Name: Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Keşfedin küçük GTPazların polarize epitel hücrelerindeki etkilerini mikroenjeksiyon tekniğiyle. Bu yöntem, proteinlerin birincil etkilerini minimal ikincil etkilerle incelemeyi sağlar ve membran trafik dinamiklerini anlamaya katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Sağlık (GM070736) National Institutes of H. Fölsch bir hibe ile finanse edildi. SF Ang A * STAR Lisansüstü bursu tarafından desteklenen ve RS Kang Hücresel ve Moleküler Temelleri (GM8061) Hastalığı Eğitim Programı tarafından desteklenen

1. Plazmid DNA İzolasyonu <ol><li> Üreticinin protokole göre endotoksin DNA hazırlamak için Sigma-Aldrich endotoksin maxiprep kiti kullanın. Bu kit, güvenilir bir şekilde herhangi bir DNA hazırlıkları endotoksin kaldırır, çünkü bizim için çalışır. DNA hücre çekirdeklerinin içine enjekte edilir endotoksin, hücre ölümüne yol açacaktır. </li><li> Izole edilmiş DNA, girdap ve bir Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 devirde 1 dakika için spin ul 100 fenol / chlorofom / izoamilalkol (25:24:1) ekleyin. Suyun üst faz yeni bir tüpe transfer ve 100 ul kloroform / izoamilalkol (24:1), yukarıdaki gibi vorteks ve spin ekleyin. DNA içeren yeni bir tüpe suyun üst faz transfer. Bu adım, mikroenjeksiyon iğne tıkanmasını önler DNA, herhangi bir protein kaldırmak için gereklidir. </li><li> Na asetat (pH 6.0) eklenerek nihai konsantrasyonu 300 mM ve 2 X vol% 100 etanol DNA çöktürün. Gecede -20 ° C'de inkübe edin. Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 rpm'de 20 dakika için DNA Spin,% 70 etanol ile bir kez yıkayın ve 300 ul endotoksin ücretsiz su (Sigma-Aldrich) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> DNA konsantrasyonu belirleyin. Tipik bir DNA konsantrasyonu, 1 ila 5 mg / ml arasında değişmektedir. </li></ol> 2. MDCK Hücreler Kültür <ol><li> Split MDCK hücreleri. Net 12 mm transwell filtreleri (0.4 mikron gözenek boyutu, Corning Costar, 3460) üzerine X 10 5 hücre hücre ve tohum 4 Sayımı. Mock-enjeksiyon kontrolü ve üç filtreler tohum gereken iki farklı mutant Rab proteinleri içeren bir deneme için. </li><li> 2 mM L-glutamin, 37 az 0.1 mg / ml penisilin / streptomisin ve% 7 (hacim / hacim) fetal sığır serumu (= MEM büyüme ortamı) ° C ve% 5 CO 2 ile MEM orta Kültür MDCK hücreleri </li><li> Her gün bazolateral odasında ortam değiştirin. Hayvanlarda epitel hücrelerinin durumu taklit eder, çünkü bu kutuplaşma sürecinde yardımcı olur. </li><li> 2 gün kapalı bir tek tabakalı hücrelerin büyüyen olup olmadığını mikroskop tohumlama sonrası kontrol. Tek tabaka herhangi bir delik tespit edemiyorsanız, 3. günde deney gerçekleştirmek. Delikleri hala varsa, günde 4 deneyi gerçekleştirmek. </li></ol> 3. Mikroenjeksiyon Usul ve Post-enjeksiyon inkübatörü <ol><li> Deney günü 39 ° C inkübatör içine 5 ml MEM büyüme ortamı artı her filtre ve yer için bir 60 x 15 mm plakası 50 mM HEPES hazırlar. Buna ek olarak, 1 ml MEM büyüme medya artı 50 mM HEPES ve 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz başına filtresi ve 31 ° C inkübatör içine yer 12 plaka iyi