Name: Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon Utero olarak Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Öğrenin fare serebral korteks ve hipokampusta dendrit ve spine görselleştirme için uterus içi elektroporasyon yöntemini. Bu teknik genetik manipülasyon ve in vivo nöron gelişimi çalışmaları için hızlı bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar aseptik prosedürleri kapsamında utero elektroporasyon gerçekleştirmek için yardım ettikleri için Dr Kathleen Mathers, Dr Jean-Philippe Mocho ve Dr Yolanda Saavedra Torres teşekkür etmek istiyorum, ve onun yardım için Hayley Ahşap çizimler hazırlamak için. EP Elizabeth Fisher ve Victor Tybulewicz için Wellcome Vakfı bursu ile Avrupa Biyokimya Dernekleri uzun vadeli Federasyonu (FEBS) burs ve Medical Research Council (MRC) kariyer geliştirme bursu, MAH (080174/B/06/Z) tarafından desteklenmiştir , HW, MRC Öğrencilik tarafından EMBO uzun vadeli dostluk ve RA tarafından. Bu çalışma Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) bir proje hibe ile ve Grant-Aid yılında Tıbbi Araştırma Konseyi (U117570528) den FG tarafından desteklenmiştir

Birleşik Krallık&#39;ta, fareler, ev sahipliği yetiştirilen ve Hayvan (Scientific Procedures) Act 1986 kapsamında İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanan yönergelere göre tedavi edilir. 1. Hazırlanışı: DNA Çözüm ve İğneler <ol><li> Bir Endotoksin ücretsiz Maxi hazırlık kiti ile plazmid DNA arındırın. Suda istenilen konsantrasyonda enjeksiyon için plazmid DNA çözeltisi hazırlayın ve enjeksiyonlar görselleştirmek için (% 0.05 final konsantrasyon) Fast Green ekleyin. Elektroporasyon verim DNA konsantrasyonu çok bağımlı olduğunu. 1 ug / ml arasında bir konsantrasyonda, genellikle kullanılır. Bu konsantrasyon onların gelişimini etkilemeden electroporated nöronlar görselleştirmek için yeterlidir. Bununla birlikte, plazmid vektörü olarak boyutu ve (sitomegalovirüs hızlandıncı / kuvvetlendirici, sitomegalovirüs acil erken geliştirici ve tavuk β-aktin promotör fusion (CAG) promotörü ile güçlü bir ifade ile düşük düzey ifade seviyesini) &#39;de kullanılan promotör göre<html> ifade edilen protein stabilitesi, bu konsantrasyon (0,25 ug / ml ila 5 ug / ul) ayarlanabilir. </li><li> Mikropipet çektirmenin kullanılarak cam iğneler çekin. </li></ol> 2. Cerrahi hazırlanması <ol><li> Cerrahi aletler ve fosfat tamponu (PBS) otoklavlayın. </li><li> PBS (Buprenorfin, 30 ug / ml &#39;lik Vetergesic, son konsantrasyon) analjezik çözeltisi hazırlayın. Gebe fare tartılır ve en az 30 dakika ameliyattan önce Vetergesic deri altına 0.1 mg / kg enjekte. Bu süre boyunca, cerrahi alanı hazırlamak. Isıtma pedleri ve kurtarma odası açın. Sıcak su banyosu ve steril örtüler tüm steril alet ve malzemelerin steril PBS yerleştirin. PBS dolu behere platin elektrot yerleştirin ve elektroporatörün bağlanın. Bir Microloader ucunu kullanarak DNA solüsyonu ile iğne doldurun, kılcal sahibine iğne bağlamak ve bir forseps ile iğne ucu çimdiklemek. </li></ol>DNA Enjeksiyon ve Elektroporasyon önce E_TITLE &quot;&gt; 3. Cerrahi <ol><li> Bir indüksiyon odalarını kullanarak (oksijen 2 lt / dk) oksijen taşıyıcı izofluran ile hamile bir fare (E14.5-E15.5) uyuşturan. Hayvan refleks doğrulma kaybeder kadar bekleyin. </li><li> Bir &quot;ön-cerrahi&quot; maskesi hayvan aktarın. Annenin genel anestezi altında iken gözler kornea ülseri önlemek için her göze göz jeli bir damla yerleştirin. Karın tıraş etmek için bir elektrik ustura kullanın. Uçan saç toplamak için clorhexidine ile bir kez traş alanı temizleyin. </li><li> Cerrahi alanında ikinci bir maske için hayvan aktarın. Isıtma yastığı sırtını ile fare yerleştirin. Pedal refleks kesildi cerrahi başlayın. </li><li> Maske ve steril eldiven giyin. Tıraş ve dezenfekte edilmemiş deri alanları ile kontamine olmaktan doku ve araçların önlemek için steril