Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, karmaşık ekipman veya becerilere ihtiyaç duymadan sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden çoklu makrofaj kültürleri elde etmektir. Bu, ilk olarak yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin kollajenaz perfüzyonu ile ayrışması, ardından parankimal hepatosit hücre fraksiyonunun izolasyonu ile elde edilir. Daha sonra, hücreler T 75'te inkübe edilir, karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerini oluşturmak için doku kültürü şişeleri büyüme ortamı ile şişelenir.

Daha sonra 10 ila 12 günlük kültürden sonra, kültür şişeleri, makrofajların plastik kaplara transferini kolaylaştırmak için çalkalanır ve daha sonra kısa bir inkübasyon süresinden sonra seçici yapışma ile hasat edilir. Son olarak, altı hücrenin 10'undan fazlası, iki haftadan fazla bir süre boyunca iki ila üç günlük aralıklarla aynı T 75 doku kültürü şişelerinden tekrar tekrar toplanabilir. Karaciğer makrofajları için izolasyon yöntemleri iyi tanımlanmıştır.

Bununla birlikte, önceki yöntemlerin çoğu, santrifüjlü illüstratör ve rafine teknik beceriler gibi gelişmiş ekipman gerektirir. Burada, erişkin sarılmış karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden yeterli sayı ve saflıkta karaciğer makrofajları elde etmek için özel ekipman veya ileri laboratuvar becerileri gerektirmeyen basit ve yeni bir yöntem sunuyoruz. Hayvan diseksiyonu, karaciğer perfüzyonu ve sitlerin hazırlanması, Ulusal Hayvan Sağlığı Enstitüsü'ndeki doktorlar Norco, Yamanaka ve Miko yoshioka tarafından gösterilecektir.

Daha sonra karaciğer makrofajlarının kültürel risklerden izolasyonu ve saflaştırılması, Ulusal Tarımsal Biyolojik Bilimler Enstitüsü'nden Dr.Taketo Takeno tarafından gösterilecektir. Öyleyse başlayalım. Sıçan karaciğerinin bolluğuna hazırlanmak için, bir şişe yıkama solüsyonu ve bir şişe kollajenaz solüsyonunu önceden ısıtarak başlayın.

Daha sonra deri çimdikleme ile sedasyonu onayladıktan sonra, anestezi uygulanmış yetişkin bir erkek fareyi paslanmaz çelik bir tavaya koyun ve karnına ve göğsüne %70 etanol püskürtün. Daha sonra, diseksiyon makasıyla karnın ortasında küçük bir kesi yapın ve cildi geri soyun. Ardından karnı makasla açın ve portal venin yerini onaylayın.

Ardından, cerrahi ipliği portal damarın altından geçirin ve ipliği gevşek bir şekilde sıkın. Daha sonra karaciğere kan akışını önlemek için inferior vanoc kava ve mezenterik venin distal kısmını bir sivrisinek kıskacı ile klempleyin. Diyaframı makasla keserek göğüs boşluğunu açın ve göz makası ile portal damarda küçük bir kesi yaptıktan sonra kalbi ortaya çıkarın, damar içine iki milimetrelik plastik bir kateter yerleştirin ve ipliği kateterin etrafına sıkıca sıkın.

Ön ısıtma yıkama solüsyonu ile bir perfüzyon sistemi yükleyin ve ardından katetere bağlayın. C iki'de dakikada 10 mililitre hızında perfüzyona başlayın. Aynı zamanda, diseksiyon makası ile sağ atriyum duvarında bir kesim yapın.

Füzyona 10 dakika devam edin, ardından füzyon solüsyonunu kollajenaz solüsyonuna geçirin ve 10 ila 20 dakika perfüze edin. Dakikada 10 mililitre oranında, steril bir kabı 25 mililitre kollajen çözeltisi ile doldurun. Daha sonra perfüz karaciğerini çıkarın ve dikkatlice behere yerleştirin.

Karaciğeri makasla küçük parçalar halinde kıyın. Elde edilen hücre süspansiyonuna 75 mililitre soğuk MEM ekleyin. Nazik pipetlemeden sonra, süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün.

Sindirilmemiş doku parçalarındaki bağ dokusunu çıkarmak için, süzüntüyü 50 mililitrelik konik tüplere toplayın. Süzüntüyü 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri önce dört santigrat derecede bir dakika boyunca 50 Gs'de döndürerek hücreleri dört kez yıkayın. Kopma ile, süpernatanı dikkatlice atın ve ardından peleti soğuk MEM'de yeniden süspanse edin ve son yıkamadan sonra hücreleri tekrar döndürün.