biri. </li><li> Mikroenjeksiyon mikroskop açın ve 39 ısıtmalı sahne ° C Isıtılmış bir sahne ile inverted mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), 10X ve 32X hedefleri ve Eppendorf FemtoJet (InjectMan NI2) kullanın. Son olarak, nitrojen ile hava masa malzemeleri nitrojen gazı tankının açın. </li><li> 100 ul - 10 toplam hacmi 0.2 mg / ml bir final konsantrasyon filtrelenmiş su (0.2 mikron filtre kullanın) ile DNA seyreltilir. Daha sonra, 30 dakika 13.000 rpm'de Eppendorf mikrosantrifüj DNA döndürün. Yeni bir tüp içinde üst kısmında yer ve çıkarın. Bu adım, mikroenjeksiyon iğne içine seyreltilmiş DNA yüklediğinizde doğru "temiz" DNA yükleyebilirsiniz sigortalanır. DNA şimdi mikroenjeksiyon için hazırdır. </li><li> Kültürü yemeğin ilk filtre yaptırmayı hücreleri hazırlayın. Bir cerrahi bıçağı (Feather Cerrahi Bıçak, paslanmaz çelik, No 11), 5 ml, 39 ° C sıcak MEM büyüme ortamı artı 50 mM HEPES (60 x 15 mm plaka) içine filtre filtre tutucu ve yerden kesilmiş. Kültür plaka filtre aşağı kesmek için kullanılan cerrahi bıçak ile tartılır. Cerrahi bıçak delik filtre ortasında çevreleyen, filtre gibi yerleştirin. Mikroskobun ısıtılmış sahneye kültür plakasına yerleştirin. </li><li> Mikroenjeksiyon iğnesi (Femtotip II, Eppendorf, 930.000.043) içine seyreltilmiş DNA (Bu durumda plazmid kodlama VSVGts045-GFP = sahte enjeksiyon kontrolü) 2-3 ul Yük, iğnenin koruyucu kapağını büküm ve yere düşürdüm . Şimdi iğne onun sahibinin vidalanan hazır. Bunu yapmak için, sizin InjectMan menü tuşuna basın ve vana kapatıldı olduğundan emin olun. Vida, iğne yuvasına doğru kırılmaya neden olabileceğinden çok sıkı iğne vida sakının. Şimdi, tekrar menü tuşuna basın, uygulanan P c microinjeciton işlemi sırasında iğne içine çekilmesine engel medya önleyecektir. Son olarak, saklanan homing silmek için joystick'e dokunun. </li><li> Hücreleri üzerine iğne düşürmek için, 10X objektif kullanımı ve sıvı üzerindeki ışık demeti içine iğne getirmek. Şimdi hücreler, yine odak odak tekerleği 180 dönüm ° getirmek odaklama ve iğne bulmak. Daha sonra, yavaş yavaş (hücrelerin yeniden odak noktası haline getirmeye yönelik çalışma) odak tekrar ortaya çıkarmak, sonra odak noktası haline iğne taşımak için, içine iğne aşağı getirmektekrar cus. Iğne medya yüzeyine temas edene kadar tekrarlayın göreceksiniz, bu noktada bir hale. Hücreleri odakta olduğu bir noktaya ulaşabilir, ama iğne (odak düzlemli yani) 32X objektif ve ince kaba ayarları değiştirmek hala bulanık. </li><li> Apikal membran iğne ucu ile dokunarak ve yaklaşık olarak 10 mikron çekirdekleri çıkartılarak apikal membran altındaki yaklaşık 10 mm döşeme z-limit ayarlayın. </li><li> Z-limit ayarladıktan sonra, sağ enjeksiyon basıncı bulabilirsiniz. 