Name: Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, karma karaciğer hücre kültürlerinden makrofaj izolasyonunu. Bu basit yöntem, karmaşık ekipman gerektirmeden yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, bir araştırma hibe ve Hibe Yardım, Japonya Tarım, Orman ve Balıkçılık Bakanlığı Gıda Nanoteknoloji Projesi tarafından finanse edildi

1. Karaciğer, Perfüzyon <ol><li> Intraperitoneal sodyum pentobarbital bir çözüm (50 mg sodyum pentobarbital / kg vücut ağırlığı); yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan (vücut ağırlığı 150-200 gr hafta-10-15) anestezisi. </li><li> Paslanmaz bir tavada hayvan koyun ve% 70 etanol, karın ve göğüs üzerine püskürtün. </li><li> Açıklarındaki küçük bir kesim ve cilt soyma olun. Bir makas ile kesme karın açın. </li><li> Portal ven yerini onaylayın, portal ven ve gevşek bir tutam altında bir cerrahi iplik geçer. </li><li> Tutam inferior vena kava ve karaciğerde kanın geri kaçmasını önleyecek şekilde mezenterik ven distal parçası. Göğüs boşluğu diyafram makasla keserek açın ve kalp maruz. </li><li> Plastik bir kateter (2 mm çapında) ve portal ven içine yerleştirin ve kateter etrafında konu iyice sıkın. </li><li> 37 ° prewarmed ° C; yıkama solüsyonu (pH 7,2 Ca 2 +-Mg 2 + 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES ve 4.2 mM NaHCO 3 içeren ücretsiz HBSS) ile yüklenen bir perfüzyon sistemi kateter bağlayın </li><li> 10 ml / dak hızında in situ perfüzyon başlayın. Aynı zamanda, sağ atrium duvarında bir kesim olun. 10 dakika için perfüzyon devam edin. </li><li> Perfüzyon çözüm kollajenaz çözüm Anahtarı [Tipi ile desteklenmiş 10mM Hepes ve 4.2mm NaHCO 3 içeren HBSS kollajenaz (% 0.05) ve tripsin inhibitörü (50 mg / ml), pH 7.5] 10 ve serpmek hızında 20 dakika 10 ml / dak karaciğer biraz şişer ve seröz membran altında karaciğer yapısının dağılması için işareti gösterene kadar. </li></ol> 2. Parankimal Hepatosit zengin Hücre Kesir hazırlanması <ol><li> Çıkarın ve dikkatli bir şekilde steril bir behere 25 ml kollajenaz çözüm içeren karaciğer transferi. Makasla küçük parçalar halinde Kıyma. </li><li> Ortaya çıkan hücre süspansiyonu içine 75 ml soğuk MEM ekleyin. Nazik pipetleme sonra, süzüntü bir hücre süzgeç (100 mm) ile, bağ dokuları ve sindirilememiş doku parçaları kaldırmak için. </li><li> 4 ° C (fren kapalı) 1 dakika 50 xg'de süzüntü 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine aktarın. </li><li> Süpernatantı dikkatli atın. Soğuk MEM pelletini tekrar. </li><li> ) Üç kez 2.4 tekrarlayın. </li></ol> 3. Karaciğer Hücreleri Karma İlköğretim Kültür <ol><li> DMEM 100 mcM β-mercaptoethanol 10 mg / ml insülin, 100 mg / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin ve tohum ile desteklenmiş% 10 ısı inaktive FCS içeren oluşan besi 2.5 'te elde edilen hücreler) Askıya Alma 6.7 x 10 4 hücre / cm 2 (orta 5 x 10 6 hücre / şişeyi / 12 -15 ml) yoğunluğu: 09:55 doku kültürü şişeleri (75 cm 2 yüzey alanı). </li><li> Inkübe kültür flasksat 37 ° C -% 5 CO 2 'nin bir atmosfer% 95 hava. </li><li> Besi her 2 ila 3 gün aralıklarla değiştirin. </li></ol> 4. Makrofajlar, Seçici İzolasyon <ol><li> 12 gün sonra kültür, makrofaj hücre kağıda çoğalırlar. Bu hücreler, 80 kültür şişe sallayarak karşılıklı tarafından askıya alınır - 30 dakika için dakikada 120 vuruş 37 ° C </li><li> 100 mm olmayan doku kültürü dereceli plastik tabaklar kültür ortamı içine aktarın. Bir plastik tabak içine iki T75 şişeler orta Havuzu. Büyüme, orta ve Yedek kültür şişeler inkübatör onları geri. </li><li> 37 30 dakika inkübe plastik tabaklar ° C -% 5 CO2 atmosferi% 95 hava Makrofajlar kolayca diğer kirliliğe neden olan hücreleri yok ise, bu kuluçka süreci kapsamında olmayan doku kültürü notu plastik tabaklar eklemek. </li><li> Aspire orta