bir drape (karın üzerinde küçük bir delik ile) ile hayvan örtün. Bir traş alanı temizleyinen t clorhexidine ile 3 kez. Farklı bir steril pamuklu çubukla her zaman kullanın. Deri yoluyla orta hat (~ 1 inç uzunluğunda) boyunca dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Makas kullanarak, linea alba (beyaz çizgi kollajen bağ dokusu çoğunlukla oluşan) boyunca karın kaslarının benzer bir kesi yapmak. </li><li> En erişilebilir embriyolar seçin ve iki embriyo arasında halka forseps yerleştirin ve dikkatlice karın boşluğu dışında embriyonik zinciri çekin. Bu noktadan itibaren, steril önceden ısıtılmış PBS ile embriyolar nemli tutar. </li></ol> No mikroskop görüntülenmesi için gereklidir. 4. DNA ve Elektroporasyon Enjeksiyon <ol><li> Daha kolay embriyolar electroporated edildiği izlemek için yapım, en lateral embriyoların biriyle başlayın. Bu kanama riskini artıracak gibi embriyo üzerinde çok fazla çekmeyin. Halka ve forseps kullanılarak amniyon kesesi içinde embriyonun konumu manipülehalkaları arasındaki embriyoların başı sabitlemek. Embriyo yakın rahim duvarına kadar itmek hafifçe sıkın. </li><li> Diğer elinizle kılcal tutucu almak ve lateral ventrikül hedef yarımkürenin orta dikkatlice iğneyi. Fast Green (dendritler okumaya az 1 ul) ile karışık DNA solüsyonu yaklaşık 1 mikrolitre enjekte etmek için pedal basın. Sen lateral ventrikül dolum yeşil boya gözetmelidir. Kritik adımlar: - iğne keskinliğini düzgün rahim duvarı delmek için çok önemlidir. Delikli bir genişleme amniyotik sıvı ve embriyo ölüm sızıntı neden olacaktır çünkü uterus duvar yüzeyinde ve ventrikül içine yerleştirildikten sonra iğne hareketi en aza indirmek için önemlidir. Bu kanama ve embriyo ölüme neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarları kaçının. - Bu neden olacaktır çünkü lateral ventrikül içine DNA bir çok büyük hacimli enjeksiyon için önemli değildirhidrosefali (E14.5 az 2 ul aşmayın). DNA&#39;yı hacminin deney amacına göre ayarlanır. 1μl, genellikle en deneyler için kullanıldığı takdirde, DNA (yaklaşık 0.5 ul) daha küçük bir hacim dendrit ve omurga analizi için gereklidir. Gerçekten de birkaç izole hücrelerin electroporated nöronların dendritik çardak görselleştirmek ve ölçmek için hedef gerekir. </li><li> Korteks elektroporasyon için enjekte ventrikül olarak veya hipokampus elektroporasyon için enjekte ventrikül (Şekil 2) karşı tarafta aynı tarafta pozitif (+) raket ile embriyonun baş tarafında elektrotlar yerleştirin. Daha sonra 1 sn aralıklarla beş 30V elektrik darbeleri (50 msn süreli) uygulanır. Kritik adım: Bu embriyo ölüme neden olacak gibi plasenta arasında geçerli uygulamaktan kaçının. Hamile bir farenin tüm embriyolar herhangi bir karışıklığı önlemek için inşa genellikle aynı DNA ile, electroporated edilebilir. Bununla birlikte, uzun bir cerrahi azalma<html> embriyoların hayatta kalma oranı nedir. Karın boşluğuna 30 dakika daha uzun açılmamalıdır. </li></ol> 5.. Cerrahi sonrası elektroporasyon <ol><li> Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna PBS ekleyin ve özgün konumunda uterin horn yerine halka forseps kullanabilir. Vicryl emilebilir dikişlerle karın duvarı ve cilt dikin. </li><li> Bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilen bir kafese aktarabilir sonra uyanır (genellikle 5-10 dk) ve kadar bir kurtarma odasında hayvan yerleştirin. </li></ol> 6. Post-cerrahi Ağrı, acı veya sıkıntı değerlendirmek ve cerrahi sonrası hayvanların 24 saat ve 48 saat tartmak farelerin davranışlarını kontrol edin. Gerekirse, analjezikler ağrı ve rahatsızlığı azaltmak için uygulanabilir. 