95 PSI başlayın. Basıncı çok yüksek ise, hücre darbe olacaktır. Basıncı çok düşükse, kalan bir beyaz nokta göreceksiniz, ama başka hiçbir şey olmuyor. Başarılı bir enjeksiyon ile, bir hücre boyutu değişiklik olmadan bir faz değişimi göreceksiniz. Enjeksiyon için, mümkün olduğunca hızlı odak düzlemli iğne birkaç mikron çıkarmak. Çekirdeğin üzerinde iğne (yani bireysel bir hücrenin ortasında) ve joystick enjeksiyon düğmesine basın Amaç, ama düğmesini basılı tutmayın. </li><li> Hücreleri üzerinde yatıyor cerrahi bıçak delik içinde 100-500 hücreleri enjekte edilir. İşiniz bittiğinde, 2 saat için 39 ° C inkübatör içine kültür çanağı ve cerrahi bıçak ve inkübe hücrelerin Bu süre zarfında, VSVGts045-GFP ifade edilir ve ER salınır. Ancak, 39 ° C, VSVGts045 GFP doğru katlayın edemez ve böylece ER terk edemez. Bu arada, faiz küçük GTPaz ko-enjeksiyon deneyleri sitoplazmada birikir. </li><li> 31 ° C'de 2 saat, 2 saat sonra, 12 plaka ve inkübe 1 ml MEM büyüme ortamı artı 50 mM HEPES ve 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz içine hücreleri yerde Bu kovalamaca dönemde, VSVGts045-GFP, doğru katlayın ER bırakın ve hücre yüzeyine teslim edilir. </li><li> (Plazmid kodlama VSVGts045-GFP enjekte örneğin Rab13Q67L V5-etiketli) filtreleri iki (plazmid kodlama VSVGts045-GFP enjekte örneğin Rab13T22N V5-etiketli) ve üç adımları 3.1 - 3.10 tekrarlayın. Her enjeksiyondan yaklaşık 20 - 60 dakika sürecektir. Bununla birlikte, hücrelerin düzeltmek kadar bu sıcaklık değişimi inkubasyon ve yüzey boyama boyunca her filtre aynı şekilde tedavi etmek için kesinlikle çok önemlidir. Fiksasyon sonra, boyama protokol aynı zamanda tüm filtreler geri kalanı yapabilir. </li></ol> 4. Yüzey Boyama İmmünofloresan Analizi Not VSVGts045-GFP, GFP sinyali beyazlatma önlemek için, sonraki tüm işlemleri sırasında alüminyum folyo ile kaplayarak ışığı örneklerin korumak. <ol><li> Yüzey boyama yapmak istiyorsanız, buz üzerinde metal bir plaka üzerine bir kültür çanak hücrelerinin yeri ve buz PBS 2 + (PBS [0,2 g / L KCl, 0.2 g / L KH 2 PO 4 ile 1X hücreleri yıkayın 8 g / L NaCl ve 2.17 g / L Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] artı 0.1 g / L CaCl 2 ve 0,1 g / L MgCl 2 x 6 H 2 O). Daha sonra, yer, bu durumda protein ectodomain tanıyan bir antikor 30 ul fare monoklonal antikor TK1 (IgG 1, geç Thomas Kreis elde edilen), buz üzerinde metal plaka üzerine yerleştirilir temiz parafilm üzerine. Hücreleri ile filtre baş aşağı düşüş üzerine yerleştirin ve arka filtre üzerine antikor birkaç damla damlatılır. 1 saat buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 12 plaka içine yerleştirin hücreleri, 3X buz PBS 2 ile yıkama + (veya RT sıcak PBS 2 + önceki yüzeyi boyama hariç) ve RT 15 dakika için% 3 paraformaldehid ile düzeltmek. </li><li> PBS 2 + ile bir kez hücreleri yıkayın ve PBS 2 + 5 dakika bekletin. </li><li> / Permeabilization tampon (BPB) (% 2 [ağırlık / hacim] BSA,% 0.4 [wt / vol] PBS 2 saponin +)% 10 hacim / hacim] keçi serumu engelleme hücreleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Bu örnekte BPB'deki anti-V5 (fare monoklonal antikor IgG 2a, Invitrogen), 1:200, ifade Rab GTPaz algılamak için primer antikor sulandırınız. 