ve PBS ile plastik yemek nazikçe yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> TrypLE Express çözümü 1 ml çanak içine ekleyin ve 37 o 10 dakika süreyle inkübe ° C -% 5 CO2 atmosferi% 95 hava. </li><li> Besi 9 ml ekleyin. Bir hücre kazıyıcı bağlı makrofaj hafifçe kazıyın. </li><li> Hücre süspansiyonu, ° C (fren) 5 dakika boyunca 25 180 xg 15 ml konik tüp ve santrifüj içine aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve besi 1 ml ekleyin. Dinç pipetleme tek hücre içine ayrıştırmaları. Hemasitometre sayma hücre sayısı numaralandırılamıyor. </li><li> İzolasyon adımları, 2-3 gün aralıklarla en fazla iki hafta boyunca aynı kültür şişeler tekrarlanmalıdır. </li><li> İzole makrofajlar 3.1 'de açıklanan büyüme ortamında yetiştirilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık bir birincil kültürünün bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Parankimal hepatositler kültür birkaç gün içinde epitel hücre morfolojisi kaybedersiniz, yozlaşmış ya da fibroblast-benzeri hücreler haline dönüştürmek.Sonra, günde yaklaşık 6 ila 12, faz kontrast parlak, yuvarlak makrofaj benzeri hücreler vigourouly fibroblastik hücre kağıda çoğalırlar. Kültür şişe çalkalanarak, makrofajlar kültür ortama kolayca askıya alınır ve plastik tabaklar sonraki transfer ve inkübasyon makrofaj seçici yapışma (Şekil 3). Makrofaj-benzeri hücreler 8. günde olduğu kadar erken olarak hasat ve sayıları 12 ila 14 gün maksimum seviyelere ulaşmıştır. Fazla 10 6 hücre kültür şişesi (Şekil 3) 10 7 T75 her bir şişesi ortalama toplam hücre verimi sağlayan, en fazla iki hafta boyunca 2 ila 3 gün aralıklarla art arda T75 kültür şişelerinde hasat edilebilir . Izole makrofajların saflık ED-1 (Şekil 4), ED-3, OX-41 (Şekil 4) ve Iba1 9 gibi sıçan makrofaj-spesifik antikorların flowcytometry veya immünsitokimya tarafından değerlendirilir 95 ila% 99, izole hücreler polystylene boncuk aktif fagositoz (Şekil 5), rekombinant GM-CSF, LPS ile stimülasyon, ve çok çekirdekli dev hücreler 9 oluşumu üzerine inflamatuar / anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanması proliferatif yanıt olarak makrofaj tipik özelliklerini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültür makrofaj benzeri hücreler seçici izolasyonu ve saflaştırılması için bir şema. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 sıçan karaciğer hücreleri ve makrofaj gibi hücrelerin çoğalması Primer kültür. Ok multinükleer dev hücreli gösterir. Ölçeği bar = 100 mikron. Elsevier izin İmmünolojik Yöntemleri Dergisi, Vol.360, 47-55 (2010) 9 yayımlanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 sallayarak ve ek yöntemi makrofaj benzeri hücreler seçici izolasyon. Hücreler, matara sallayarak kültür ortamı içine askıya Daha sonra doku kültürü olmayan dereceli plastik tabaklar aktarılır ve 37 ° C'de inkübe Kaplama gibi erken 10 dakika sonra, diğer bulaşıcı fibroblastik hücreler asılı kalırken, çanak yüzeye bağlı makrofaj benzeri hücreler. PBS ile iyice durulandıktan sonra, son derece saf bir makrofaj nüfus elde edildi. Bu hücreler kültür 40 dakika sonra tipik makrofaj morfolojisi kazanmıştır ve mitotik hücrelerin sık sık gözlenmiştir (oklar). Farklı kültür dönemlerde şişeler ele hücre sayıları daha sonra yapılan değişiklikler gösterilmiştir. Değerler üç beş şişeler ortalama ± SD. Deneyler, üç kez tekrarlandı ve veri farklı sembollerle gösterilir. Ölçeği bar = 100 mikron. Elsevier izin İmmünolojik Yöntemleri Dergisi, Vol.360, 47-55 (2010) 9 yayımlanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 sıçan makrofajlar karşı monoklonal antikorlar ile makrofaj benzeri hücreler İmmünositokimyasal boyama. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 makrofaj benzeri hücreler tarafından FITC etiketli mikro Fagositoz.