7. Doku İşleme Deney için gerekli embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında electroporated embriyo veya yavrular toplayın. ove_content &quot;&gt; - embriyonik aşamalarında (örneğin hücre çoğalması veya göç çalışma) de analiz için: Servikal dislokasyon ile anne Euthanize ve embriyolar toplamak. Baş kesilerek, düzgün bir şekilde electroporated edilmiştir beyinleri seçmek gibi floresan sinyal miktarını ve konum ile belirtilen, bir floresan binoküler kullanılarak kafatası boyunca görüntülenmiştir. Kafatası beyin dışarı inceleyin ve% 20 sakkaroz / gece PBS içinde% 4 PFA gecede düzeltmek ve tekrar yerine. ° C ve bölüm kriyostat kullanarak -80 OKT bileşik, dondurucuda Embed. - Doğum sonrası aşamalarında (örneğin dendrit ve dikenler incelemek için) de analiz için: Pentobarbitone intraperitoneal (40-60 mg / kg) ile yavru veya yetişkin farelerin uyuşturmak ve PBS içinde% 4 PFA takiben PBS ile transcardial perfüzyon, gerçekleştirebilir. % 4 PFA gece içinde kafatası ve post-düzeltmenin beynini parçalara ayır. Bir vibratome (d için 100 mikron bölümlerini kullanarak PBS, bölüm beyinleri yıkamadan sonraendrite analizi). Görüntü dendrit ve dikene 0.16-0.19 mm kalınlığında lamelleri kullanarak Aqua Poly / mount bölümler monte edin. 8. Temsilcisi sonuçları Şekil 3 CA1 (Şekil 3C, D) ve hipokampus (Şekiller 3E, F) dentat gyrus&#39;ta serebral kortekse (Şekil 3A, B) &#39;de electroporated hücrelerinin örnekleri gösterilmektedir. Wild-tip fareler GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) ve beyinleri postnatal gün (P) 14 hasat edildi ile E14.5 az electroporated edildi. DNA solüsyonu bir küçük hacimli (1 ug / ml bir çözeltiden 0.5 ul veya daha az) enjekte edilerek, bir kaç hücreleri izole GFP + hücreleri (Şekil 3) ve aynı zamanda bunların omurga dendritik arborization görselleştirilmesi olanak sağlayan, etiketli yüksek büyütmede (Şekil 4). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Şekil 1. dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir elektroporasyon protokolleri şematik. (A) bir GFP arasında Elektroporasyon vahşi tip ve mutant farelerde dendritler, omurilikteki karşılaştırmak için yapı. (B) GFP-shRNA (GFP aynı yapı ile ifade edilir) ve Elektroporasyon oluşturmak dendritler ve bir shRNA ile electroporated farelerde omurga karşılaştırmak için bir ilgi genindeki (X) ya da bir kontrol shRNA için spesifik. (C) IUE arzu edilir bir süre için shRNA ifade kısıtlamak için bir Kre indüklenebilen sistemi ile birlikte kullanılabilir. Bu deneyde, bir vektör 4-hydroxytamoxifen ile aktive edilebilir Kre rekombinazı bir biçimi ifade (CAG-ER T2 CreER T2; 1 ug / ul) 10, bir Kre bağlı olarak, belirli bir shRNA eksprese eden bir vektör ile birlikte electroporated edilir şekilde (1 mcg / ml ve rekombinasyon göstergesi (Kre tarafından CALNL-GFP yapı, GFP indüklenebilir ile;. 1 mcg / ml) 10 Verimdevirme ve cy shRNA konsantrasyonu artırmanın yanında CAG-ER T2 CreER T2 konsantrasyonu artırarak geliştirilebilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Şekil 2. Elektroporasyon Mekansal kontrolü. Bu şekil serebral korteksteki veya hipokampus hedeflemek için DNA enjeksiyon göre paddle elektrotlar konumlandırmak için burada gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Şekil 3. Utero ve dendritik çardak Görselleştirme serebral korteks ve hipokampus hücrelerinin electroporated. (A, B) GFP + serebral korteksteki piramidal hücre, (CD) piramidal hipokampusun CA1 hücreleri ve (E, F), P14 azından dentat gyrus&#39;ta granül hücreleri gösteren koronalde. Bir GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) E14.5 de electroporated edildi. Yüksek büyütme resimleri (B, D, F) İEÜ dendritler görselleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları 50 mikron (B, D ve F), 150 mikron (A, C, E) temsil eder. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Şekil 4. Inşa ifade eden bir GFP E14.5 az utero electroporated edildi P14 nöronlar dendritik dikenler Görselleştirilmesi. (A, B) hipokampal piramidal nöronların bazal dendritler gelen dikenlerin Yüksek büyütme görüntüler. Ölçek çubukları 5 um (A) ve 2 um (B) temsil eder.

