniden düzenlenmesi 4,6 oluştu. Gaz faz protein kompleksi iyonları kuaterner yapısı atama son adım bilgisayar modelleri çarpışma kesiti değerleri donanımdır. Modelleme yaklaşımları farklı olası topolojik alt birimden düzenlemeler ve onların siliko Ω değerleri hesaplanmış ve deneysel olanlarla karşılaştırıldığında keşfetmek amacıyla istihdam edilmektedir. Şu anda sadece birkaç hesaplama yaklaşımlar altbirimden çapı 1,8 yaklasik spheretype iri taneli bir yöntem gibi kullanılır. Bütün olarak bakıldığında, bu alanda hala ilk yıllarında ve daha da geliştirilmesi, bu yaklaşımın genel ve geniş bir yelpazede kompleksleri uygulanabilir yapmak için gereklidir.

t-dalgası İyon hareketlilik-kütle spektrometresi: protein karmaşık analiz temel deneysel prosedürler

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

İyon hareketlilik (IM), zayıf bir elektrik alan etkisi altında basınçlı bir hücre yoluyla seyahat için bir iyon için alınan önlemler bir yöntemdir. Iyonları drift bölgeye hareket hızı hangi boyutlarına bağlıdır: küçük bir oluşturan bu iyonların daha büyük iyonları arka plan inert gaz (genellikle N 2) ile daha fazla sayıda çarpışmaların bir deneyim ve böylece Sohbet cihaz üzerinden daha yavaş seyahat kesit. Genel olarak, zaman ve çarpışma kesiti (Ω) göre, yoğun gaz fazında onları ayıran rağmen göç iyonları için alır. Son zamanlarda, Sohbet spektrometrisi, kütle spektrometresi ve-dalga (T-dalgası) Synapt iyon hareketliliği kütle spektrometresi (IM-MS) serbest bırakıldı ile birleştiğinde. Iyon hareketliliği ile kütle spektrometresi entegrasyonu, verimli bir üç boyutlu spektrum (şarj, yoğunluk ve sürüklenme zaman kitle), örnek ayırma ve tanımı ekstra bir boyut sağlar. Bu ayırma tekniği spektral örtüşme azaltmak için izin verir, ve çok benzer bir kitle, veya kitle-şarj oranları, ancak farklı sürüklenme kez heterojen komplekslerinin çözünürlüğü sağlar. Ayrıca, Ω iyon genel şekli ve topoloji ile ilgili olarak sürüklenme zaman ölçümleri, önemli bir yapısal bilgi katmanı sağlar. Sürüklenme zaman ölçülen değerler ve Ω arasında korelasyon tanımlanan kesitler 1 kalibratörü proteinlerin elde edilen kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanır. IM-MS yaklaşımın güç altbirim ambalaj ve mikromolar konsantrasyonlarda protein meclislerinin genel şekli tanımlama yeteneği yatıyor ve yakın fizyolojik koşullarda 1. Son zamanlardaki birkaç anlık ileti çalışmaları, bireysel proteinler 2,3 ve non-kovalent protein kompleksleri 4-9 hem gaz fazı başarıyla protein kuaterner yapısı muhafaza olduğunu göstermiş, ve bilinmeyen bir geometri protein meclislerinin çalışmada, bu yaklaşımın potansiyel vurgulanan . 10; Burada, Synapt kullanarak protein kompleksleri IMS-MS analizi (kuadropol-Ion Hareketlilik-Zaman-Uçuş) HDMS enstrüman (sadece ticari IM-MS cihazı mevcut Waters Ltd) ayrıntılı bir açıklama sağlar. Biz temel optimizasyon adımları, çarpışma kesitler kalibrasyon ve veri işleme ve yorumlama yöntemleri açıklanmaktadır. Protokolün son adım, teorik Ω değerleri hesaplamak için yöntemler anlatılmaktadır. Genel olarak, protokol protein meclislerinin IM-MS karakterizasyonu her yönünü kapsayacak şekilde girişiminde bulunmamış, bunun yerine, amacına alanında yeni araştırmacılar yöntemin pratik yönlerini tanıtmaktır.