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
<li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li>
<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

Tüm hayvanlar, hayvan deneyleri için Kurum Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve düzenlemelere göre, Hayvan Sağlığı Ulusal Enstitüsü hayvan tesis tutulur ve ameliyat edildi.

Burada, yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerden gelen makrofajlar elde etmek için basit ve verimli bir yöntem raporu. Bizim sıçan karaciğer hücrelerinin karışık kültür yöntemi makrofajların roman proliferatif aktivite ilk güvenir ve daha sonra makrofajlar 9 olarak biyolojik özellikleri temelinde, bu hücrelerin sonraki izolasyonu ve saflaştırılması. Yetişkin karaciğer hücrelerinin karışık birincil kültür çoğaldı makrofajlar Kupffer veya parankimal hepatositler fraksiyonu kontamine ilişkili hücreler kaynaklanmış olabilir mümkün olabilir. Makrofajlar karışık birincil kültürlerde parankimal hepatosit 10 ve diğer fibroblastik hücreler dönüşüm neden olduğu çevresel değişikliklere yanıt olabilir . Sonuç olarak, yöntemi, gelişmiş donanım ve teknik becerileri kullanarak, sıçan karaciğer cellswithout birincil kültürünün yeterli sayıda ve saflık makrofaj gibi hücreleri izolasyonu sağlar. Buna ek olarak, yalıtım işlemi en fazla iki hafta boyunca aynı kültür şişesi ile tekrar edilebilir. Bu yöntem, diğer memeli türleri için geçerli olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Sodyum pentobarbital çözüm </td><td> KYORITSU Seiyaku </td><td> Somnopentyl Enjeksiyon </td><td></td></tr><tr><td> Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> Etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Wako Saf Chemical Industries, Ltd. </td><td> 032-10534 </td><td> Hücre disosiasyon derece (Lot kontrol gerekli) </td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle minimum esansiyel orta (MEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş bulunuyor Eagle orta (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-6459 </td><td> Yüksek glukoz-tipi </td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Isı 56 ° C de 30 dakika süreyle inaktive. (Lot kontrol gerekli) </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + ücretsiz </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-7522 </td><td> Stok: distile su içinde 100 mM </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-5500 </td><td> Stok: 0,1 N HCl 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre süzgeç </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Mesh boyutu: 100 mikron </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi </td><td> Sumitomo Bakalit Co, Ltd </td><td> MS-21250 </td><td> Yüzey alanı: 75 cm 2 </td></tr><tr><td> Sigara-doku kültürü plastik tabaklar </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kazıyıcı </td><td> Corning Inc. </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Karşılıklı çalkalayıcı </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin karaciğer hücrelerinin karma İlköğretim kültürler makrofajlar yalıtın basit ve etkin yöntem