13.000 rpm'de 10 dakika için bir Eppendorf mikrosantrifüj seyreltilmiş antikorlar dönerler. Yeri 30 ul temiz parafilm antikor çözüm ıslak bir odasına yerleştirdi. Filtre hücreleri antikor düşüşü üzerine baş aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 12 plaka ve 5X RT BPB ile 30 dakika boyunca yıkayın geri yerleştirin hücreleri (sağ tarafında yukarı). </li><li> Bu durumda, keçi anti-fare IgG 1 Alexa (yüzeyinde tespiti VSVG için, Invitrogen) 594 etiketli ve Cy5 etiketli sekonder antikor Bu örnekte keçi, Rab GTPaz tanımak için anti-fare IgG 2a, uygun ikincil antikorlar sulandırınız BPB içine 1:200, (Jackson ImmunoResearch) Cy5, etiketli ve yukarıdaki gibi döndürün. Filtre baş aşağı antikor düşüşü üzerine ıslak bir oda ve yer hücreleri temiz parafilm üzerine koyun 30 ul antikor çözüm. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 4.6 adımı tekrarlayın. </li><li> Deiyonize su ve yer r içine 3X filtre Dip hücreleriLamlar üzerine ight yüzü yukarı. 10-15 ul montaj (% 10 distile su [wt / vol] DABCO,% 50 ağırlık / hacim] gliserol) hücrelerin üstüne ekleyin. Üst ve kutu mendil kullanarak yerleştirin 18x18 mm mikro cam kapak hücreleri hafifçe üzerine mikro cam kapak tuşuna basın. Seal ile oje. </li><li> Konfokal bir mikroskop ile örneklerin analiz edin. Biz 63X suya daldırma lens ile donatılmış bir Microsystems'ın EKK 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc. Kullandı. </li><li> Rakamlar hazırlanması için, ayarlamak ve Adobe Photoshop ve Adobe Illustrator gibi programları kullanarak görüntüleri birleştirmek. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Küçük GTPases eş ifade sıralama VSVG müdahale nasıl örnekler için nazik apikal missorting 3, 4 veya 7 yüzey teslim inhibisyonu ya da yayınlanan makalelere bakın. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Mock-enjeksiyon, yüzey boyama (kırmızı, Şekil 1 A) tarafından değerlendirilecek gibi, sadece plazmid kodlama VSVGts045 GFP bir enjeksiyon, yani protein iyi polarize MDCK hücreleri bazolateral yüzeyinde teslim edilir. Tüm VSVGts045-GFP 31, kovalamaca sırasında bazolateral membran teslim olduğunu ° C gibi geniş total protein, hücre içi sinyal kanıtladığı (yeşil, 1 A ve B Rakamlar). Iyi polarize değildir hücrelerinde VSVGts045-GFP apikal membran (Şekil 1 B) teslim edilecektir. Kontrol örnekleri Şekil 1 B hücre gibi bakarsanız, size güven ve iyi polarize hücreler ile deneme tekrarlamak zorunda değildir. Ölçeği çubuklar 5 mikron.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

, Başarılı bir mikroenjeksiyon deney için en kritik adımlar hücrelerinin DNA ve polarite kalite ve saflık. Polarize hücreler olmadan, enjeksiyon kontrolü zaten VSVG mistargeted olacak ve deney kullanılamaz. DNA kalitesiz ise, DNA yoksullara açan bir iğne ya da istenilen protein hiçbir ifade tıkayabilir. Ayrıca, böyle pRKV gibi yüksek ekspresyon düzeyleri yol açtığı bilinen ifade plazmid kullanmak için tavsiye edilir. Diğer kargo proteinler sıralamak için test etmek isterseniz, sıcaklık değiş...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Isıtmalı aşaması ile 200 Mikroskop Axiovert </td><td> Carl Zeiss A.Ş. </td><td> Özel sipariş </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet mikromanipülatör </td><td> Eppendorf </td><td> Özel sipariş </td></tr><tr><td> Femtotips II (Mikroenjeksiyon iğneler) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader ipuçları </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Clear 12 mm transwell filtre destekler </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoksin ücretsiz plazmid maxiprep kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

