Aktivitesi miktarının Cis Düzenleme Elemanları

Bu protokol ile fare retina eksplant elektroporasyon yaşayan cis-düzenleyici unsurlar (yani artırıcı / rehberleri) aktivitesini ölçmek için basit ve ucuz bir şekilde açıklamaktadır. DNA hazırlığı, retina diseksiyonu, elektroporasyon, retina eksplant kültür ve fiksasyonu sonrası analizi ve ölçülmesi açıklanmıştır.

Bu prosedürün genel amacı, fare retinal implantlarını floresan transkripsiyonel raportörlerle elektro saflaştırmak ve ekspresyon seviyelerini ölçmektir. Bu, ilk olarak yenidoğan fare retina dokusunun diseksiyon yoluyla izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, retinayı floresan DNA raportör yapıları ile elektro hale getirmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, elektroporasyonlu retinaları sekiz gün boyunca implant olarak kültürlemektir. Prosedürün son adımı, retina ekspansını toplamak ve floresan raportörlerin ekspresyon seviyelerini ölçmektir. Sonuç olarak, x explan elektroporasyonu ve ardından kantitatif veri analizi yoluyla gelişmekte olan fare retinasındaki farklı promotör raportör yapılarının göreceli ekspresyon seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Benim adım Joe Corbo ve St.Louis'deki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde Patoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde öğretim üyesiyim. Ve bugün, fotoreseptöre özgü CYS düzenleyici elemanlarının aktivitesini ölçmek amacıyla yeni doğan fare retinalarına X explan elektroporasyon tekniğini gösteren bir video protokolü sunacağız ve bu protokolü göstermek benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak, Cindy Montana. İlk olarak, göz toplamaya hazırlanırken elektroporasyon odasını ve tüm aletleri% 70 etanol ile sterilize edin.

Hem eldivenleri hem de tezgahı etanol ile dezenfekte edin ve prosedür boyunca steril koşulları koruyun. Daha sonra, bir doku kültürü başlığında, altı mililitre diseksiyon ortamını bir steril 60 milimetre Petri kabına ve üç mililitre ortamı iki steril 35 milimetrelik tabağa pipetleyin. Tezgahın üzerine geri döndüğünüzde, yeni doğmuş bir fare yavrusunun başını ve boynunu %70 etanol ile dezenfekte edin.

Makas kullanarak kafayı hızlı bir şekilde kestikten sonra, kafayı 100 milimetrelik steril bir tabağa aktarın, gözleri diseksiyon mikroskobu altında ortaya çıkarmak için kafa derisini küçük bir makasla kesin. Kavisli forseps kullanarak, gözü nazikçe yörüngeden çıkarın ve ardından gözü diseksiyon içeren 35 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Orta. Elektropore edilecek DNA'nın her bir alikotu başına üç ila dört göz olacak şekilde gözleri toplamaya devam edin, gözleri ve diseksiyon ortamını bitene kadar oda sıcaklığında tutun.

Hem tıraş bıçağını hem de steril bir plastik transfer pipetinin ambalajını %70 etanol ile dezenfekte edin ve ardından pipetin ucunu tüm gözün pipetlenebilmesi için yeterince yüksek kesmek için tıraş bıçağını kullanın. Genişletilmiş pipeti kullanarak, bir gözü 35 milimetrelik çanaktan 60 milimetrelik çanağa yüksek güçte diseksiyon mikroskobu altında aktarın. Göz yüzeyinden göz dışı kaslar ve yağ gibi herhangi bir dokuyu çıkarmak için ince forseps kullanın.

Daha sonra optik siniri tabandan sıkıştırarak çıkarın. Retinayı izole etmek için, limbusta sklerada küçük bir delik açın, sklera ve retina pigmentli epitel, Matt Gray olan retina dokusuna göre parlak görünür. Her iki forseps çiftinden bir ucu deliğe sokun ve sklera ve RPE'yi yavaşça yırtın.