İyon hareketliliği-kütle spektrometresi ve çarpışma kesiti ve kitle dayalı, iyonlar ayıran yeni ortaya çıkan bir gaz faz teknolojisi. Yöntemi protein komplekslerinin genel topoloji ve şekil üç boyutlu bilgi sağlar. Burada, araç ayarı ve optimizasyonu, sürüklenme kez kalibrasyon, ve verilerin yorumlanması için temel bir prosedürü anahat.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

İyon mobilite (IM), bir iyonun zayıf bir elektrik alanının etkisi altında, basınçlandırılmış bir hücre boyunca ilerlemesi için geçen süreyi ölçen bir yöntemdir. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein komplekslerinin genel şeklini belirlemektir. Bu, protein kompleks iyonları için kütle spektrometrisi iyon mobilitesi verileri elde edilerek ve her bir yük durumunun sürüklenme süresi değerleri ölçülerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, doğal protein yapılarının mobilite ölçümlerini sağlamak amacıyla deneysel koşullar doğrulanır.Ardından, ölçülen sürüklenme süresi değerleri kesit alanları ile ilişkilendirilir. Sonuçlar, üç boyutlu yapıları bilinmeyen proteinlerin veya protein komplekslerinin çarpışma kesit alanı değerlerini belirler. Bu bilgiler, bunların genel şekli, alt birim paketlenmesi ve topolojisi hakkında ipuçları sağlar.Merhaba, ben Wiseman Bilim Enstitüsü Biyolojik Kimya bölümündeki Mic Laboratuvarı'ndan Isaac Leski ve ben de aynı laboratuvardan Naam Kirschenbaum. Bugün, hibrit kütle spektrometrisi ve iyon mobilite cihazları kullanarak protein komplekslerinin çarpışma kesit alanı ölçüm prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda protein komplekslerinin genel şeklini ve yapısal organizasyonunu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu prosedür, protein komplekslerinin demir hareketliliği, kütle spektrometrisi veya IMM MS analizine odaklanmaktadır. Numune hazırlama adımları, cihaz kalibrasyonu ile MS ve tandem MS optimizasyon prosedürleri ilgili bir JO protokolünde gösterilmektedir.Genel olarak bu protokol, amonyum asetat gibi uçucu bir tampon içerisinde düşük mikromolar kompleks konsantrasyonlarını içerir. Nano akış kılcalı başına bir ila iki mikrolitre tüketildiği göz önüne alındığında, MS koşullarının optimizasyonuna olanak tanımak için minimum hacim olarak 10 ila 20 mikrolitre hazırlayın. Bu prosedüre başlamak için, traveling wave veya T wave synap IMMS'yi; tri wave ve basınçların hem IM hem de iyonların uçuş süresi ayrımı için otomatik olarak ayarlandığı mobility tof çalışma moduna, pozitif iyon kazanımı ve V moduna getirin; iyonların uçuş tüpü ve yansıma boyunca izlediği yolu ayarlayın ve buradaki tüm gazları açın.IM ayırımı için azot, tuzak ve transfer bölgeleri için ise argon kullanılır. Önerilen başlangıç değerleri, IMS cihazı için dakikada 24 mililitre ve tuzak bölgesi için dakikada 1,5 mililitre gaz akışıdır. Ardından, bilinmeyen bir protein kompleksi için kütle-yük oranı kazanım aralığını ayarlayın.Başlangıçta geniş bir kütle aralığı kullanın, ardından bu aralık istenen değerlere düşürülebilir ve MS profili buna göre ayarlanabilir. Büyük kompleksler için maksimum iletim verimliliği sağlamak amacıyla, veri toplama kütle aralığı 1030 2000 m/z olarak ve MS profili otomatik (auto) olarak ayarlanmalıdır. Aksi takdirde, profil gösterilen şemaya göre ayarlanabilir.RF ayarını kontrol edin ve gerekirse, gösterildiği gibi büyük protein kompleksleri için uygun değerlere ayarlayın. Ardından, örneği yükleyin, kapiler voltajı ve düşük nano akış basıncını uygulayın. Püskürtme başladıktan sonra, nano akış basıncını minimum değere indirmeye çalışın.Ek olarak, kapiler konumunu koniye göre ayarlayın ve iyi çözünürlüklü bir MS Spektrumu elde etmek için MS kazanım parametrelerini düzenleyin. Cihaz boyunca ve örnekleme konisindeki basınç gradyanının yanı sıra ekstraksiyon konisi bias tuzağı ve transfer potansiyel ayarlarını ilgili JoVE protokolünde detaylandırıldığı şekilde optimize edin. Bu parametreler örneğe bağlı olsa da, burada peptitlerden