<ol><li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37(2011).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li>
<li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li>
<li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li>
<li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li>
<li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamon+Moliner%2C+E+%22Comparative+Methods+in+Neuroanatomy%22">Comparative Methods in Neuroanatomy</a>. , Springer. New york. (1970).</li>
<li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li>
<li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. ong-term <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li>
<li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

İEÜ uzayda değil, zaman sadece gen ekspresyonu işlemek için güçlü bir araçtır. Biz bu tekniğin serebral korteks ve farelerin hipokampus dendrit ve dikenleri görselleştirmek ve genetik işlemek için kullanılabileceğini burada göstermektedir. Daha önce anılan avantajları yanında, İEÜ, yöntem Golgi aksine, immünhistokimya ile veya fenotip electroporated hücreleri örneğin sağlar situ hibridizasyon, kombine edilebilir dikkati çekiyor. Bu prosedür göreceli invaziv rağmen belirgin beyin anormallikleri neden olmadığını belirtmeyi de önemlidir. Buna ek olarak, hücresel seviyede, IUE electroporated nöronların 13 elektrofizyolojik özelliklerini değiştirmek değildir. Bizim gösteri dendrit ve omurga morfolojilerinin görselleştirme odaklanırken, E14.5 kortikal veya hipokampal nöronların İEÜ ayrıca akson oluşumu ve rehberlik gibi diğer gelişimsel olayları incelemek için kullanılabilir. Ekleyinition, protokol aynı tür farklı toplumlarda hedef embriyonik gelişimin diğer aşamalarında uygulanabilir. Örneğin, E18.5 bir developmentally çok geç kortikal elektroporasyon paradigma astrositik progenitörlerin 1 ifade sürmek için gerçekleştirilebilir. E14.5 de hipokampus bir elektroporasyon aynı zamanda CA1-CA3 piramidal nöron ataları ve dentat granül hücre progenitör hedef sağlar Benzer şekilde, bir geç hipokampal elektroporasyon (E18.5 veya erken doğum sonrası) farklı dentat granül hedef için izin verecek progenitörlerin 14. Bu durumda, DNA enjekte hacmi akım yoğunluğu yanı sıra arttırılabilir. İEÜ tarafından tanıtıldı transgenlerin epizomal kalması görünür ve bu nedenle ardışık hücre bölünmeleri takip hücrelerinden kaybolur. Bu nöronların olarak postmitotik hücreleri ise, epizomal transgenlerin uzun vadeli çalışma 13 izin elektroporasyon sonra ay için aktif kalması, 15. Bizim çalışmamızda, erken gelişimsel zaman noktalarından transgen ısrarla ifade İEÜ sonuçlarını kullanarak kortikal ve hipokampal nöron öncüleri hedefleme embriyonik belirten doğumdan sonra 7 hafta (biz analiz en son saat noktası) parlak GFP + hücreler kadar gözlemledim yetişkinliğe. Tekniğin bir akım sınırlama electroporated hücrelerin sayısı üzerinde ince bir kontrol uygulamak zor olmasıdır. Ancak DNA solüsyonu enjekte hacmi azaldığı için, bunun birkaç hücre etiketlemek ve izole GFP + hücrelerin yanı sıra dikenler dendritik arborization görselleştirmek mümkün olduğunu göstermiştir. Transfekte alan boyutu ve aynı zamanda, mevcut darbelerinin sayısı ya elektroporasyon kolları çapı yoğunluğu olarak elektroporasyon parametreleri değiştirerek ayarlanabilir. Toplamda İEÜ, uygulanması kolay hızlı bir yöntem vein vivo olarak dendrit ve dikenler incelemek için verimli.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Enjeksiyon iğneleri ve DNA çözeltisinin hazırlanması </td></tr><tr><td> Endofree Plazmid Maxi Seti </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam kılcal 1.0 mm OD x 0,58 mm ID </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader ipuçları </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Eppendorf 0.5 ul-10 ul / 2-20 ul pipetler için </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Cerrahi için Malzeme </td></tr><tr><td> Ekstra ince Iris makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halka forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> İğne tutucu </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vicryl