Name: Aktivitesi miktarının Cis Düzenleme Elemanları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin fare retina eksplant elektroporasyonu ile cis-düzenleyici elemanların aktivitesini nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem gen düzenlemesi ve görsel süreçler üzerine nörobilim araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar elektroporasyon odasının bölümünde açıklayan inşaat ile Karen Lawrence ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Elektroporasyon odasının İnşaatı <ol><li> 3.2mm aralıkla (Harvard Apparatus # 45-0105) (Şekil 2A) microslide, BTX Model 453 sipariş edin. Metal raylar tamamen slayt alt mühürlü olmalıdır. </li><li> Dremel aleti, plastik bir mikrosantrifüj tüp raf kapalı bir kolu kesmek için kullanın. Kolu 0.8cm uzunluğunda, yüksekliği 0.6cm, genişlik 0.3cm (Şekil 2B): Her aşağıdaki boyutları ile 5 küçük dikdörtgen parçalar halinde kesin. Bu plastik parçaları, yeniden kullanılabilir ayırıcılar microslide odasında ayrı ayrı kuyu kalıp kullanılacaktır. </li><li> Microslide metal raylar arasında eşit aralıklarla plastik ayırıcılar yerleştirin. Ayırıcılar (Şekil 2C) rahatça sığacak. </li><li> P200 pipet ucu kapalı Kes, 3ml şırınga ucu uygun ve% 100 silikon kauçuk akvaryum dolgu ile şırınga doldurun. Dolgu ile plastik ayırıcılar arasındaki boşlukları doldurun. Kabarcıklar mastik fiş ve microslide tabanı arasında oluşturduğu alt boşlukları doldurmak için emin olun. </li><li> Ayırıcılar yerinde tutulur, böylece plastik ayırıcılar tepesinde metal bir çubuk yerleştirin ve bağlayıcı klipleri ile tutturmak mastik kurur (Şekil 2B-E). Mastik gecede kurumasını bekleyin. </li><li> Bağlayıcı klipleri, metal çubuk ve plastik ayırıcılar (Şekil 2F) çıkarın. Metal raylar üst kapalı mastik temizlemek için bir neşter bıçak kullanın. Microslide incelemek ve kabarcıklar, silikon baraj altındaki mevcut olduğundan emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Çıplak metal kuyuların içinde maruz kaldığı bu tür kuyuların oluşmuş olabilecek herhangi bir dolgu filmi çıkarın. Su ile doldurun ve bitişik iyi (ler) suyun içine sızıntı olmadığından emin olun. Tüm kuyuları için tekrarlayın. </li><li> Bitmiş microslide plastik tabak çanağı yan pencere (Şekil 2G) komşu metal direkleri ile uyar; elektrotlar sonunda metal direkleri eklenecektir. </li></ol> 2. DNA hazırlığı <ol><li> Plazmid DNA, buz üzerinde bir 1.5mL mikrosantrifüj tüp ekleyin ve saf su ile 150μl ses getirmek. Çoklu plazmid türlerin ortak elektroporasyon (örneğin, bir deney DsRed inşa ve kontrol GFP inşa) için kombine olabilir. Tüp DNA kısım son hacmi 60μl olacağını akılda tutmak için DNA miktarını hesaplarken. Tipik olarak, her yapı 0.5μg/μl son bir konsantrasyonda kullanılır. </li><li> 15μl 3M sodyum asetat (pH 5.2) ve 450μl% 100 etanol eklenerek DNA çöktürün. Karıştırmak için birkaç kez çevirin ya da tüp dokunun. </li><li> 4 DNA Spin ° C, 13.200 rpm, 30 dakika boyunca. Pelet% 70 etanol ile yıkayın, sonra tekrar 4 aşağı dönmeye ° C, 13.200 rpm, 15 dakika boyunca. Hava kuru pelet yarı şeffaf kadar, yaklaşık 7 dakika sonra 54μl steril su tekrar süspansiyon haline getirin. 6μl steril 10X PBS (pH 7.4) ve karışımı ekleyin. </li></ol> 3. Göz toplama <ol><li> Elektroporasyon odası ve% 70 etanol ile tüm aletleri sterilize edin. Göz toplama ve diseksiyon bir doku kültürü kaputu gerekmez iken, eldiven ve etanol ve steril koşullar işlem boyunca korumak için çalışır benchtop dezenfekte edin. </li><li> 3ml orta ve biri ile her iki 35mm yemekler: diseksiyon orta (: F12, 100U/ml penisilin, 100μg/ml streptomisin, 0.29mg/ml L-glutamin ve 5μg/ml insülin 01:01 DMEM oranı) ile Petri kapları hazırlayın 6ml orta ile 60mm çanak. Bu adım, bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır. </li><li> Yeni doğmuş bir baş ve boyun (postnatal gün 0)% 70 etanol ile yavru fare dezenfekte edin. Makas ile hızlıca başını kesmek ve steril bir 100mm çanak baş aktarmak. </li><li> Gözleri ortaya çıkarmak için küçük makas ile kafa derisi kesilip. Kavisli bir forseps yavaşça yörüngesinin göz kaşık kullanın ve 35mm çanak diseksiyonu orta içeren bir göz. Bu düşük güçte bir diseksiyon mikroskobu altında gözleri kaldırmak için yararlı olabilir. </li><li> Tüm gözler toplanıncaya kadar 3.3 ve 3.4 adımları