protein komplekslerine kadar çeşitli demir kütlelerinin MS spektrumlarını elde etmek için kullanılan koşullar gösterilmiştir.Büyük iyonlar daha yüksek çarpışma enerjileri ve bias voltajı gerektirir. Büyük protein komplekslerinin analizinde, kompleksin aktivasyonunu minimize etmek için geri basıncın artırılması da önerilir. Pik konumunu değiştirmeden; örnek konisi ekstraksiyon, koni tuzağı ve bias voltajlarını yaklaşık 10 voltluk basamaklarla kademeli olarak azaltmayı deneyin.Optimum bir kütle spektrumu elde edildikten sonra, protein kompleksleri analiz edilirken sürüklenme süresi veya IM profili ayarlanmalıdır. Kütle ve mobilite ölçümleri için optimal koşullar genellikle birbiriyle uyumsuzdur. Bu nedenle, ikisi arasında uygun bir denge kurmak önemlidir.Genel olarak, demir mobilite grafiği, piklerin tüm sürüklenme süresi aralığına yayılacağı ve pik profilinin pürüzsüz olacağı şekilde optimize edilmelidir. Geniş bir dağılıma yaklaşıldığında, belirgin pik asimetrisi birden fazla konformasyonun yetersiz ayrıştırılmasıyla ilişkilendirilebilir; mobilite ayrımını optimize etmek için T-dalga hızı, T-dalga yüksekliği ve IMS gaz akış hızı ayarlanabilir. T-dalga hızının artırılması, sürüklenme süresi dağılım profilini genişletir.T-dalga yükseklik değerlerindeki artış profili daraltırken, benzer şekilde 10 milliliters per minute minimumdan başlayarak IMS gaz akışını artırmak, sürüklenme süresi profilini daha yüksek değerlere kaydırır; bu durum iyon mobilite spektrumunu optimize etmeye yardımcı olur. Üç değişkenden ikisini sabitleyip üçüncüsünü optimize ederek, T-dalga hızını 250 meters per second ve gaz akışını 24 milliliters per minute olarak ayarlayın. Ardından başlangıç noktası olarak yüksekliği üç volt değerine ayarlayın ve kademeli olarak bir voltluk artışlarla yükseltin.Yüksek bias voltajları kullanıldığında, IMS gaz basıncının düşürülmesi ve bu sayede bias voltajının azaltılması önerilir. Bunun sonucunda, kompleks aktivasyonu ve disosyasyonu azalacaktır. Koşullar optimize edilmediğinde, drift süreleri spektrumunun ilk kısmında ve kuyruk ucunda özdeş bir pik olarak gözlemlenen bir rollover etkisi ortaya çıkabilir.İyonlar IAM cihazından geçmediklerinde, yolculukları bir sonraki demir paketinin mobilite hücresine salınması için gereken süreden daha uzun sürebilir. Sonuç olarak, önceki paket itici bölgeye iletilmeden önce tuzak bölgesinden yeni bir iyon grubu salınır. Bu artefaktı ortadan kaldırmak için T-dalga yüksekliğini artırın ve T-dalga hızını ve IMS basıncını düşürün.Ek olarak, tuzak bırakma süresi ayarlanabilir. Ayrıca, transfer T-dalga yüksekliğinin en az beş volt olarak ayarlandığının doğrulanması önemlidir. Bu aynı zamanda, iyonların IMS hücresine doğru sızmasını önlemek içindir.Mobilite tuzağı yüksekliği maksimum seviyelerde tutulmalıdır. Düşük hız ve yüksek genlikli transfer T dalgaları, sürüklenme süresi dağılım profilinin dalgalanmasına yol açabilir. Bu artefakt, itme frekansı ile transfer T-dalga hızı arasındaki kısmi senkronizasyon nedeniyle, iyonların mobilite ayrımının transfer ve geçiş bölgeleri boyunca korunamadığı durumlarda ortaya çıkar.Bu etkiyi ortadan kaldırmak için ya itici süresi ya da transfer T-dalga hızı ayarlanmalıdır. İtici frekansı kütle aralığı ile ilişkili olduğundan, bu artefakt bu parametre değiştirildiğinde tekrar ortaya çıkabilir.T-dalgası yüksekliğinin etkisi sınırlıdır. Bununla birlikte, yüksekliğin azaltılması dalgalanmaların giderilmesine de yardımcı olabilir. Bahsedilen parametreler optimize edildiğinde, yüksek çözünürlüklü sonuçlar elde etmek için IMMS verileri toplanabilir.MS.Peaks protein kompleksleri, kalıntı suyun ve tampon bileşenlerinin uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için genellikle kütle spektrometresi içinde aktive edilir. Ancak, aktivasyon enerjisi bir eşik değerinin üzerine çıkarılırsa, yerel çözelti durumundaki yapıya karşılık gelmesi düşük olasılık olan çoklu ara durumlar oluşturarak kısmi açılma meydana gelebilir. Sonuç olarak, drift süresi piki, açılmış yapıların heterojen popülasyonunu yansıtacak şekilde kayabilir ve genişleyebilir.