Karaciğer hücrelerini büyüme ortamında yeniden askıya alın. Şimdi hücreleri, santimetre kare başına 6.7 kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda beş ila 10 T 75 doku kültürü şişelerine tohumlayın. Kültür şişelerini bir inkübatöre yerleştirin ve büyüme ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin.

Bir günlük kültürden sonra, parankimal hepatositler şişe yüzeyine yayılır ve bir veya iki yuvarlak çekirdekli tipik poligonal kopal taş benzeri morfoloji gösterir. Kültürden birkaç gün sonra, parankimal hepatositler epitel hücre morfolojilerini kaybeder ve daha düzleştirilmiş fibroblastik hücrelere dönüşür Altıncı gün civarında, faz kontrastı, parlak yuvarlak makrofaj benzeri hücreler fibroblastik hücre tabakası üzerinde çoğalmaya başlar. Makrofaj benzeri hücrelerin büyümesi 12. gün civarında maksimum seviyelere ulaşır.

Makrofaj benzeri hücrelerin sayısı, fibroblastik hücre tabakasının dejenere olmaya başladığı 19. gün civarında azalır. Bu nedenle, kültürden yaklaşık yedi ila 10 gün sonra, makrofajlar yeniden süspanse edildikten sonra kültür şişelerinin 30 dakika boyunca karşılıklı olarak çalkalanmasıyla hücre tabakası üzerinde çoğalan makrofajları kültür ortamına askıya alıyoruz. 100 milimetrelik doku kültürü sınıfı plastik tabakların her birini iki T 75 şişesinden gelen ortamla oynayın.

Kültür şişelerini büyüme ortamı ile doldurun ve inkübatöre geri koyun. Kuluçka süresinden sonra plastik tabakları 30 dakika boyunca inkübe edin, ortamı aspire ederek bulaşıkları üç kez yıkayın ve diğer kontamine fibroblastik hücreler askıda kalırken makrofaj benzeri hücreleri kapladıktan 10 dakika sonra burada görüldüğü gibi plastik kabı PBS ile nazikçe durulayın. PBS durulamasından sonra, yüksek oranda saflaştırılmış bir makrofaj popülasyonu elde edilir.

Bu şekilde görüldüğü gibi, hücreler 40 dakikalık kültürden sonra tipik makrofaj morfolojisi kazanır ve mitotik hücreler oklarla gösterildiği gibi sıklıkla gözlenir. Bu yeni, yüksek oranda saflaştırılmış makrofaj popülasyonunu bir mililitre yolculukta toplamak için, yıkanmış hücrelere LE Express solüsyonu ekleyin ve bulaşıkları 10 dakika daha inkübatöre geri koyun. Bu inkübasyon süresinden sonra, dokuz mililitre büyüme ortamı ekleyin ve daha sonra ekli makrofajları hücre kazıyıcı ile nazikçe kazıyın ve 15 mililitrelik bir konik tüp santrifüjüne aktarın ve süpernatanı atın.

Büyüme ortamının bir mililitresini ekleyin, yeniden askıya alınan hücre kümelerini kuvvetli pipetleme ile tek hücrelere ayırın, hücre sayısını bu grafikte gösterildiği gibi hemo sitometre ile numaralandırın, altı hücrenin 10'undan fazlası bir T 75 kültür şişesinden iki haftadan fazla bir süre boyunca iki ila üç günlük aralıklarla tekrar tekrar hasat edilebilir, T 75 Kültür şişesi başına toplam 10 ila yedi hücre verimi sağlar. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, izole edilen hücreler, CD 68 veya ED bir ve CD 1 72 A veya OX 41 gibi sıçan makrofaj antijenlerine karşı monoklonal antikorlarla immün boyadır. Bu hücreler, FITC işaretli mikroboncukların aktif fagositozu gibi makrofajların fonksiyonel özelliklerine sahipti.

Bu videoda, erişkin kırmızı karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerinden makrofaj elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sunduk. Prosedürümüz karmaşık ekipman veya beceriler gerektirmez, ancak aynı pirinç kültüründen tekrar tekrar hasat edilebilecek yeterli sayıda saf makrofaj sağlar. Bu yöntem diğer memeli türlerine de uygulanabilir.

Videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz ve gelecekteki deneylerinizde iyi şanslar. Şerefe.