tekrarlayın. Diseksiyonu orta gözleri diseksiyon ise oda sıcaklığında tutun. DNA kısım başına 3-4 gözleri gerekecektir. </li></ol> 4. Retina diseksiyonu <ol><li> % 70 etanol, jilet ve steril bir plastik transfer pipetin wrapper dezenfekte etmek için kullanın. Bıçak ile pipet ucu kapalı bir bütün göz emmek böylece kesin. Pipet kullanılmadığı zaman plastik ambalajında ​​saklayın. </li><li> 60mm, 35mm çanak çanak bir göz aktarın. Yüksek güçte diseksiyon mikroskobu altında, göz yüzeyinde, ekstraoküler kas ve yağ olarak, herhangi bir doku kaldırmak için ince forseps kullanabilir. Daha sonra, optik sinir üssünde kapalı kısma çıkarın. </li><li> Retinanın izole etmek için, küçük bir delik prize ilimbus sklerasına n. Forseps iki çift uçlu bir delik (retina yüzeye teğet) yerleştirin ve hafifçe açmak sklera / RPE gözyaşı. Albino farelerde, sklera ve RPE retina dokusu, homojen mat gri renkte parlak akraba görünür. Pigmentli farelerde, RPE siyahtır. Objektif bir yerde bırakın. </li><li> Disseke retinanın orta ile diğer 35mm çanak içine taşımak için transfer pipet kullanın. </li><li> Tüm gözler disseke kadar 4.2 ve 4.4 için gerekli adımları tekrarlayın. </li><li> Electroporate için hazır olana kadar 37 ° C doku kültürü inkübatör retina saklayın. </li></ol> 5. Elektroporasyon için hazırlanması <ol><li> Orta 35mm yemekleri hazırlayın. Electroporated her DNA kısım için, diseksiyon orta bir çanağı ve kültür ortamı, bir çanak (diseksiyon orta artı% 10 FBS) ihtiyacınız olacak. Uygun yemekler Etiket. </li><li> P200 pipet ve steril 1X PBS elektroporasyon çanak odaları yıkamak için kullanın. Her odasına 60-100μl bir hacme sahiptir. Her iki meclisin de üç kez yıkayın. </li><li> DNA alikotları odaları doldurun. Herhangi bir kullanılmayan odaları 60μl 1X PBS ile dolu olmalıdır. Elektroporasyon çanak elektrotlar bağlayın. </li><li> Elektroporatör aşağıdaki ayarları kullanın: modu, AG, voltaj, 30V, darbe uzunluğu, 50 msn, bakliyat, 5 sayısı aralığı 950 msn; polarizasyon, tek kutuplu. </li></ol> 6. Elektroporasyon <ol><li> Ince forseps lens retina kavramak ve elektroporasyon odaları içine aktarmak için kullanın. Her odasına 3-4 fare retina (Şekil 3) kadar tutar. </li><li> Objektif, pozitif elektrot için metal çubuğu ile içiçedir retina sıraya forseps kullanın. Odasından bir sonraki DNA üzerinden devam önlemek için her transferinden sonra bir Kimwipe forseps temizleyin. </li><li> Tüm retina hizalanır sonra, Elektroporatör üzerinde "Başlat" tuşuna basın. Küçük kabarcıklar, negatif elektrot için bağlı metal çubuğu oluşturmalıdır. </li><li> Elektrotlar çıkarın ve kapatın Elektroporatör. </li><li> Forseps yavaşça odanın duvarları uzak retina taşımak için kullanın. </li><li> Diseksiyonu orta içeren 35mm yemekleri odalarından retina aktarmak için steril bir transferi pipet kullanın. </li><li> Her iki meclisin de steril 1X PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra steril su ile durulayın. % 70 etanol ile Sprey çanak. </li></ol> 7. Kültür için filtreler retina yerleştirilmesi <ol><li> Kültür ortamı içeren 35mm yemekleri retina aktarmak için bir transfer pipet kullanın. </li><li> Etiket ve steril 6-iyi bir kültür plaka kuyu 3ml kültür ortamı ile her iyi doldurun. </li><li> Orta tepesine kadar yuvarlak whatman Nuclepore filtreler, parlak tarafı, her iyi steril forseps kullanın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, filtre, lens tarafı aşağı üzerine retina aktarmak için steril bir transferi pipet kullanın. Retina toprakları objektif-yan-up, pipet ve tekrar yere girişimi ile pick up. 4 retina fazla bir filtre yerleştirin ve her bir retina çevresindeki orta damlacıkları diğer damlalarla ayrı kalacağından emin olun. Diğer protokolleri önce bu adımı 9 lens çıkarılması için çağrıda rağmen, bozulmamış lens ile kültür retina unutmayın. </li><li> 37 kültür plakasına yerleştirin ° C doku kültürü inkübatör (% 5 CO 2) ve zaman istenilen miktarda, genellikle sekiz gün için büyümek. Bir ortam değişikliği, uzun kültürü süreler için gerekli olabilir, ancak bizim deneyim, orta değişen sekiz günlük kültür döneminde gereksizdir. </li></ol> 8. Hasat ve floresan retina eksplantlar flatmounting <ol><li> % 4 paraformaldehid / 1X PBS ile her kuyuda kültür ortamı değiştirin. Retina, filtrelere