emilebilir sütür </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Steril örtüler 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Steril bezlerden </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Pamuk tomurcukları </td><td> Temiz Çapraz Co, Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfin (Vetergesic) </td><td> Alstoe Hayvan Sağlığı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Göz jeli Viscotears </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Izofluran </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Pentobarbitone Sodyum% 20 </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Elektroporasyon </td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Platin Tweezertrode-5mm </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet mikroenjektör </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet mikroenjektör için ayak Kontrolü </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Kılcal tutucu </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Doku işleme </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar </td><td> ThermoScientific (Menzel-Gläser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Aqua Poly / montaj </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

kullanarak fare serebral korteks ve hippocampus görselleştirme ve dendritler ve spine genetik manipülasyon<em&gt; utero olarak</em&gt; elektroporasyon

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Utero elektroporasyon yılında (İEÜ) Embriyonik sinir sisteminden 1-5 farklı yörelerin kalkınmasına çalışmak için güçlü bir tekniği haline gelmiştir. Bu araç yaygın olarak hücresel çoğalma, farklılaşma ve özellikle gelişmekte olan serebral korteks 6-8 nöronal göçün düzenlenmesi incelemek için kullanılır olmuştur bugüne kadar. Burada detaylı bizim protokol utero serebral korteks ve hipokampus electroporate ve bu yaklaşımı, bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir kanıt sağlamak. Primer kültürlerinde nöronların Görselleştirme ve manipülasyon dendrit, omurga ve sinaps geliştirilmesinde rol süreçlerin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Ancak in vitro büyüyen nöronların normal gelişim sırasında dendrit ve / veya omurga oluşumu ve bakım etkileyebilecek tüm fizyolojik ipuçları maruz değildir. Dendrit ve omurga yapıları bilgilerimiz <eyabani türde veya mutant farelerde in vivo m&gt; Golgi-Cox yöntemi kullanılarak 9 gözlemler, çoğunlukla gelir. Bununla birlikte, Golgi boyama öngörülemeyen olarak kabul edilir. Gerçekten de, sinir hücreleri ve lif yolları grupları bitişik alanları boyama yoksun ise belirli alanlarda genellikle tamamen lekeli görünmesi ile, rastgele etiketlenir. Son çalışmalar floresan yapıları İEÜ mutant / wild-tip farelerden 10-11 (Şekil 1A) olarak dendrit dikenler gibi sinaps çalışmak için cazip bir alternatif yöntem temsil ettiğini göstermiştir. Dahası fare Knockouts üretimi ile karşılaştırıldığında, IUE belirli bir zaman süresince penceresi hücrelerin spesifik popülasyonda fonksiyonu çalışmaların kazanç-kayıp gerçekleştirmek için hızlı bir yaklaşımı temsil eder. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde IUE RNAi bir gen ya da shRNA 12 ifadesi üzerindeki zamansal kontrolü rafine yaklaşır indüklenebilen gen ekspresyonu ya indüklenebilen ile birlikte kullanılmıştır. İEÜ Bu avantajları dolayısıyla opene vard yeni boyutları sadece belirli beyin yapıları (Şekil 1B) değil, aynı zamanda gelişimi belirli bir zaman noktasında (Şekil 1C) olarak dendrit ve dikenler üzerinde gen ekspresyonu / bastırma etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Son olarak, İEÜ dendrit, omurga ve / veya sinaps geliştirme ilgili genler arasında işlevsel etkileşimleri belirlemek için yararlı bir araç sağlar. Gerçekten de, bu tür virüsler gibi diğer yöntemler gen aktarımı aksine, bu hücrelerin, aynı popülasyon içinde birden çok RNAi ya transgenlerin birleştirmek için açıktır. Özet olarak, zaten IUE beyin fonksiyonu ve hastalık moleküler mekanizmaları karakterizasyonu katkıda bulunan ve aynı zamanda dendritler ve omurga çalışması ve yardımcı olacaktır güçlü bir yöntemdir.