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer hücreleri karaciğer özel ikamet eden makrofaj ve karaciğer 1-3 fizyolojik ve patolojik fonksiyonları önemli bir rol oynamaktadır. Karaciğer makrofajların izolasyon yöntemleri 4-6 iyi tanımlanmış olmasına rağmen, bu yöntemlerin çoğu böyle bir santrifüj elutriator ve teknik beceri olarak gelişmiş donanım gerektirir. Burada, karaciğer makrofajlar şematik olarak Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık birincil kültürleri, yeterli sayıda ve saflık elde etmek için yeni bir yöntem sağlar. Iki adım perfüzyon yöntemi 7,8 karaciğer hücrelerinin disosiasyon sonra, çoğunlukla parankimal hepatositlerde oluşan bir kısmını hazırlanan ve T75 DMEM ve% 10 FCS.Parenchymal hepatositlerde oluşan kültür ortamı ile doku kültürü şişeleri içine numaralı seribaşı epitel hücre morfolojisi kaybedersiniz birkaç gün içinde bir kültür, yozlaşmış ya da fibroblast benzeri hücreler (Şekil 2) haline dönüştürmek. Kültür, yaklaşık 6 gün ilerledikçe, faz kontrast parlak, yuvarlak makrofaj benzeri hücreler (Şekil 2) fibroblastik hücre kağıda prolifere başlar. Gibi Makrofaj gibi hücrelerin büyümesini devam şişeyi yüzeyinde hücre sayfasını kapsayan ve yaklaşık 12 gün maksimum seviyelere ulaşmak. Kültür şişe çalkalanarak, makrofajlar kolaylıkla kültür ortamı içine askıya alınır. Gibi diğer kirlenmesine neden olan hücreleri askıda kalır makrofajlar seçici yapışma plastik tabaklar sonucu sonraki transfer ve kısa inkübasyon (Şekil 3). PBS ile birkaç durular sonra, ekli makrofajlar hasat edilir. 10&#39;dan fazla 6 hücre, iki haftadan daha uzun (Şekil 3), 2-3 gün aralıklarla aynı T75 doku kültürü şişesi sürekli hasat veya flow sitometri tarafından değerlendirilir olarak izole makrofajların saflık, 95 % 99 sıçan makrofaj-spesifik antikorların (Şekil 4) ile immünsitokimya izole hücrelerinin LPS ile uyarılması ve oluşumu üzerine polystylene boncuk aktif fagositoz (Şekil 5), GM-CSF rekombinant proliferatif yanıt, inflamatuar / anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanması multinükleer dev hücreler 9. Sonuç olarak, bu yöntemi diğer memeli türleri için geçerli olabilir, karmaşık ekipman ve skills.This olmadan, yeterli sayıda ve saflık karaciğer makrofajlar elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar.

Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer hücreleri, karaciğere özgü yerleşik makrofajlardır ve karaciğerin fizyolojik ve patolojik fonksiyonlarında önemli bir rol oynarlar1-3. Her ne kadar ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, karmaşık ekipman veya becerilere ihtiyaç duymadan, sırtan karaciğer hücrelerinin karma primer kültürlerinden birden fazla makrofaj kültürü elde etmektir. Bu işlem öncelikle, kollajenaz perfüzyonu ile erişkin sıçan karaciğer hücrelerinin disosiyasyonu ve ardından parankimal hepatosit hücre fraksiyonunun izolasyonu ile gerçekleştirilir. Daha sonra hücreler, karaciğer hücrelerinin karma primer kültürlerini oluşturmak için büyüme ortamı içeren T 75 doku kültürü flasklarında inkübe edilir.Ardından 10 ila 12 günlük kültürden sonra, makrofajların plastik kaplara aktarılmasını kolaylaştırmak için kültür flaskları çalkalanır ve hücreler, kısa bir inkübasyon süresinin ardından seçici adezyon yoluyla toplanır. Son olarak, aynı T 75 doku kültürü flasklarından iki ila üç günlük aralıklarla iki haftadan fazla bir süre boyunca altı hücrenin 10 katından fazlası tekrar tekrar toplanabilir. Karaciğer makrofajları için izolasyon yöntemleri ayrıntılı olarak tanımlanmıştır.Bununla birlikte, önceki yöntemlerin çoğu santrifüj illüstratörü gibi gelişmiş ekipmanlar ve ileri düzey teknik