Çözelti fazı yapılarıyla tutarlı sürüklenme süresi verileri elde etmek için, İM ayrımı öncesinde iyonları hızlandırmak amacıyla kullanılan voltajların dikkatle kontrol edilmesi esastır; bu nedenle, sürüklenme süresi spektrumu üzerindeki etkisini izlerken kapiler ve kon voltajı kademeli olarak artırılmalıdır. Ayrıca, yüksek MS çözünürlüğü için trap voltajı yerine transfer voltajını artırmak daha tercih edilir. İM cihazı ilk sırada yer alır, ardından transfer bölgesi ve TOF analizörü gelir.Aktivasyon IM ölçümünden sonra gerçekleştiği için IM etkilenmezken, veri toplamanın kompleksin doğal yapısını koruyan koşullar altında yapıldığından emin olmak amacıyla MS hassasiyeti artırılabilir; bu nedenle, tek bir optimize edilmiş parametre setiyle sınırlı kalmak yerine, çeşitli deneysel ve çözelti koşulları üzerinden veri toplamak önemlidir. Bu sebeple, tuzak çarpışma voltajını kademeli olarak artırın ve demir mobilite profili üzerindeki etkisini izlerken 10 volt aralıklarla veri toplayın. Son olarak, açılmış konformasyonları tanımlamak ve elde edilen verileri değerlendirmek için, örneği pH 2 ile 7 aralığında asetik asit ile titre ederek protein kompleksinin ayrışmasını manuel olarak tetikleyin ve verileri kaydedin; ardından, bilinen kesit alan değerlerine sahip proteinler kullanılarak bir sürüklenme süresi kalibrasyon yaklaşımıyla tanımlanan kesit alanlarını kullanarak verileri T wave IMS sisteminde analiz edin.İlk olarak, her biri 10 micromolar konsantrasyonda denatüre kalibrasyon proteini çözeltileri hazırlayın. 49:49:0.2 hacim oranında su, metanol ve asetik asit içerisinde equine cytochrome C, horse heart myoglobin ve bovine ubiquitin kullanın. Ardından, kalibrasyon proteinleri için, hedef protein veya protein kompleksi için kullanılanla tamamen aynı cihaz koşulları altında IMMS verileri elde edin; IM ayrıştırma ayarlarını korumak için tüm voltaj ve basınç değerlerini aynı tutun.Veriler elde edildikten sonra, her bir yük için deneysel sürüklenme süresi değerini çıkarın. Cain proteinleri durumu için, her bir kalibre edilmiş sürüklenme süresini T' prime D, MOVZ gözlemlenen iyonun ana yük oranı ve C geliştirilmiş görev döngüsü EDC gecikme katsayısı olmak üzere aşağıdaki denklemle düzeltin. Değeri tipik olarak 1.4 ile 1.6 arasında olan bu katsayı, kullanılan cihaza bağlıdır.EDC değeri, sistem bir kazanım ayarları, bir kazanım kurulum sekmesi içinde belirtilmiştir; hem demir yük durumu hem de indirgenmiş kütle için her bir kalibre kesit alanını düzeltiniz. Burada omega C düzeltilmiş kesit alanı, omega literatür kesit alanı, Z demir yük durumu, M zincir iyonunun moleküler ağırlığı ve MG demirin moleküler ağırlığıdır.Genellikle azot olan arka plan gazı, T prime D'nin omega C'ye karşı grafiğidir. Ortaya çıkan eğri aşağıdaki denkleme karşılık gelir. X ve A parametreleri, grafiğin doğrusal bir ilişkiye uydurulmasıyla elde edilebilir. Eğim X, eksponansiyel oran faktörüne karşılık gelir ve A, belirlenen uyum sabitini temsil eder.Uyum korelasyon katsayısı R kare değerini hesaplayın. R kare için kabul edilebilir değerler 0,95'ten büyüktür. Daha düşük bir korelasyon katsayısı değeri, proteinin eksik açılmasından veya numunenin eskilmesinden kaynaklanabilir.Farklı kalibre proteinleri için kullanılan benzer olmayan deneysel koşullar, gürültülü spektrum ve verilerin eksik işlenmesi veya hesaplama hatası. Belirlenen eksponansiyel faktör X'i kullanarak ca sürüklenme zamanını düzeltin ve omega C'ye karşı T prime D'yi yeniden grafiğe dökerek hesaplamalarınızı doğrulayın. Korelasyon katsayısını yeniden tanımlayın. Daha önce açıklanan adımlara benzer şekilde 0,95'ten yüksek değerler beklenir; hedef proteinin veya protein kompleksinin ölçülen sürüklenme zamanını düzeltin ve hesaplanan eksponansiyel faktör X'i kullanarak hedef proteinin veya protein kompleksinin sürüklenme zamanını kalibre edin. Omega'nın