polarize epitel hücreleri içine plazmidler, mikroenjeksiyon küçük gtpases fonksiyon analizi

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Apikal etki &#39;ücretsiz&#39; yüzeyleri yüzleri ve bazolateral membran substrat ve komşu hücrelerle temas biyokimyasal ve fonksiyonel olarak farklı apikal ve bazolateral etki alanı içine plazma zarı kutuplaştırırlar epitel hücreleri. Her iki membran etki, bir difüzyon bariyeri oluşturan sıkı bağlantıları ayrılır. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri, epitel hücreleri polikarbonat filtreler yüksek yoğunluklu numaralı seribaşı ve birkaç gün 1 2 kültüre Apikal-bazolateral kutuplaşma kültürü başarıyla değinmeyecek. Ras süperailesinin RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ve Rab13 3 4 5 6 7 gibi küçük GTPases bir dizi hücre polarite kurulması ve bakımı tarafından düzenlenir. GDP-bağlı etkin olmayan bir devlet ve aktif bir GTP bağlı devlet arasındaki tüm GTPases gibi bu proteinlerin döngüsü. Bu bisiklet 8 ile nükleotid bağlayıcı bölgelerinde spesifik mutasyonların etkileyebilir. Örneğin, Rab13T22N kalıcı GSYİH-form kilitlenir ve böylece &#39;olumsuz baskın&#39; olarak adlandırılan, Rab13Q67L artık GTP hidroliz ise ve bu nedenle bir &#39;baskın aktif&#39; devlet 7 kilitlenmiş durumda . Hücreleri, kendi işlevlerini analiz etmek GTPases iki baskın baskın negatif ve aktif allel genellikle endojen proteinlerin 9 fonksiyonu ile müdahale yüksek seviyelerde ifade edilir. Kısa bir miktarı aşırı ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak için zarif bir şekilde, filtre, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak destekler yetişen polarize hücrelerinin çekirdekleri doğrudan ilgili proteinleri kodlayan plazmid tanıtmaktır. Bu çoğu zaman özellikle apikal veya bazolateral etki alanı sıralanır plazma membran reseptörleri kodlayan plazmid muhabiri ko-enjeksiyon ile birleştirilmiştir. Bazolateral etki sıralama kargo analiz etmek için sık sık kullanılan bir kargo veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSVGts045) 10 ısıya duyarlı bir allel . Bu protein, 39 ° C&#39;de düzgün bir şekilde katlayın ve ilgi düzenleyici protein sitoplazmada monte edilir ve böylece endoplazmik retikulum (ER) muhafaza edilecektir. Bir kayma ile 31 ° C VSVGts045 plazma zarı 11 ER ve seyahat düzgün kat terk etmeye izin verecek. Bu kovalamaca genellikle temiz sonuçları neden daha fazla protein sentezini önlemek için Siklohekzimidsiz varlığı yapılır. Burada detaylı olarak, kapsamlı bir analiz bazolateral sıralama yer alan düzenleyici proteinlerin izin sıcaklık vardiya de dahil olmak üzere polarize hücreler ve sonraki inkubasyon plazmid microinjecting prosedürü açıklar.

Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epitel hücreler, plazma membranlarını biyokimyasal ve fonksiyonel olarak farklı olan, apikal domainin ... tarafına baktığı apikal ve bazolateral domainlere polarize ederler.

