Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Bu prosedür, küçük GTP ACE'lerin polarize membran kaçakçılığı üzerindeki etkilerini analiz eder. İlk olarak, küçük GTP ACE'yi ve raportör proteinleri kodlayan DNA plazmitlerini polarize hücrelerin hücre çekirdeklerine birlikte enjekte edin. Daha sonra DNA'yı, endoplazmik retikulum veya TGN'deki raportör proteinleri tutuklayacak sıcaklıklarda eksprese edin, küçük GTPA sitozolde birikirken, daha fazla protein sentezini önlemek için siklo heide varlığında raportör proteini hücre yüzeyine kovalamaya devam edin.

Son olarak, immünofloresan analizi için raportör proteini hücre yüzeyinde etiketleyin. Bu testten elde edilen sonuçlar, konfokal mikroskopi ile yüzey lokalizasyonundaki değişikliğin görselleştirilmesine izin verir. Trans transfect gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, mikro enjeksiyonla elde edilen kısa aşırı ekspresyon süreleri boyunca, ikincil etkilerin minimum olmasıdır, bu da ilgilenilen proteinlerin birincil etkilerini incelememize izin verir.

Bu yöntem, küçük gtpa'nın polarize membran trafiğini ne kadar düzenlediği gibi hücre polaritesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başarılı bir mikroenjeksiyon için gerekli olan bireysel adımların görsel yardım olmadan açıklanması zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir: Üreticinin protokolüne göre Sigma Aldrich endotoksin içermeyen maksi hazırlık kiti ile endotoksin içermeyen plazma DNA'sını izole edin. Bu deney için, kültüre 0.4 mikrometre gözenek boyutunda üç adet net 12 milimetre transwell filtresi kullanın.

Hücreler, her filtreye beşinci MDCK hücrelerinin 10'unu dört kez yerleştirir. İki gün sonra, hücrelerin kapalı bir tek tabaka halinde büyüdüğünü doğrulamak için kültürü mikroskop altında inceleyin. Mikroenjeksiyon için.

Mikroenjeksiyon gününde, beş litre MM büyüme ortamı artı 15 milimetre heis 360 x 15 milimetre plakalar hazırlayın ve bunları 39 derece santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Ek olarak, bir mililitre MEM büyüme ortamı artı 50 milimolar heis ve mililitre sikloheksimid başına 0.1 miligram üç adet 12 oyuklu plaka hazırlayın ve bunları 31 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Mikroenjeksiyon mikroskobunu açın, ısıtılmış aşama 10 x ve 32 x objektif ve bir einor femto jet ile bu ters mikroskop gibi ayarlayın.

Isıtılmış sahneyi 39 santigrat dereceye ayarlayın. Ayrıca hava tablasına giden nitrojen gazı tankı beslemesini de açın. Şimdi DNA'yı filtrelenmiş su ile mililitre başına 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin.

Daha sonra DNA'yı 30 dakika boyunca 13.000 RPM'de bir einor mikro santrifüjde döndürün. Üst kısmı çıkarın ve yeni bir tüpe yerleştirin. Daha sonra, ilk filtreyi cerrahi bıçakla kültür kabından çıkararak MDCK hücrelerini hazırlayın, filtreyi filtre tutucusundan kesin ve beş mililitre 39 santigrat derece ısıtılmış MEM büyüme ortamı artı 50 milimolar heis içeren hazırlanmış 60 x 15 milimetrelik plakaya yerleştirin.

Filtreyi kültür plakasında tartmak için, cerrahi bıçağı filtrenin ortasına yerleştirin ve ardından kültür plakasını mikroskobun ısıtılmış aşamasına aktarın. Seyreltilmiş DNA'nın iki ila üç mikrolitresini bir mikroenjeksiyon iğnesine yükleyin. İğnenin koruyucu kapağını çevirin ve yere düşmesine izin verin.

İğneyi tutucuya yerleştirmek için enjeksiyonun menü tuşuna basın ve valfin kapalı olduğundan emin olun. İğneyi tutucusuna vidalayın. İğneyi çok sıkı vidalamamaya dikkat edin.

Bu kırılmaya neden olabileceğinden, menü tuşuna tekrar basın. Bu nedenle uygulanan kompanzasyon basıncı, mikroenjeksiyon işlemi sırasında ortamın iğne içine çekilmesini önleyecektir. Son olarak, iğneyi hücrelerin üzerine indirmek için saklanan hedef aramayı silmek için joystick'e dokunun.

10 x objektifi kullanın ve iğneyi sıvının üzerindeki ışık huzmesine getirin. Şimdi hücrelere odaklanın. Netleme tekerleğini 180 derece yukarı çevirerek tekrar netleme yapın ve iğneyi bulun.

İğneyi yavaşça odağa getirin. Ardından tekrar odak dışına çıkarın. Hücreleri tekrar odak noktasına getirmek için çalışmak.