TD'ye eşit olduğu, fit ile belirlenen sabit A'yı kullanarak hedef proteinin veya protein kompleksinin omega değerini hesaplayın. Bu adımları her deneysel koşul için tekrarlayın.Bilinmeyen proteinin veya protein kompleksinin çarpışma kesit alanı tanımlanırken, her deneyin en az üç kez tekrarlanmasını ve çarpışma kesit alanı değerleri belirlendikten sonra bu üç tekrarlı ölçümün standart sapmasının hesaplanmasını öneririz. Kompleksin topolojik yapısını veya düzenlemelerini öngörmek için modelleme yaklaşımları kullanılır. Bu işlem, deneysel çarpışma kesit alanı değerlerinin, oluşturulan model yapılarından hesaplanan in silico Omega değerleri ile uydurulmasıyla gerçekleştirilir; genel olarak bu alan henüz başlangıç aşamasındadır ve bu yaklaşımı genel hale getirmek ve geniş bir kompleks yelpazesine uygulanabilir kılmak için daha fazla geliştirme yapılması gerekmektedir.Sığır hemoglobininin tetramerik formunun yüzey temsili burada gösterilmiştir. Oksijen taşıyıcı hemoglobin kompleksi, yukarıda belirtilen yaklaşım için bir örnek teşkil edebilir. Hemoglobin; sırasıyla mavi ve kırmızıya boyanmış iki alfa ve iki beta alt biriminden oluşan ve alfa-beta dimerlerinin bir dimerini meydana getiren tetramerik bir protein kompleksidir.Hemoglobinin IMMS spektrumu burada gösterilmektedir. Kompleksin elde edilen IM ms spektrumu, bozulmamış kompleksle ilişkili ana bir yük serisi dağılımı ile alfa beta dimerine ve alfa ile beta monomerik alt birimlerin kütlelerine uyan yan yük serilerini ortaya koymaktadır. Hemoglobinin farklı formlarının teorik ve ölçülen CCS değerleri burada gösterilmiştir.Dimerik ve tetramerik formların çeşitli yük durumları için elde edilen sürüklenme süresi değerleri, omega değerlerini hesaplamak için kullanılmıştır. Bunlar teorik değerlerle karşılaştırılmıştır. Tetramerik bir kompleksin; döngüsel, dihedral veya zincir benzeri paketlenmeler şeklinde üç farklı asosyasyon olasılığı olduğu göz önüne alınmıştır.Dimerden tetramere geçişte omega değerindeki artış hesaplanarak yapısal organizasyon öngörülebilir. Önceki çalışmalar ve kendi deneylerimiz, ölçülen ccss ile kristal yapı verilerinden türetilen protein yüzey alanları arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Bu korelasyon, farklı paketleme formları için bir tetramerin yüzey alanındaki beklenen artışı, bir dimerle karşılaştırarak hesaplamak için kullanılabilir.Bu işlem, her bir alt birim asferik bir nesne olarak değerlendirilerek gerçekleştirilir. Zincir benzeri bir düzenleme tetramer CCS değerini yaklaşık iki kat artırırken, C4 veya D2 paketlemesi sırasıyla yaklaşık 1,5 ve 1,67'lik bir artış sağlar. Hemoglobinin tetramerik ve DME formlarının ölçülen CCS değerleri arasındaki hesaplanan oran 1,57 ± 0,03 olarak belirlenmiştir.Bu sayı, doğal yapının doğrusal bir şekilde organize olmadığını, bunun yerine ya siklik ya da dihedral bir tetramer olarak daha kompakt bir formda düzenlendiğini göstermektedir. Aynı hesaplama hemoglobinin çözümlenmiş kristal yapısı üzerinde tekrarlandığında, tetramerik formların DME formlarına olan yüzey alanı oranı, D2 simetrisine uyan 1,63 olarak bulunmuştur. Açıkça görülmektedir ki bu geometrik model basitleştirilmiştir ve protein alt birimleri yalnızca küresel değildir.Bununla birlikte, bu hesaplama, IMMS'nin bilinmeyen yüksek çözünürlüklü yapılara sahip komplekslerin paketlemesini ortaya çıkarma konusundaki heyecan verici potansiyelini kanıtlamaktadır. Protein ve protein komplekslerinin sürüklenme süresinin nasıl ölçüleceğini ve çarpışma kesit alanı değerlerinin nasıl hesaplanacağını göstermiş oldum. Bu prosedür uygulanırken, kalibrasyon proteinleri için IMMS verilerinin, hedef protein veya protein kompleksleri için kullanılan koşulların birebir aynısı kullanılarak elde edilmesi önemlidir.Ayrıca, bu deneylerin en az üç kez tekrarlanmasını ve bu üçlü ölçümlerin standart sapmasının belirlenmesini şiddetle tavsiye ederiz. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde başarılar dileriz.