Bu prosedür, küçük GTP ACE'lerin polarize membran trafiği üzerindeki etkilerini analiz eder. İlk olarak, küçük GTP ACE ve raporlayıcı proteinleri kodlayan DNA plazmitlerini polarize hücrelerin çekirdeklerine birlikte enjekte edin. Ardından, küçük GTPAle sitozolde birikirken, raporlayıcı proteinleri endoplazmik retikulumda veya TGN'de tutacak sıcaklıklarda DNA'yı eksprese edin; daha fazla protein sentezini önlemek için sikloheksimid varlığında raporlayıcı proteinin hücre yüzeyine taşınmasını sağlayın.Son olarak, immünofloresan analizi için hücre yüzeyindeki raporlayıcı proteini işaretleyin. Bu analizden elde edilen sonuçlar, konfokal mikroskopi aracılığıyla yüzey lokalizasyonundaki değişimin görselleştirilmesine olanak tanır. Bu tekniğin transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikroenjeksiyon ile elde edilen kısa süreli aşırı ekspresyon sırasında sekonder etkilerin minimum düzeyde kalması ve böylece ilgilenilen proteinlerin primer etkilerini incelememize imkan tanımasıdır.Bu yöntem, küçük GTPazların polarize membran trafiğini nasıl düzenlediği gibi hücre polaritesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başarılı bir mikroenjeksiyon için gerekli olan münferit adımların görsel yardım olmadan açıklanması zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Sigma Aldrich endotoksin içermeyen maxi prep kiti ile üretici protokolüne uygun olarak endotoksin içermeyen plazmit DNA izole edin. Bu deneyde, kültürleme için 0,4 µm gözenek boyutuna sahip üç adet şeffaf 12 mm transwell filtre kullanın.Her filtreye beşinci pasaj MDCK hücrelerinden 4 × 10⁴ adet ekilir. İki gün sonra, hücrelerin kapalı bir monokatman halinde büyüdüğünü doğrulamak için kültür mikroskop altında incelenir. Mikroenjeksiyon için.Mikroenjeksiyon gününde, beş litre MM büyüme besiyeri artı 15 milimolar heis içeren 360 x 15 milimetrelik plakalar hazırlayın ve bunları 39 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Ayrıca, bir mililitre MEM büyüme besiyeri artı 50 milimolar heis ve 0,1 mg/mL sikloheksimid içeren üç adet 12 kuyucuklu plaka hazırlayın ve bunları 31 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Mikroenjeksiyon mikroskobunu açın; ısıtmalı tabla, 10x ve 32x objektifler ile bir einor femto jet içeren bu ters mikroskobu kurun.Isıtmalı tabla 39 °C'ye ayarlayın. Ayrıca hava tablosuna giden nitrojen gazı tankı beslemesini açın. Şimdi DNA'yı, son konsantrasyonu 0.2 mg/mL olacak şekilde filtreli su ile seyreltin.Ardından, DNA'yı bir mikro santrifüjde 13,000 RPM hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst kısmı alarak yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, MDCK hücrelerini hazırlamak için ilk filtreyi cerrahi bıçakla kültür kabından çıkarın, filtreyi filtre tutucusundan kesin ve 5 mL 39 °C'ye ısıtılmış MEM büyüme medyumu ile 50 mM HEPES içeren hazırlanmış 60 x 15 mm'lik plakaya yerleştirin.Kültür plakasındaki filtreyi sabitlemek için cerrahi bıçağı filtrenin merkezine yerleştirin ve ardından kültür plakasını mikroskobun ısıtmalı tablasına aktarın. Seyreltilmiş DNA'dan iki ila üç mikrolitre miktarını bir mikroenjeksiyon iğnesine yükleyin. İğnenin koruyucu kapağını çevirerek çıkarın ve yere düşmesini sağlayın.