takılıp kalırsa, filtre kapalı retina kabuğu hafifçe üzerindeki filtreler çevirmek için forseps kullanabilir ve. Için paraformaldehid de 30 dakika inkübe edin. oda sıcaklığında. Floresan beyazlatma önlemek için ışık retina koruyun. </li><li> Retina 1X PBS içinde 10 dakika boyunca iki kez durulayın. </li><li> Retina PBS küçük bir damla, bir cam slayt üzerine aktarmak için bir pipet kullanın. Electroporated yan böylece floresan bir diseksiyon mikroskobu altında (yani, objektif tarafı aşağı) retina çevirmek için forseps kullanabilir. </li><li> Yeri cam slayt köşeleri ezilmiş lamelleri (yaklaşık 1-2 mm çapında cam kırıkları) yapılan "feet"; bu ayaklar retinanın düzleştirme önlemek. Ayakları üzerinde retina ve dinlenmeleri kapsar ve böylece slayt üzerinde sağlam bir cam lamel yerleştirin. Gerekirse, slayt ve lamel arasında daha PBS eklemek için bir pipet kullanın. </li></ol> 9 - Görüntüleme ve flatmount floresans ölçümü <ol><li> Bir kullanın.floresan bileşik mikroskop, görüntü kırmızı ve yeşil kanalları düşük güç (4X objektif) flatmounted retinanın bir siyah-beyaz kamera ile donatılmıştır. Tüm retina floresan yoğunluklarına göre etkinleştirmek için, belirli bir floresan kanal için aynı pozlama süresi ile görüntülü olmalıdır. Herhangi bir resmi piksel doymuş, ya da başka bir doğru kantifikasyon imkansız olacaktır emin olun. İhracat görüntüleri TIFF formatında gri tonlama. </li><li> ImageJ yazılımı (retina (yani .., kırmızı kanalı ve yeşil kanal) görüntüyü açın <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). Bu yazının uğruna, yeşil flüoresan kanal (GFP protein), deney tüm retina üzerinde sabittir kontrol yapıdır. Kırmızı floresan kanal (DsRed protein), retina her set için değişir deneysel bir yapıdır. Gri tonlamalı görüntüler olmalıdır. </li><li> ImageJ, kontrol yeşil görüntüyü seçmek ve çapı 100 birim (Analiz / Araçlar / ROI yöneticisi / / belirtin) ile ilgi bir daire belirtin. Toplam sekiz çevreler oluşturmak için bu daire (ROI yöneticisi / Ekle) çoğaltın. Kaçınarak, retina ve lens (Şekil 4A) üzerinde bölgenin dış kenarları düzgün electroporated beş bölge seçmek için çevrelerde 1-5 taşıyın. Ayrıca, retina / eşiğe ölçmek için objektif üç bölge dışında (daireler 6-8) seçin. Kırmızı görüntü seçin, ROI yöneticisi kutusu "Tümünü göster" ve tekrar kontrol edin kutunun kontrol edin. Tüm sekiz daire kırmızı görüntü görünmelidir. De seçin tüm daire ROI yöneticisi koordine eder. </li><li> Ölçümleri 1-8, 1-5, kırmızı retina ölçümleri ve 6-8 kırmızı zemin ölçümleri görünmelidir; kırmızı bir görüntü seçildiğinde, (ROI yöneticisi / Tedbir) ilgi her daire için ortalama piksel değeri kaydetmek. Yeşil bir görüntü seçin ve ortalama piksel değeri kaydetmek; ölçümleri 9-16, 9-13, yeşil retina ölçümleri ve 14-16 yeşil arka plan ölçümleri görünmelidir. Excel'e analizi için ölçüm verileri (Şekil 5) kopyalayın. </li><li> Ortalama üç kırmızı hem de arka plan ölçümleri ve yeşil kanallar. Kırmızı kanal beş retina ölçümlerin her kırmızı arka plan ortalama çıkarma, yeşil kanal için tekrarlayın. Her bir retina bölge çıkarları için, kontrol yeşil seviyesi (Şekil 5) deneysel kırmızı seviyesi normale döndürmek için, arka plan çıkarılır yeşil ölçümü ile arka plan çıkarılır kırmızı ölçüm bölün . </li><li> Belirli bir DsRed oluşturmak (örneğin, retina kez 3 ayrı retina başına 5 ölçüm) için normalize bütün ölçümlerin ortalama ve standart sapma belirleyin. Kantitatif farklı günlerde gerçekleştirilen electroporations sonuçları karşılaştırmak için, her zaman her elektroporasyon set bir "standart" DsRed / GFP yağış içerir. Bu ifade seviyesine normalize deneyler göreceli ifade değerleri mukayese edilebilir "standart." </li></ol> 10 Temsilcisi Sonuçlar: Retina yüzeyinin 1 / 3 1 / 4 çapında DNA yapı (lar) (Şekil 4A) ifadesi iyi bir elektroporasyon sonuçları. Özellikle çubuk fotoreseptör verimli transduced olduğundan, bu tekniğin fotoreseptör spesifik promotor aktivitesi (Şekil 4B) ölçülmesi için idealdir. Daha önce özel çubuk Rho ve Gnat1 lokusların 10 organizatörü varyantlarının aralığını ölçmek için bu yaklaşımı kullanmıştır. Biz neredeyse 300 kat aralığı üzerinde promotor aktivitesi ölçmek mümkün olduğunu bulundu. Şekil 5, tek bir electroporated retinanın bir örnek veridir. Bu özel örnekte, deneysel