beceriler gerektirmektedir. Burada, özel bir ekipman veya ileri laboratuvar becerileri gerektirmeyen, yetişkin sarmal karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden yeterli sayıda ve saflıkta karaciğer makrofajları elde etmek için basit ve özgün bir yöntem sunuyoruz. Hayvan diseksiyonu, karaciğer perfüzyonu ve sit hazırlığı; Ulusal Hayvan Sağlığı Enstitüsü'nde Doktor Norco, Yamanaka ve Miko Yoshioka tarafından gösterilecektir.Ardından, Ulusal Tarımsal Biyolojik Bilimler Enstitüsü'nden Dr. Taketo Takeno tarafından kültür ortamındaki karaciğer makrofajlarının izolasyonu ve saflaştırılması gösterilecektir. Öyleyse başlayalım. Sıçan karaciğerinin perfüzyonuna hazırlanmak için, bir şişe yıkama solüsyonunu ve bir şişe kollagenaz solüsyonunu önceden ısıtarak başlayın.Ardından, deri sıkıştırma testi ile sedasyon onaylandıktan sonra, anestezi uygulanmış yetişkin bir erkek sıçanı paslanmaz çelik bir tepsiye yerleştirin ve karın ile göğüs bölgesine %70 ethanol püskürtün. Sonra, diseksiyon makasıyla karnın ortasında küçük bir kesi yapın ve deriyi geriye doğru soyun. Daha sonra makasla karnı açın ve portal venin konumunu doğrulayın.Ardından, cerrahi ipliği portal venin altından geçirin ve ipliği gevşekçe sıkın. Daha sonra, kanın karaciğere geri kaçmasını önlemek için vena cava inferiorun distal kısmını ve mezenterik veni bir mosquito klemple kapatın. Diyaframı makasla keserek göğüs boşluğunu açın ve kalbi ortaya çıkarın; portal vende oftalmik makasla küçük bir insizyon yaptıktan sonra venin içine iki milimetrelik plastik bir kateter yerleştirin ve ipliği kateterin etrafında sıkıca bağlayın.Perfüzyon sistemini önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi ile doldurun ve ardından katetere bağlayın. C iki'de dakikada 10 mililitre hızında perfüzyona başlayın. Aynı anda, disseksiyon makası ile sağ atrium duvarında bir kesi yapın.Perfüzyona 10 dakika boyunca devam edin, ardından perfüzyon solüsyonunu kollagenaz solüsyonu ile değiştirin ve 10 ila 20 dakika boyunca perfüze edin. Dakikada 10 mililitre hızla, steril bir beheri 25 mililitre kollagenaz solüsyonu ile doldurun. Ardından perfüze edilen karaciğeri çıkarın ve dikkatlice beherin içine yerleştirin.Karaciğeri makasla küçük parçalar halinde doğrayın. Oluşan hücre süspansiyonuna 75 milliliters soğuk MEM ekleyin. Nazikçe pipetledikten sonra, süspansiyonu 100 micrometer hücre süzgecinden geçirin.Sindirilmemiş doku fragmanlarındaki bağ dokusunu uzaklaştırmak için filtratı 50 mililitrelik konik tüplere toplayın. Filtratı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri önce 4 °C'de bir dakika boyunca 50 G'de santrifüjleyerek dört kez yıkayın. Frenleme sonrası süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve ardından peleti soğuk MEM içerisinde yeniden süspanse edin; son yıkamadan sonra hücreleri tekrar santrifüjleyerek çöktürün.Karaciğer hücrelerini büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri, santimetrekare başına 6,7 × 10⁴ hücre yoğunluğunda, beş ila 10 adet T 75 doku kültürü flaskına ekimleyin. Kültür flasklarını bir inkübatöre yerleştirin ve büyüme ortamını her iki ila üç günde bir yenileyin.Bir günlük kültürden sonra, parenkimatöz hepatositler balon yüzeyine yayılır ve bir veya iki yuvarlak çekirdeğe sahip, tipik poligonal kopal taşı benzeri morfoloji gösterirler. Birkaç günlük kültür süreci içinde, parenkimatöz