t-wave-ion-mobility-mass-spectrometry-basic-experimental-procedures

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi...

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Burada, yüksek çözünürlüklü (~ 30.000) MS-algılama, peptid parçacıkları Monoklonal antikor çivili peptid standartları miktar için ardından peptid öncüleri iyon hareketlilik ayrılması ile birleştiğinde bir Kromatografik tahlil açıklamak Özet.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Detaylı bir protokol ayırma, kimlik ve kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) kullanarak protein örnekleri proteoforms karakterizasyonu için tanımlanır. Protokol proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanılabilir.

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

İyon hareketlilik spektrometresi (IMS), biyomoleküllerin karakterizasyonu için kütle spektrometrisinin ilginç bir tamamlayıcısıdır, özellikle izomerizme duyarlı olduğu için. Bu protokol, bir molekülün izolasyonuna ve parçalarının hareketlilik profillerinin oluşturulmasına izin veren bir tandem IMS (IMS / IMS) deneyini tanımlar.

Tandem İyon Hareketlilik Deneyleri için Döngüsel İyon Hareketlilik Spektrometresi Kullanma

Bu makalede, ilgili üçlü metal komplekslerinin ayrışmasının nispi termokimyasını ölçmek için elektrosprey-iyon hareketliliği-kütle spektrometrisi, yarı ampirik kuantum hesaplamaları ve enerji çözümlü eşik çarpışma kaynaklı ayrışma kullanan deneysel bir protokol açıklanmaktadır.

İyon Hareketliliği-Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ni(II) ve Zn(II) Üçlü Komplekslerinin Termokimyasal Çalışmaları

Öğrenin, T-dalgası iyon hareketlilik-kütle spektrometrisi ile protein komplekslerinin üç boyutlu yapısını ve çarpışma kesit alanlarını belirlemeyi. Bu yöntem, alt birim paketlenmesi ve topolojisi hakkında bilgi sağlar.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Daha fazla video keşfet