inşa pNrl (1.1kb) DsRed kırmızı kanal ölçüldü ve kontrol inşa pNrl (3.2kb)-GFP yeşil kanal ölçüldü. PNrl için tam bir veri kümesi (1.1kb) DsRed bir yapı, bu şekilde ölçülen 6-9 retina oluşacak ve tüm değerleri "GFP için normalize DsRed" standart sapma göre hesaplanır olacaktır. PNrl ifade seviyesi (1.1kb) DsRed için karşılaştırarak olsaydı, örneğin, pNrl (0.8kb) DsRed, daha sonra her iki yapıları aynı GFP kontrolü (örneğin, pNrl (3.2kb) electroporated olması gerekir - GFP) ve görüntülü aynı pozlama süreleri. Bu, bir standart DsRed / GFP elektroporasyon (örneğin, pNrl (3.2kb) dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP) her gün farklı günlerde toplanan havuzu veri mümkündür . Her deneysel bir yapı için, normalize DsRed seviyesi, daha sonra "standart" (pNrl (3.2kb) dsRed) normalize DsRed seviyesine normalize olacaktır. Biz burada açıklamak teknik fotoreseptör Cres 10,13 faaliyet ölçülmesi için özellikle yararlıdır.Hücre tipi özel cis-düzenleyici aktivite gibi bipolar hücreler 14 gibi nadir retinal hücre tiplerinde de sayılabilir veriler, ancak bu genellikle sayısal ilgi alanlarında flatmount hazırlıkları ziyade dikey kesitler seçilmiş olması gerekir. Aynı, fotoreseptör ve bipolar hücreleri gibi çok sayıda hücre tipleri ifade sürücü Cres doğrudur. Deneysel prosedürleri, aksi takdirde benzer. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 retina eksplant elektroporasyon prosedürü genel bakış. Öncelikle, tüm gözler postnatal gün 0 fare yavrular izole edilir ve retina (P1) disseke. İkincisi, retina, DNA ve electroporated (P2) ile dolu odalarına yerleştirilir. Üçüncü olarak, retina filtreler yerleştirilir ve sekiz gün (P3) kültüre. Dördüncüsü, retina eksplantlar, sabit kızaklar üzerinde monte edilmiş ve görüntülü vardır. Floresans şiddeti ImageJ yazılımı (P4) ile ölçülür. Beşincisi, ImageJ veriler çeşitli rehberleri (P5) faaliyet farkı ölçmek için bir elektronik tablo programı işlenir. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 elektroporasyon çanak yapımı. A) Harvard Apparatus, BTX modeli 453 (katalog # 45-0105) Değiştirilmemiş microslide odası. B) Bir Dremel aleti, plastik bir tüp raf kapalı kolu kesmek için kullanılır. : 0.8cm uzunluk, yükseklik 0.6cm, genişlik 0.3cm kolu aşağıdaki boyutları ile dikdörtgen ayırıcılar içine kesilir. C) plastik ayırıcılar, eşit aralıklarla microslide odasına donatılmıştır. Akvaryum mastik aralayıcılar (gösterilmemiştir) arasındaki boşluklar içine enjekte edilir. D) Bir metal çubuk ayırıcılar üzerine yerleştirilir. E) bar ve ayırıcılar gecede mastik kurur olarak her şeyi yerinde tutmak için bağlayıcı klipleri slayt üzerine kenetlenir. F) ayırıcılar kaldırılır ve kuyulardan su geçirmez olduğunu sağlamak için test edilmektedir. G) bitmiş slayt ile plastik tabak çanağı yan pencere komşu metal çubuklar içine sığar. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 retina ile elektroporasyon çanak diyagramı. Odaları DNA çözümleri (bir defada en fazla beş farklı çözümler) ile doldurulur. Beş odalarının her birinde üç ya da dört retina uyacak; retina odaları ve odaklı objektif, pozitif elektrot için metal çubuğu yaslanmış şekilde yerleştirilir. Negatif yüklü DNA molekülleri elektrik akımı retina hücreleri içine taşımak için neden olacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Flatmount retina floresan düzeyleri Şekil 4 A) ImageJ ölçüm. , Bu görüntüleri sadece bilgi amaçlıdır için renkli olduğuna dikkat edin; DsRed (deneysel) ve GFP (kontrol) kanalları ImageJ yazılım açıldı flatmount gri tonlamalı görüntüler. Beş ölçüm daireler (1 ile 5), kenarları ve lens (noktalı çizgiler) kaçınarak, düzgün electroporated bölgeler üzerinde yerleştirilir. Üç ölçüm çevreler (6 ile 8 arasındaki), arka plan floresan düzeylerini belirlemek için retina dışına yerleştirilmiş. B), yüksek güçte bir electroporated retina eksplant kesitsel görüntüler. Eksplant 4 gecede% 30 sucrose/1X PBS cryoprotected postnatal gün 8 ° C, OCT gömülü sabit ve 12μm az cryo-kesitli oldu. Floresan yapıları pNrl (1.1kb) DsRed ve pNrl (3.2kb)-GFP fotoreseptör hücrelerinin dış nükleer tabaka (onl) olarak ifade edilir. INL, iç nükleer tabaka; GCL, ganglion hücre tabakası. <img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Excel kullanarak floresan verilerin işlenmesi. 