İğneyi tutucuya yerleştirmek için enjektörün menü tuşuna basın ve valfin kapalı olduğundan emin olun. İğneyi tutucusuna vidalayın. İğneyi çok fazla sıkmamaya dikkat edin.Bu durum kırılmaya yol açabileceğinden, menü tuşuna tekrar basın. Böylece uygulanan dengeleme basıncı, mikroenjeksiyon işlemi sırasında medyanın iğne içine çekilmesini önleyecektir. Son olarak, iğneyi hücrelerin üzerine indirmek için kayıtlı başlangıç konumunu silmek üzere joystick'e dokunun.10x objektifi kullanın ve iğneyi sıvının üzerindeki ışık demetine getirin. Şimdi hücrelere odaklanın. Odak tekerleğini 180 derece yukarı çevirerek tekrar yukarıya odaklanın ve iğneyi bulun.İğneyi yavaşça odağa getirin. Ardından tekrar odağın dışına çıkarın. Hücreleri yeniden odağa getirmeye çalışın.İğneyi tekrar odağa getirin. İğne, ortamın yüzeyine değene ve bu noktada bir hale gözlemlenene kadar işlemi tekrarlayın. Hücrelerin odakta olduğu ancak iğnenin hala odak düzleminin dışında kaldığı için bulanık göründüğü noktaya ulaşana kadar devam edin.Şimdi 32x objektife geçin ve kaba ayarları yapın. İğnenin ucuyla apikal membrana dokunup yaklaşık 10 mikrometre çıkararak Z limitini belirleyin. Çünkü çekirdekler apikal membranın yaklaşık 10 mikrometre altında yer almaktadır.Şimdi iğneyi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde odak düzleminin birkaç mikron dışına çıkarın. İğneyi çekirdeğin üzerine hizalayın ve joystick üzerindeki enjeksiyon düğmesine basıp bırakın. Uygun enjeksiyon basıncını bulmak için 95 PSI ile başlayın.Basınç çok yüksek olursa hücreler patlar. Basınç çok düşük olursa beyaz bir nokta kalır ancak başka hiçbir şey gerçekleşmez. Hücre boyutunda bir değişim olmadan, faz değişimini içeren başarılı bir enjeksiyon gerçekleştirin.Hücrelerin üzerinde bulunan cerrahi bıçağın deliğine 100 ile 500 arasında hücre enjekte edin. Ardından, hücreleri kültür kabı ve cerrahi bıçakla birlikte 39 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve iki saat boyunca inkübe edin. Son olarak, hücreleri 1 mL MEM artı 50 mM 0.1 mg/mL cyclo heximide içeren hazırlanmış 12 kuyucuklu plakaya aktarın ve 31 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.Eksprese edilen GFP sinyalinin solmasını önlemek için, yüzey boyama işleminin sonraki tüm aşamalarında numuneleri alüminyum folyo ile kapatarak ışıktan koruyun. Kültür kabındaki hücreleri buz üzerindeki bir metal plaka üzerine yerleştirin ve yıkayın. Bir kez buz soğuk PBS++ ile yıkadıktan sonra, buz üzerindeki metal plakaya temiz bir parafilm parçası yerleştirin ve ilgi duyulan proteinin ekto domainini tanıyan bir antikordan 30 µL'lik damlalar pipetleyin.Şimdi, hücreleri içeren filtreyi damlanın üzerine ters şekilde yerleştirin ve filtrenin arka yüzüne birkaç damla antikor ekleyin. Buz üzerinde bir saat inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS++ ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %3 paraformaldehit ile sabitleyin.Hücreleri bir kez PBS++ ile yıkayın ve beş dakika boyunca PBS++ içinde dengeleyin. Şimdi hücreleri bloklama geçirgen tamponu içinde inkübe edin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, eksprese edilen RAB GTP ACE'yi saptamak için primer antikorları BPB içinde 1:200 oranında seyreltin, 13.