Lensi yerinde bıraktığınızdan emin olun. Diseke retinayı ortam içeren ikinci 35 milimetrelik çanağa taşımak için genişletilmiş pipeti kullanın. Tüm retinaları toplayın ve 37 santigrat derece doku kültürü inkübatöründe saklayın.

Elektroporasyona tabi tutulacak her DNA Eloqua için bir doku kültürü başlığında elektroporasyon çalışana kadar, bir steril 35 milimetrelik kabı diseksiyon ortamı ve ikinci bir kabı kültür ortamı ile doldurun. Bir P 200 pipet kullanarak, elektroporasyon kabındaki hazneleri steril bir XPB S3 ile yıkayın. Odaları 60 mikrolitrelik DNA alikotları ile doldurun ve kullanılmayan odaları 60 mikrolitre bir XPBS ile doldurun.

Elektrotları elektroporasyon kabına bağlayın ve elektro üzerinde uygun ayarları girin. Retinaları lens tarafından kavramak için ince forseps kullanın ve bunları elektroporasyon odalarına aktarın. Her odaya dört adede kadar retina yerleştirmek.

Retinaları, lens pozitif elektroda bağlı metal çubuğa yaslanacak şekilde düzenleyin. DNA'nın bir odadan diğerine taşınmasını önlemek için her oda arasındaki forsepsleri silin. Tüm retinalar hizalandıktan sonra, elektroda başlat düğmesine basın.

Negatif elektroda bağlı metal çubuk üzerinde küçük kabarcıklar oluşmalıdır. Elektrotları ayırın ve forseps kullanarak elektroyu kapatın. Retinaları yavaşça oda duvarlarından uzaklaştırın.

Retinaları odacıklardan diseksiyon ortamı içeren 35 milimetrelik tabaklara aktarın. Steril bir transfer pipeti kullanarak, retinaları diseksiyon ortamından kültür ortamı içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Steril altı oyuklu bir kültür plakasının kuyularını etiketleyin ve her bir kuyucuğu üç mililitre kültürle doldurun. Orta.

Filtrelerin parlak tarafı yukarı bakacak şekilde her bir kuyucuğun içindeki ortamın üzerinde yuvarlak watman nükleo filtrelerini yüzdürmek için steril forseps kullanın. Bir diseksiyon dürbünü yardımıyla, steril transfer pipeti lens tarafı aşağı bakacak şekilde tek bir retinayı filtreye aktarın. Retina lens tarafı yukarı bakarsa, pipete geri çekin ve tekrar deneyin.

Her oyuğa dörtten fazla retina koymayın ve bunları ayrı damlacıklarda tutun. Retinalar kuyucuklara yerleştirildikten sonra, kültür plakasını 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve istenen süre boyunca büyütün. Genellikle sekiz gün görülen başarılı elektroporasyon, retina yüzeyinin dörtte biri ila üçte biri boyunca DNA yapısının ekspresyonu ile sonuçlanır.

Floresan seviyeleri, CRE yapısını eksprese eden düzgün elektroporasyonlu bölgelerin retina dışındaki bölgelerle karşılaştırılması ve ardından GFP ekspresyonunu kontrol etmek için normalleştirilmesiyle ölçülür. Özellikle çubuk fotoreseptörlerinin verimli bir şekilde transdüksiyona tabi tutulduğu gösterilmiştir. Burada, iki çubuğa özgü promotörün dış nükleer katmanda GFP ve DS kırmızısının ekspresyonunu yönlendirdiği bir elektroporasyonun sonuçları verilmiştir.

Burada mavi renkle gösterilen DPI boyama ile iki ifade modelinin üst üste bindirilmesiyle, foto reseptöre özgü ifade belirgindir. Ne interclear tabakasında ne de ganglion hücre tabakasında herhangi bir ekspresyon gözlenmez. Bu videoyu izledikten sonra, retina kisti düzenleyici elemanların aktivitesini ölçmek amacıyla fare retinal eksplantlarının elektrosunu ve kültürünü nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.