1. adımda, her bir ölçüm daire için ortalama piksel değeri tablo (hücre B3-B12, F3, F5, H3-H5) kopyalanır. Ölçümler # 1-5 DsRed retina değerleri ve 6-8 DsRed arka plan değerleri; ölçümleri # 9-13 GFP retina değerleri ve 14-16 GFP arka plan değerlerdir. Not ölçüm # 1 ve # 9 ölçümleri # 2 ve # 10 gibi, aynı ölçüm daireye karşılık gelir ve bu. 2. adımda, DsRed ve GFP kanallar için ortalama temel değeri (hücre F6, H6) hesaplanır. 3. adımda, her retina ölçüm ortalama arka plan çıkarılır (hücre C3-C12). 4. adımda, her DsRed ölçüm karşılık gelen GFP ölçümü (hücre D3-D7) normalize arka plan çıkarılır.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
<li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Genomic+regulatory+systems+%3A+development+and+evolution%22">Genomic regulatory systems : development and evolution</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22Genes+%26+signals%22">Genes & signals</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).</li>
<li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li>
<li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li>
<li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li>
<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
<li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li>
</ol>

Eksplant elektroporasyon gelişmekte olan fare retinada cis düzenleyici aktivite nicel basit bir araçtır. Fare transgenesis ile cis-düzenleyici analizi ile karşılaştırıldığında, elektroporasyon, sadece yeni doğan fare yavrular, DNA, diseksiyon aletleri ve elektroporasyon / doku kültürü ekipmanları gerektiren, çok ucuzdur . Bu çok daha az zaman alıcı: bir deneyde, görüntüleme ve veri analizi için deney sonunda hazırlık süresi sadece birkaç saat, sekiz gün bir kültür dönemi, bir kaç saat gerektirir. Gerçek retina dokusunun kullanılmaktadır Eksplant elektroporasyon da hücre kültürü-tabanlı cis-düzenleyici analiz daha üstün. Retina eksplant oldukça normal olarak gelişir kültür-fotoreseptör dış segmentleri ayrıntılı başarısız olmasına rağmen, üç ayrı cep katmanları (dış nükleer tabaka, iç nükleer tabaka, ganglion hücre tabakası) oluşturur. Bir diğer avantajı da eksplant elektroporasyon yüksek tekrarlanabilir. Hatta farklı günlerde farklı retina içine electroporated aynı yapıları, aynı göreceli ekspresyon düzeyleri genellikle sonuç. Ayrıca, electroporated plazmid episomally çekirdeğinde muhafaza edilmesi düşünülen ve kromozomlar içine dahil olmadığı için, onlar transgenik farelerde yapılan cis düzenleyici analiz altüst aynı entegrasyon site etkileri tabi görünmez yapmak. Eksplant elektroporasyon çeşitli sınırlamalar var. İlk olarak, hücre döngüsü hala sadece hücreleri verimli elektroporasyon 15 transduced olabilir. P0, çubuklar ve daha sonra doğan diğer retina hücre tipleri (bipolar hücreleri, amacrine hücreler, K Müller glia), bu yöntemle hedeflenen ana hücre popülasyonlarının. P0 elektroporasyon koni fotoreseptörlerin Elektroporasyon 16 rapor ancak verimliliği düşük olduğu görülmektedir. Ikinci bir sınırlama ötesinde bu eksplant kültür retinanın ilerici malformasyon iki hafta sonuçları ve bu nedenle tavsiye edilmez. Bölüm 9 açıklandığı gibi organizatörü kantifikasyon geç timepoints gerekiyorsa, ancak, bir in vivo elektroporasyon 9 istenilen timepoint retina diseksiyon ile takip yapılabilir olabilir disseke retinanın düz montaj, ve ölçülmesi. Üçüncü bir sınırlama Bu testte sadece orta yüksek verimli olmasıdır. Yüz yapıları tek bir deneyde test hücre kültürü tabanlı testlerin aksine, bu protokolde tanımlanan teknikle inşa ortalama bir bütün fare retinanın en az gerektirir. Böylece, sadece bir kaç düzine yapıları makul bir günde electroporated olabilir. Bugünkü yaklaşım kullanarak promotor aktivitesinin ölçülmesi açısından ek bir ihtar, özellikle çok güçlü destekçileri assaying, GFP kanal içine DsRed floresan &#39;kanama&#39; bir potansiyel olduğunu. Bu nedenle emisyon spektrumu bu GFP kısmen örtüşmektedir DsRed. Bu sorunu aşmak için, optimum emisyon filtreleri DsRed ve GFP arasındaki spektral örtüşme en aza indirmek olmalıdır. Gibi optimize filtre setleri mevcut değildir, başka bir potansiyel çözüm GFP yerine bir mavi-kaymıştır floresan protein (örneğin, BFP veya CFP) kullanmak olacaktır .