Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon Utero olarak Elektroporasyon
July 26th, 2012
Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.
Bu prosedürün amacı, rahimde, elektroporasyonda, fare serebral korteksinde ve hipokampusunda dendritleri ve dikenleri görselleştirmek ve genetik olarak manipüle etmektir. Bu, önce istenen plazmit, DNA çözeltisinin uterodaki embriyoların lateral ventrikülüne enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, Palo elektrotlarının farklı pozisyonlarını kullanarak.
DNA enjeksiyonuna göre, serebral korteks veya hipokampus elektroporasyona uğrar, daha sonra istenen doğum sonrası veya yetişkinlik aşamaları. Fareler perfüze edilir ve beyinler toplanır. Son olarak, beyinler bir vibram ile bölümlere ayrılır.
Sonuç olarak, dendritler ve dikenler konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilebilir. Üniter elektroporasyon tekniği, sağ olmayan ve omurgayı inceleme yöntemlerine kıyasla çeşitli avantajlar sunar. Aslında, bu teknik ilk önce bu yönü doğrudan in vivo olarak incelemeye izin verir.
Ayrıca, elektro operasyonda nakavt farelerin üretilmesiyle karşılaştırıldığında, gen baskılanmasının veya gen ekspresyonunun etkisini incelemek ve sadece belirli bir hücre yapısında değil, aynı zamanda belirli bir gelişim noktasında beyaz ve omurga giymek için hızlı bir yaklaşımdır. İnter-elektro operasyonda indüklenebilir sistemin kullanılması, don yazma ve omurga gelişiminde rol oynayan genler arasındaki fonksiyonel etkileşimi tanımlamak için de yararlı bir araçtır. Gerçekten de, virüslerin aksine, örneğin, aynı hücre popülasyonunda birden fazla HNA veya birden fazla ton geni birleştirmemiz sıkıdır DNA'yı suda istenen konsantrasyonlara seyreltmeye başlamak ve %0.05'lik bir nihai konsantrasyona hızlı yeşil boya eklemek için% Enjeksiyon için cam iğneleri çekmek için bir mikro perpet çektirme kullanın.
Hamile bir fareyi isof flor kullanarak anestezik bir indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijeni dakikada iki litreye kadar açın. Hayvan yazma refleksini kaybettiğinde, onu ameliyat öncesi bir maskeye aktarın. Her göze bir damla IGEL damlatın ve karın kıllarını tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın.
Uçuşan saçları toplamak için traş edilen bölgeyi bir kez klorheksidin ile temizleyin. Hayvanı, sırtı ısıtma yastığının üzerinde olacak şekilde cerrahi alandaki ikinci bir maskeye aktarın. Petal refleks kaybolduğunda ameliyata başlayın.
Bir maske ve steril eldiven giyin ve hayvanı steril bir örtü ile örtün. Traş edilen alanı en az üç kez klorheksidin ile temizleyin. Deri boyunca orta hat boyunca dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.
Makas kullanarak. Doğrusal dirsek boyunca karın kası üzerinde benzer bir kesi yapın. En erişilebilir embriyoları seçmek.
İki embriyo arasına halka forseps yerleştirin ve embriyonik zinciri dikkatlice karın boşluğundan dışarı çekin. Bu noktadan itibaren, embriyoları steril ön ısıtma PBS ile nemlendirin. Halka forseps kullanarak.
Embriyonun amniyotik torba içindeki pozisyonunu nazikçe manipüle edin ve halkalar arasındaki başı stabilize edin. Embriyoyu rahim duvarına yaklaştırmak için hafifçe sıkın. Öte yandan, kılcal tutucuyu alın ve lateral ventrikülü hedeflemek için iğneyi dikkatlice yarım kürenin ortasına sokun.
İğnenin rahim duvarının yüzeyindeki hareketini en aza indirmeye özen göstererek ve kan damarlarını delmekten kaçınarak, yaklaşık 0,5 mikrolitre yeşil DNA çözeltisi enjekte etmek için pedala basın. Elektrotları, korteks elektroporasyonu için enjekte edilen ventrikül ile aynı taraftaki pozitif pedal veya enjekte edilen ventrikülün karşı tarafına, hipokampus elektroporasyonu ile embriyonun başının yanlarına yerleştirin. Ardından, bir saniyelik aralıklarla 50 milisaniye süreli beş adet 30 voltluk elektrik darbesi uygulayın.
Plasenta boyunca akım uygulamaktan kaçının, çünkü bu embriyo ölümüne neden olur Hayatta kalma şansını artırmak için, tüm embriyoları PBS'de, karın boşluğunda tamamlandığında 30 dakikadan kısa sürede enjekte edin ve elektro çalıştırın ve rahim boynuzunu orijinal yerinde değiştirmek için halka forsepslerini kullanın. Karın, duvar ve cildi kapatmak için vicryl emilebilir dikişler kullanın. Hayvanı uyanana kadar bir kurtarma odasına koyun.