İğneyi tekrar odak noktasına getirin. İğne ortamın yüzeyine temas edene kadar tekrarlayın ve bu noktada bir hale gözlenir. Hücrelerin odakta olduğu noktaya ulaşmaya devam edin, ancak iğne hala odak düzleminden bulanıktır.

Şimdi 32 x hedefine geçin ve kurs ayarlarını bulun. İğnenin ucuyla apikal zara dokunarak ve yaklaşık 10 mikrometre çıkararak Z sınırını ayarlayın. Çekirdekler apikal zarın altında yaklaşık 10 mikrometre uzanırken.

Şimdi iğneyi odak düzleminden mümkün olduğunca hızlı bir şekilde birkaç mikron çıkarın. İğne çekirdeğin üzerindeyken nişan alın ve joystick'in enjeksiyon düğmesine basın ve bırakın. Doğru enjeksiyon basıncını bulmak için 95 PSI'dan başlayın.

Basınç çok yüksekse, hücreler patlar. Basınç çok düşükse, beyaz bir nokta devam eder, ancak başka hiçbir şey olmaz. Hücre boyutu değişikliği olmadan bir faz değişikliği içeren başarılı bir enjeksiyon gerçekleştirin.

Hücrelerin üzerinde bulunan cerrahi bıçağın deliğine 100 ila 500 hücre enjekte edin. Daha sonra hücreleri kültür kabı ve cerrahi bıçakla birlikte 39 derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve iki saat inkübe edin. Son olarak, hücreleri bir mililitrelik hazırlanmış 12 oyuklu plakaya, MEM artı mililitre başına 50 milimolar 0.1 miligram, siklo heide aktarın ve 31 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

İfade edilen GFP sinyalinin ağarmasını önlemek için, yüzey boyama için sonraki tüm prosedürler sırasında alüminyum folyo ile kaplayarak numuneleri ışıktan koruyun. Hücreleri bir kültür kabına buz üzerinde metal bir plaka üzerine yerleştirin ve yıkayın. Buz gibi soğuk PBS plus plus ile bir kez, ilgilenilen proteinin ekto alanını tanıyan bir antikorun 30 mikrolitrelik damlasını buz pipeti üzerindeki metal plakaya temiz bir paraform parçası yerleştirin.

Şimdi hücreleri içeren filtreyi baş aşağı damlanın üzerine yerleştirin ve filtrenin arka tarafına birkaç damla antikor ekleyin. Buz üzerinde bir saat inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS plus plus ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3 paraform aldehit ile sabitleyin.

Hücreleri PBS plus plus ile bir kez yıkamaya devam edin ve PBS plus plus'ta beş dakika dengeleyin. Şimdi hücreleri bloke edici geçirgen tamponda inkübe edin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, eksprese edilen RAB GTP ACE santrifüjünü 10 dakika boyunca tespit etmek için birincil antikorları BPB'de bir ila 200 oranında seyreltin 13.000 RPM pipette, 30 mikrolitre antikor solüsyonu ıslak bir odaya yerleştirilmiş temiz param üzerine.

Hücreleri filtrenin üzerine baş aşağı antikor damlalarının üzerine yerleştirin ve bir saat inkübe edin. Oda sıcaklığında, hücreleri sağ tarafı yukarı bakacak şekilde 12'ye yerleştirin. Kuyu plakası ve bir yıkama aşaması da dahil olmak üzere uygun ikincil antikorlarla inkübasyondan sonra oda sıcaklığında BPB ile 30 dakika boyunca beş kez yıkayın.

Filtredeki hücreleri üç kez deiyonize suya batırın ve sağ tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mikrolitre yuvada mikro slaytlara yerleştirin: Üstüne 18 x 18 milimetre mikro kaplı bir cam yerleştirin ve yüz mendillerini kullanarak kapak kayışını hücrelerin üzerine hafifçe bastırın. Son olarak, sadece V-S-V-G-T-S-O 45 GFP kodlayan plazmidin sahte enjeksiyonunda oje ile kapatın. Protein, iyi polarize olmayan hücrelerde kırmızı yüzey lekelenmesine göre değerlendirildiği gibi, iyi polarize MDCK hücrelerinin bazolateral yüzeyine verilir.

GFP füzyon proteininin bir kısmı apikal membrana iletilecektir. Kontrol numuneleri bu şekilde görünüyorsa, verilere güvenilemez ve deney daha iyi polarize hücrelerle tekrarlanmalıdır. GFP füzyonuna ifade edilen tüm değerlerin, toplam protein için geniş hücre içi yeşil sinyalin kanıtladığı gibi, 31 santigrat derecenin takibi sırasında bazolateral membrana iletilmediğine dikkat edin Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık 10 ila 12 saat sürmelidir Geliştirildikten sonra.

Bu teknik, membran kaçakçılığı alanındaki araştırmacıların polarize epitel hücrelerindeki düzenleyici proteinleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak polarize epitel hücrelerinde proteinlerin nasıl eksprese edileceğini iyi anlamış olmalısınız.