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Elektroporasyon çanak, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Değişiklikler için protokol bölüm 1 </td></tr><tr><td> % 100 silikon kauçuk akvaryum çimento </td><td> Perfecto Üretim </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastik mikrotüp raf </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Sadece rafa kolu olacak </td></tr><tr><td> Dremel aleti </td><td></td><td></td><td> Plastik tüp raf kapalı kolu kesmek için </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X konsantrasyonu </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> 1000X hisse senedi için, 5mM HCl ve filtre sterilize 5mg/ml az tekrar süspansiyon </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Kare dalga Elektroporatör </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore filtreleri </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatör </td><td></td><td></td><td> 37 ° C,% 5 CO 2 </td></tr><tr><td> Cam lamelleri # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> Kalın 0.16mm </td></tr><tr><td> Floresan bileşik mikroskop, kamera ile donatılmış </td><td></td><td></td><td> Kamera monokromatik (Hamamatsu örneğin, ORCA-ER kamera) olmalıdır . </td></tr><tr><td> EGFP / bileşik mikroskop için DsRed filtre seti </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 86007 </td><td> Bu filtre, kırmızı ve yeşil chanenels arasındaki en aza indirir bleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJ Yazılım </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

aktivitesi miktarının cis</emeksplant elektroporasyon fare retina> düzenleme elemanları

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Kısa cis-düzenleyici unsurlar (Cres) bağlanarak hücresel gen ağları içinde Transkripsiyon faktörleri Spatiotemporal desen ve hedef genlerin ifade düzeyleri kontrol upstream yalan, genomik DNA uzanır (~ 300-600 bp), alt ya da içinde kontrol eden genlerin intronlar. Cres (yani, arttırıcılar / yararlanıcı grup) genellikle 1-3 transkripsiyonel aktivatörleri ve repressörler için birden fazla kümelenmiş bağlanma yerleri oluşur. Transkripsiyonel giriş mantıksal entegratörleri spatiotemporally hassas ve kantitatif tam promotor aktivitesinin şeklinde üniter bir çıkış veren olarak hizmet vermektedir. Bugüne kadar cis-regülasyon memeli çalışmaların çoğu 4-5 Cres arttırıcı fonksiyonu assaying bir araç olarak fare transgenesis yararlanmıştır. Bu teknik, büyük ölçüde kantitatif olmayan, ekleme sitesi etkileri dikkate, zaman alıcı pahalı ve. Öte yandan, memeli CRE fonksiyonu için kantitatif testleri doku kültürü sistemleri (örneğin, çift lusiferaz deneyleri) geliştirilmiştir, ancak bu sonuçlar in vivo önemi sık sık belirsiz olmuştur. Elektroporasyon memeli doku yaşayan cis düzenleyici aktivite uzaysal ve kantitatif değerlendirme izin verdiğini geleneksel fare transgenesis için mükemmel bir alternatif sunuyor. Bu teknik, özellikle serebral korteks ve retina 6-8, özellikle merkezi sinir sistemi cis-regülasyon analizi yararlı olmuştur . In vivo ve ex vivo hem de fare retina elektroporasyon, gelişmiş ve yaygın Matsuda ve Cepko 6-7,9 tarafından açıklanan olsa da, son zamanlarda electroporated fare retina 10 fotoreseptör-özel Cres aktivitesini ölçmek için basit bir yaklaşım geliştirmiştir. Elektroporasyon retina içine tanıtıldı DNA miktarı deneyinin deney değişebilir göz önüne alındığında, tüm deneylerde bir co-electroporated yükleme kontrol &#39;dahil edilmesi gereklidir. Bu bağlamda, kültür hücreleri promotör aktivitesini ölçmek için kullanılan çift lusiferaz assay tekniği çok benzer. Fotoreseptör cis-düzenleyici faaliyet assaying, elektroporasyon genellikle zirve çubuk üretimi 11-12 zamanında doğmuş farelerin (postnatal gün 0, P0) yapılır. Bir kez retinal hücre tipleri post-mitotik haline elektroporasyon daha az verimlidir. P0 az electroporated hücrelerinin çoğunluğu göz önüne alındığında, yeni doğmuş farelerin ve çubuklar yetişkin fare retina hücrelerinin% 70 daha fazla sahip olmasına çubuk doğum oranının yüksek çubuklar. Bu nedenle, çubuk fotoreseptör elektroporasyon üzerinden çalışma kolay retinal hücre tipi. Biz burada açıklamak teknik fotoreseptör Cres faaliyet ölçülmesi için özellikle yararlıdır.