hepatositler epitelyal hücre morfolojilerini kaybeder ve daha yassı fibroblastik hücrelere dönüşürler. Altıncı gün civarında, faz kontrastında parlak yuvarlak makrofaj benzeri hücreler, fibroblastik hücre tabakası üzerinde çoğalmaya başlar. Makrofaj benzeri hücrelerin büyümesi 12. gün civarında maksimum seviyelere ulaşır.Fibroblastik hücre tabakası dejenerasyona başladığında, yaklaşık 19. günde makrofaj benzeri hücrelerin sayısı azalır. Bu nedenle, yaklaşık yedi ila 10 günlük kültürden sonra, hücre tabakası üzerinde çoğalmış olan makrofajları, kültür balonlarının 30 dakika boyunca karşılıklı sallanmasıyla kültür ortamına süspanse ederiz. Her bir 100 milimetrelik doku kültürü sınıfı olmayan plastik tabağı, iki adet T 75 balonundan elde edilen ortamla doldurun.Kültür flasklarını büyüme medyumu ile doldurun ve inkübatöre geri yerleştirin. İnkübasyon süresinin ardından plastik kapları 30 dakika boyunca inkübe edin; hücre ekiminden yaklaşık 10 dakika sonra, burada görüldüğü gibi, medyumu aspire ederek ve plastik kabı PBS ile nazikçe durulayarak kapları üç kez yıkayın; böylece makrofaj benzeri hücreler kap yüzeyine tutunmuşken, diğer kontamine fibroblastik hücreler süspansiyon halinde kalır. PBS durulamasının ardından, yüksek derecede saflaştırılmış bir makrofaj popülasyonu elde edilir.Bu şekilde görüldüğü üzere, hücreler 40 dakikalık kültürden sonra tipik makrofaj morfolojisi kazanır ve oklarla belirtildiği gibi mitotik hücreler sıklıkla gözlemlenir. Bu yeni ve yüksek derecede saflaştırılmış makrofaj popülasyonunu toplamak için, yıkanmış hücrelere bir mililitre trip LE Express çözeltisi ekleyin ve kapları tekrar inkübatöre yerleştirip 10 dakika daha bekletin. Bu inkübasyon süresinin ardından, dokuz mililitre büyüme besiyeri ekleyin ve ardından yapışmış makrofajları hücre kazıyıcı ile nazikçe kazıyarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, santrifüj edin ve süpernatanı atın.Bir mililitre büyüme besiyeri ekleyin, yeniden süspande edilen hücre kümelerini kuvvetli pipetleme yoluyla tekil hücrelere ayırın ve hücre sayısını bu grafikte gösterildiği gibi hemositometre ile belirleyin; altı hücrenin 10'dan fazlası, bir T 75 kültür flaskından iki ila üç günlük aralıklarla iki haftadan fazla süre boyunca tekrar tekrar hasat edilebilir ve bu durum T 75 kültür flaskı başına toplam 10⁷ hücre verimi sağlar. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, izole edilen hücreler CD 68 veya ED 1 ve CD 1 72 A veya OX 41 gibi sıçan makrofaj antijenlerine karşı monoklonal antikorlar ile immün boyanmıştır. Bu hücreler, FITC işaretli mikroboncukların aktif fagositozu gibi makrofajların fonksiyonel özelliklerine sahipti.Bu videoda, yetişkin kırmızı karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden makrofaj elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sunduk. Prosedürümüz karmaşık ekipmanlar veya beceriler gerektirmez, ancak aynı fırça kültüründen tekrar tekrar toplanabilen yeterli sayıda saf makrofaj sağlar. Bu yöntem diğer memeli türlerine de uygulanabilir.Videoyu izlediğiniz için teşekkür eder, gelecek deneylerinizde başarılar dileriz. Saygılarımızla.

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Öğrenin, karma karaciğer hücre kültürlerinden makrofaj izolasyonunu. Bu basit yöntem, karmaşık ekipman gerektirmeden yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Daha fazla video keşfet