Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon Utero olarak Elektroporasyon

Bu prosedürün amacı, rahimde, elektroporasyonda, fare serebral korteksinde ve hipokampusunda dendritleri ve dikenleri görselleştirmek ve genetik olarak manipüle etmektir. Bu, önce istenen plazmit, DNA çözeltisinin uterodaki embriyoların lateral ventrikülüne enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, Palo elektrotlarının farklı pozisyonlarını kullanarak.

DNA enjeksiyonuna göre, serebral korteks veya hipokampus elektroporasyona uğrar, daha sonra istenen doğum sonrası veya yetişkinlik aşamaları. Fareler perfüze edilir ve beyinler toplanır. Son olarak, beyinler bir vibram ile bölümlere ayrılır.

Sonuç olarak, dendritler ve dikenler konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilebilir. Üniter elektroporasyon tekniği, sağ olmayan ve omurgayı inceleme yöntemlerine kıyasla çeşitli avantajlar sunar. Aslında, bu teknik ilk önce bu yönü doğrudan in vivo olarak incelemeye izin verir.

Ayrıca, elektro operasyonda nakavt farelerin üretilmesiyle karşılaştırıldığında, gen baskılanmasının veya gen ekspresyonunun etkisini incelemek ve sadece belirli bir hücre yapısında değil, aynı zamanda belirli bir gelişim noktasında beyaz ve omurga giymek için hızlı bir yaklaşımdır. İnter-elektro operasyonda indüklenebilir sistemin kullanılması, don yazma ve omurga gelişiminde rol oynayan genler arasındaki fonksiyonel etkileşimi tanımlamak için de yararlı bir araçtır. Gerçekten de, virüslerin aksine, örneğin, aynı hücre popülasyonunda birden fazla HNA veya birden fazla ton geni birleştirmemiz sıkıdır DNA'yı suda istenen konsantrasyonlara seyreltmeye başlamak ve %0.05'lik bir nihai konsantrasyona hızlı yeşil boya eklemek için% Enjeksiyon için cam iğneleri çekmek için bir mikro perpet çektirme kullanın.

Hamile bir fareyi isof flor kullanarak anestezik bir indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijeni dakikada iki litreye kadar açın. Hayvan yazma refleksini kaybettiğinde, onu ameliyat öncesi bir maskeye aktarın. Her göze bir damla IGEL damlatın ve karın kıllarını tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın.

Uçuşan saçları toplamak için traş edilen bölgeyi bir kez klorheksidin ile temizleyin. Hayvanı, sırtı ısıtma yastığının üzerinde olacak şekilde cerrahi alandaki ikinci bir maskeye aktarın. Petal refleks kaybolduğunda ameliyata başlayın.

Bir maske ve steril eldiven giyin ve hayvanı steril bir örtü ile örtün. Traş edilen alanı en az üç kez klorheksidin ile temizleyin. Deri boyunca orta hat boyunca dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.

Makas kullanarak. Doğrusal dirsek boyunca karın kası üzerinde benzer bir kesi yapın. En erişilebilir embriyoları seçmek.

İki embriyo arasına halka forseps yerleştirin ve embriyonik zinciri dikkatlice karın boşluğundan dışarı çekin. Bu noktadan itibaren, embriyoları steril ön ısıtma PBS ile nemlendirin. Halka forseps kullanarak.

Embriyonun amniyotik torba içindeki pozisyonunu nazikçe manipüle edin ve halkalar arasındaki başı stabilize edin. Embriyoyu rahim duvarına yaklaştırmak için hafifçe sıkın. Öte yandan, kılcal tutucuyu alın ve lateral ventrikülü hedeflemek için iğneyi dikkatlice yarım kürenin ortasına sokun.

İğnenin rahim duvarının yüzeyindeki hareketini en aza indirmeye özen göstererek ve kan damarlarını delmekten kaçınarak, yaklaşık 0,5 mikrolitre yeşil DNA çözeltisi enjekte etmek için pedala basın. Elektrotları, korteks elektroporasyonu için enjekte edilen ventrikül ile aynı taraftaki pozitif pedal veya enjekte edilen ventrikülün karşı tarafına, hipokampus elektroporasyonu ile embriyonun başının yanlarına yerleştirin. Ardından, bir saniyelik aralıklarla 50 milisaniye süreli beş adet 30 voltluk elektrik darbesi uygulayın.

Plasenta boyunca akım uygulamaktan kaçının, çünkü bu embriyo ölümüne neden olur Hayatta kalma şansını artırmak için, tüm embriyoları PBS'de, karın boşluğunda tamamlandığında 30 dakikadan kısa sürede enjekte edin ve elektro çalıştırın ve rahim boynuzunu orijinal yerinde değiştirmek için halka forsepslerini kullanın. Karın, duvar ve cildi kapatmak için vicryl emilebilir dikişler kullanın. Hayvanı uyanana kadar bir kurtarma odasına koyun.

Daha sonra ameliyattan 24 ve 48 saat sonra bir ısıtma yastığı üzerindeki bir kafese aktarın. Acıyı, ıstırabı veya sıkıntıyı değerlendirmek için farenin davranışını kontrol edin ve beyinleri analiz etmek için hayvanı tartın. Doğum sonrası aşamalarda, daha önce perfüze edilmiş bölümleri ayırmak için bir vibratör kullanın ve postfix beyinleri, dendritleri ve dikenleri görüntülemek için bölümleri aqua poly mount'a monte edin.

Bu şekil, serebral kortekste, hipokampusun ca ve dentat girusundaki elektroporasyonlu hücrelerin örneklerini gösterirken, tip fareler E 14.5'te elektropore edilirken, GFP yapısı ve beyinler doğum sonrası 14. günde hasat edildi. Küçük bir hacimde DNA çözeltisi enjekte edilerek, izole edilmiş GFP pozitif hücrelerin dendritik arborizasyonunun yanı sıra dikenlerinin daha yüksek büyütmede görselleştirilmesine izin veren birkaç hücre etiketlenir. Bu prosedürü denerken, sadece birkaç hücreyi hedeflemek için küçük bir hacimde DNA enjekte etmeyi hatırlamak ve omurgada veya elektro nörolarda yazılmayanları görselleştirebilmek ve ölçebilmek önemlidir.