Bu protokol ile fare retina eksplant elektroporasyon yaşayan cis-düzenleyici unsurlar (yani artırıcı / rehberleri) aktivitesini ölçmek için basit ve ucuz bir şekilde açıklamaktadır. DNA hazırlığı, retina diseksiyonu, elektroporasyon, retina eksplant kültür ve fiksasyonu sonrası analizi ve ölçülmesi açıklanmıştır.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Hücresel gen ağlarındaki transkripsiyon faktörleri, ... bölgelerine bağlanarak hedef genlerinin ekspresyon düzeylerini ve spasyotemporal modellerini kontrol ederler.

Bu prosedürün genel amacı, fare retinal implantlarını floresan transkripsiyonel raporlayıcılar ile elektropore etmek ve bunların ekspresyon seviyelerini nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle diseksiyon yoluyla neonatal fare retinal dokusunun izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, retinayı floresan DNA raporlayıcı konstrüktlar ile elektropore etmektir.Prosedürün üçüncü adımı, elektropore edilen retinaların sekiz gün boyunca implantlar şeklinde kültüre edilmesidir. Prosedürün son adımı ise retinal eksplantların toplanması ve floresan raporlayıcıların ekspresyon seviyelerinin belirlenmesidir. Sonuç olarak, eksplant elektroporasyonu ve ardından yapılan kantitatif veri analizi yoluyla, gelişmekte olan fare retinasındaki farklı promotör raporlayıcı konstrüktların göreceli ekspresyon seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Benim adım Joe Corbo; St. Louis'teki Washington University School of Medicine Patoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde öğretim üyesiyim. Bugün, fotoreseptöre özgü CYS düzenleyici elementlerin aktivitesini nicelleştirmek amacıyla, yeni doğmuş fare retinalarına ex vivo elektroporasyon tekniğini gösteren bir video protokolü sunacağız; bu protokolü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Cindy Montana uygulamalı olarak gösterecek. İlk olarak, göz toplama işlemine hazırlık amacıyla, elektroporasyon haznesini ve tüm aletleri %70 etanol ile sterilize edin.Her iki eldiveni ve tezgahı etanolle dezenfekte edin ve prosedür boyunca steril koşulları koruyun. Ardından, bir doku kültürü kabininde, bir adet steril 60 mm'lik Petri kabına altı mililitre diseksiyon besiyeri ve iki adet steril 35 mm'lik kaba üçer mililitre besiyeri pipetleyin. Tekrar tezgaha dönerek, yeni doğmuş bir fare yavrusunun baş ve boyun bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.Makas kullanarak baş hızlıca koparıldıktan sonra, baş steril bir 100 milimetrelik kaba aktarılır ve bir diseksiyon mikroskobu altında gözleri açığa çıkarmak için kafa derisi küçük makaslarla kesilir. Kavisli pensler kullanılarak göz nazikçe orbitiden çıkarılır ve ardından diseksiyon ortamı içeren 35 milimetrelik bir kaba yerleştirilir. Elektroporasyon yapılacak her bir DNA alikotu başına üç ila dört göz olacak şekilde göz toplama işlemine devam edilir; işlem tamamlanana kadar gözler ve diseksiyon ortamı oda sıcaklığında tutulur.Hem bir jiletle hem de steril bir plastik transfer pipetinin ambalajını %70 etil alkol ile dezenfekte edin ve ardından jileti kullanarak, tüm bir gözün pipetlenebileceği kadar yüksekten pipetin ucunu kesin. Genişletilmiş pipeti kullanarak, yüksek büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında 35 milimetrelik kaptan 60 milimetrelik kaba bir göz aktarın. Göz yüzeyindeki ekstraoküler kaslar ve yağ gibi tüm dokuları temizlemek için ince pens kullanın.Ardından, optik siniri tabanından sıkarak çıkarın. Retinayı izole etmek için, limbus bölgesindeki sklerada küçük bir delik açın; skler ve retinal pigment epiteli, mat gri renkteki retinal dokuya kıyasla parlak görünür. Her iki penset takımından birer ucu deliğe yerleştirin ve skler ile RPE'yi nazikçe yırtarak açın.Lensin yerinde kaldığından emin olun. Diseke edilen retinayı, içerisinde besiyeri bulunan ikinci 35 milimetrelik kaba aktarmak için genişletilmiş pipeti kullanın. Tüm retinaları toplayın ve 37 derece Celsius sıcaklıktaki doku kültürü inkübatöründe saklayın.Elektroporasyon işlemi için, elektropore edilecek her bir