Daha sonra ameliyattan 24 ve 48 saat sonra bir ısıtma yastığı üzerindeki bir kafese aktarın. Acıyı, ıstırabı veya sıkıntıyı değerlendirmek için farenin davranışını kontrol edin ve beyinleri analiz etmek için hayvanı tartın. Doğum sonrası aşamalarda, daha önce perfüze edilmiş bölümleri ayırmak için bir vibratör kullanın ve postfix beyinleri, dendritleri ve dikenleri görüntülemek için bölümleri aqua poly mount'a monte edin.
Bu şekil, serebral kortekste, hipokampusun ca ve dentat girusundaki elektroporasyonlu hücrelerin örneklerini gösterirken, tip fareler E 14.5'te elektropore edilirken, GFP yapısı ve beyinler doğum sonrası 14. günde hasat edildi. Küçük bir hacimde DNA çözeltisi enjekte edilerek, izole edilmiş GFP pozitif hücrelerin dendritik arborizasyonunun yanı sıra dikenlerinin daha yüksek büyütmede görselleştirilmesine izin veren birkaç hücre etiketlenir. Bu prosedürü denerken, sadece birkaç hücreyi hedeflemek için küçük bir hacimde DNA enjekte etmeyi hatırlamak ve omurgada veya elektro nörolarda yazılmayanları görselleştirebilmek ve ölçebilmek önemlidir.
Genel Bakış
Bu makale, E14.5'te farelerin serebral korteks ve hipokampusunda in utero elektroporasyon protokolünü detaylandırmaktadır. Bu yöntem, bu beyin bölgelerindeki dendritler ve dikenlerin incelenmesi için değerlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Genetik Manipülasyon
Arka Plan
- Elektroporasyon, nöronların görselleştirilmesini ve genetik manipülasyonunu sağlar.
- Teknik, embriyonik gelişim sırasında beynin belirli bölgelerine yöneliktir.
- Geleneksel knockout fare modellerine göre avantajlar sunar.
- In vivo çalışmalar, dendrit ve diken gelişimini etkileyen gen etkileşimlerini ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare beynindeki dendritler ve dikenlerin görselleştirilmesi ve manipülasyonu.
- Gen ekspresyonu ve baskılama etkilerinin değerlendirilmesi.
- Nöronal yapıları incelemek için hızlı bir yaklaşım geliştirilmesi.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyonların lateral ventrikülüne plazmid DNA enjeksiyonu.
- Elektriksel darbeler uygulamak için elektrotlar kullanılarak elektroporasyon.
- Postnatal beyin yapısı ve fonksiyonunun değerlendirilmesi.
- Elektropore edilmiş hücrelerde dendritler ve dikenlerin konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Serebral korteks ve hipokampusun başarılı elektroporasyonu.
- GFP-pozitif hücrelerde dendritik ağaçlanma ve dikenlerin görselleştirilmesi.
- Tekniğin in vivo çalışmalar için etkinliğinin gösterilmesi.
- Nöronal gelişimde yer alan gen etkileşimlerinin tanımlanması.
Sonuçlar
- In utero elektroporasyon, nöronal yapıları incelemek için güçlü bir araçtır.
- Yöntem, beynin belirli bölgelerinde hedefe yönelik genetik manipülasyona olanak tanır.
- Geleneksel genetik modifikasyon tekniklerine hızlı bir alternatif sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
In utero electroporation (IUE) enables rapid, in vivo genetic manipulation and visualization of neuronal structures in the developing mouse brain, directly addressing the need for physiologically relevant models in early CNS drug discovery. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing precise temporal and spatial gene modulation in the cerebral cortex and hippocampus. IUE's flexibility accelerates hypothesis testing and portfolio triage for neurodevelopmental and synaptic function targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neuronal development within native tissue environments.
- Supports functional target validation by permitting gain- and loss-of-function studies in specific brain regions and developmental windows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene manipulation in vivo.
- Accelerates predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares physiologically relevant neuronal systems for downstream phenotypic screening and quantitative imaging.
- Enables reproducible labeling of sparse neuronal populations for high-resolution dendrite and spine analysis.
- Supports assay standardization by providing consistent genetic delivery and expression in targeted brain regions.
- Improves screening readiness for compounds affecting synaptic structure or function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuronal architecture and gene expression patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting inducible gene modulation at defined developmental stages.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of dendritic and synaptic integrity.
- Reduces risk of late-stage attrition by modeling gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
IUE integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging in vitro findings with in vivo validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for genes regulating dendrite and spine development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Enables high-content measurement of dendritic arborization and spine density in genetically defined neuronal populations.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human disease mechanisms by enabling precise temporal gene modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for rapid evaluation of multiple gene targets or combinations in the same experimental system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Offers rapid, scalable, and standardized genetic manipulation compared to traditional knockout models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early in vivo functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, genetic construct design, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection, electroporation, and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of DNA delivery, electroporation parameters, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or developmental stages.
- Limited to accessible brain regions and developmental windows as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Preparation: DNA Solution and Needles
2:10
Preparation: Surgery Before DNA Injection and Electroporation
3:25
Surgery: DNA Injection and Electroporation
5:01
Surgery: Post-surgical Evaluation and Tissue Processing
5:28
Representative Results
6:06
Conclusion