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ıslak bir hazneye yerleştirilmiş temiz lam üzerine 30 µL antikor solüsyonu pipetleyin.Hücreleri, antikor damlacıklarının üzerine ters şekilde yerleştirin ve bir saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, hücreleri tekrar düz şekilde bir 12 kuyucuklu plakaya yerleştirin ve uygun sekonder antikorlarla inkübasyonu takiben, bir yıkama adımı da dahil olmak üzere, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında BPB ile beş kez yıkayın.Filtre üzerindeki hücreleri üç kez deiyonize suya batırın ve 10 mikrolitre mount kullanarak mikroslaytlar üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Üzerine 18 by 18 milimetrelik bir mikro lameli kapatın ve yüzey mendilleri kullanarak lamelini hücrelerin üzerine nazikçe bastırın. Son olarak oje ile mühürleyin; yalnızca V-S-V-G-T-S-O 45 GFP kodlayan plazmidin kullanıldığı yalancı enjeksiyonda, protein, iyi polarize olmamış hücrelerdeki kırmızı yüzey boyamasıyla değerlendirildiği üzere, iyi polarize olmuş MDCK hücrelerinin bazolateral yüzeyine iletilir.GFP füzyon proteininin bir kısmı apikal membrana iletilecektir. Eğer kontrol örnekleri bu şekilde görünüyorsa, verilere güvenilemez ve deney daha iyi polarize olmuş hücrelerle tekrarlanmalıdır. Toplam protein için gözlemlenen yaygın hücre içi yeşil sinyalin de kanıtladığı üzere, 31 °C'deki takip süreci boyunca eksprese edilen tüm GFP füzyonunun bazolateral membrana iletilmediğine dikkat edilmelidir. Bu teknik, geliştirilme aşamasından sonra uzmanlaşıldığında yaklaşık 10 ila 12 saat sürmelidir.Bu teknik, membran taşınımı alanındaki araştırmacıların polarize epitelyal hücrelerdeki düzenleyici proteinleri incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, mikroenjeksiyon tekniğini kullanarak polarize epitelyal hücrelerde proteinlerin nasıl eksprese edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir...

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Bu sunum, hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyürken, hücreler arası, kavşak iletişiminin incelenmesi için yapışık, kültürlenmiş hücrelerin elektroporasyonunun kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Bu protokol, Rac1 dahil olmak üzere Rho ailesi GTPazları için bağlayıcı ortakların göreli afinitelerini karşılaştırır. İn vivo, Rac1 bağlayıcı proteinler, konformasyonu bağlı bir nükleotid tarafından belirlenen tek bir bağlanma arayüzü için rekabet eder. Nükleotid, yüksek hidroliz hızı nedeniyle hem önemlidir hem de deneysel olarak kontrol edilmesi zordur.

Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

Hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan tükenme-kurtarma deneyleri için bir yöntem tanımlıyoruz. Adenofeksiyon, tek hücre düzeyinde mitotik hücre bölünmesi ve miyogenez gibi ince ayarlanmış aktin bazlı dinamiklere dayanan biyolojik süreçler içindeki proteinlerin fonksiyonel analizlerini sağlar.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Burada tarif biz prenilasyon ve guanozin-5'-trifosfat (GTP) araştırmak için bir protokol-Rho GTPazlar yükleme. Bu protokol iki detaylı yöntemi oluşur, yani membran ayırma ve GTPazlar bağlı immunosorbent assay. Protokolü prenilasyon ve GTP ölçmek için kullanılabilir diğer küçük GTPases'den başka bir yükleme.

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Keşfedin küçük GTPazların polarize epitel hücrelerindeki etkilerini mikroenjeksiyon tekniğiyle. Bu yöntem, proteinlerin birincil etkilerini minimal ikincil etkilerle incelemeyi sağlar ve membran trafik dinamiklerini anlamaya katkıda bulunur.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Daha fazla video keşfet