DNA alikotu için doku kültürü kabininde çalışarak, bir adet steril 35 milimetrelik tabağı disseksiyon ortamı ile ve ikinci bir tabağı kültür ortamı ile doldurun. P 200 pipet kullanarak, elektroporasyon tabağındaki odacıkları steril 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Odacıkları 60 µL DNA alikotları ile doldurun ve kullanılmayan tüm odacıkları 60 µL 1X PBS ile doldurun.Elektrotları elektroporasyon kabına bağlayın ve elektro cihazına uygun ayarları girin. Retinaları lens kısmından tutmak için ince pens kullanın ve onları elektroporasyon odacıklarına aktarın. Her odacığa dört adete kadar retina yerleştirin.Retinaları, lensin pozitif elektroda bağlı metal çubuğa yaslanacağı şekilde düzenleyin. Bir odadan diğerine DNA taşınmasını önlemek için her oda arasında pensetleri silin. Tüm retinalar hizalandıktan sonra, elektroforez cihazında başlat düğmesine basın.Negatif elektroda bağlı metal çubuk üzerinde küçük kabarcıklar oluşmalıdır. Elektrotların bağlantısını kesin ve pens yardımıyla elektrofor cihazını kapatın. Retinaları nazikçe hazne duvarlarından uzaklaştırın.Retinaları kameralardan, diseksiyon medyumu içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Steril bir transfer pipeti kullanarak retinaları diseksiyon medyumu içinden kültür medyumu içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Steril altı kuyucuklu bir kültür plağının kuyucuklarını etiketleyin ve her bir kuyucuğu üç mililitre kültür medyumu ile doldurun.Steril pensler kullanarak, her bir kuyucuktaki besiyerinin üzerine yuvarlak watman nucleo filtreleri, filtrelerin parlak yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yüzdürün. Bir disseksiyon mikroskobu yardımıyla, tek bir retinayı steril transfer pipeti ile lens tarafı aşağı gelecek şekilde filtrenin üzerine aktarın. Eğer retina lens tarafı yukarı bakacak şekilde yerleşirse, retinayı tekrar pipete çekin ve işlemi tekrarlayın.Her kuyucuğa en fazla dört retina yerleştirin ve bunları ayrı damlacıklar halinde tutun. Retinalar kuyucuklara yerleştirildikten sonra, kültür plağını 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve istenen süre boyunca büyütmeye bırakın. Genellikle burada görülen sekiz günlük süreç, DNA konstrüktünün retinal yüzeyin dörtte birinden üçte birine yayılmasıyla sonuçlanan başarılı bir elektroporasyon sağlar.Floresans seviyeleri, CRE konstrüktunu eksprese eden tekdüze elektropore edilmiş bölgelerin retina dışındaki bölgelerle karşılaştırılması ve ardından kontrol GFP ekspresyonuna göre normalize edilmesiyle nicelleştirilir. Özellikle rod fotoreseptörlerin verimli bir şekilde transduse edildiği gösterilmiştir. Burada, dış nükleer tabakada iki rod spesifik promotörün GFP ve DS red ekspresyonunu yönlendirdiği bir elektroporasyonun sonuçları yer almaktadır.Burada mavi renkte gösterilen DPI boyaması ile iki ekspresyon örüntüsü üst üste bindirildiğinde, fotoreseptöre özgü ekspresyon belirgin hale gelmektedir. Ne interpleksiform tabakada ne de ganglion hücresi tabakasında herhangi bir ekspresyon gözlemlenmemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, retinal sist düzenleyici elementlerin aktivitesini nicelendirmek amacıyla fare retinal eksplantlarının nasıl diseke edileceği ve kültüre edileceği konusunda iyi bir fikir edinmiş olmalısınız.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

İn vivo potansiyellerini belirlemek için kültürlenmiş hücreleri erken fare embriyolarının tanımlanmış bölgelerine aşılamak için bir yöntem gösteriyoruz. Ayrıca, eksojen DNA'nın embriyolardaki birkaç hücreye hassas bir şekilde iletilmesini sağlayan, çapı bilinen cam kılcal damarları kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi de sunuyoruz.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Öğrenin fare retina eksplant elektroporasyonu ile cis-düzenleyici elemanların aktivitesini nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem gen düzenlemesi ve görsel süreçler üzerine nörobilim araştırmalarında kullanılır.

Aktivitesi miktarının Cis Düzenleme Elemanları

Daha fazla video keşfet