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero elektroporasyon (IUE), embriyonik sinir sisteminin farklı bölgelerinin gelişimini incelemek için güçlü bir teknik haline gelmiştir 1-5. Günümüze kadar...

Bu prosedürün amacı, fare serebral korteks ve hipokampüsündeki dendritleri ve spine'leri görselleştirmek ve genetik olarak manipüle etmek için in utero elektroporasyon yöntemini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle istenen plazmit DNA solüsyonunun embriyoların lateral ventrikülüne in utero enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, Palo elektrotlarının farklı konumları kullanılarak işlem tamamlanır.DNA enjeksiyonuna bağlı olarak, serebral korteks veya hipokampus elektropore edilir ve ardından istenen postnatal veya yetişkin evreler beklenir. Fareler perfüze edilir ve beyinler toplanır. Son olarak, beyinler vibratom ile dilimlenir.Nihayetinde, dendritler ve spine'lar konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilebilir. Üniter elektroporasyon tekniği, dendrit ve spine'ların incelenmesine yönelik diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında birçok avantaj sunar. Nitekim bu teknik, her şeyden önce bu özelliğin doğrudan in vivo olarak incelenmesine olanak tanır.Ayrıca, nakavt farelerin oluşturulmasıyla karşılaştırıldığında, elektroporasyon, gen baskılanmasının veya gen ekspresyonunun dendrit ve spinal gelişim üzerindeki etkilerini sadece belirli hücre yapılarında değil, aynı zamanda gelişimin belirli bir noktasında incelemek için hızlı bir yaklaşımdır. İndüklenebilir sistemlerin elektroporasyonda kullanılması, dendrit ve spinal gelişime dahil olan genler arasındaki fonksiyonel etkileşimleri belirlemek için de faydalı bir araçtır. Nitekim, örneğin virüslerin aksine, aynı hücre popülasyonunda birden fazla DNA'yı veya birden fazla transgeni birleştirmek bizim için daha kolaydır. Başlangıç olarak, DNA'yı su içinde istenen konsantrasyonlara seyreltin ve son konsantrasyonu 0,05% olacak şekilde fast green boyası ekleyin. Enjeksiyon için cam iğneler çekmek amacıyla bir mikro pipet çekici kullanın.Gebe bir fareyi isofloran kullanarak bir anestezik indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijeni dakikada iki litreye ayarlayın. Hayvan sağrılıma refleksini kaybettiğinde, onu ameliyat öncesi maskesine transfer edin. Her göze bir damla IGEL damlatın ve karın bölgesindeki tüyleri tıraş etmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.Uçuşan kılları toplamak için tıraş edilen bölgeyi bir kez klorheksidin ile temizleyin. Hayvanı, sırtı ısıtma pedinin üzerinde olacak şekilde cerrahi alandaki ikinci bir maskeye aktarın. Pedal refleks kaybolduğunda cerrahi işleme başlayın.Maske ve steril eldivenleri takın ve hayvanın üzerini steril bir örtüyle kapatın. Tıraş edilmiş bölgeyi klorheksidin ile en az üç kez temizleyin. Cilt boyunca orta hat üzerinden dikey bir insizyon yapmak için bir skalpel kullanın.Makas kullanarak, lineer dirsek boyunca abdomen kası üzerinde benzer bir insizyon yapın. En erişilebilir embriyoları seçin.Halka pensi iki embriyo arasına yerleştirin ve embriyo zincirini karın boşluğundan dikkatlice dışarı çekin. Bu noktadan itibaren, embriyoları önceden ısıtılmış steril PBS ile nemli tutun. Halka pens kullanarak.Embriyoyu amniyotik kese içinde nazikçe hareket ettirin ve başını halkalar arasında sabitleyin. Embriyoyu uterus duvarına daha yakın olacak şekilde yukarı itmek için hafifçe sıkın. Diğer elinizle kapiler tutucuyu alın ve lateral ventrikülü hedeflemek için iğneyi dikkatlice hemisferin ortasına yerleştirin.Rahim duvarı yüzeyindeki iğne hareketini minimize etmeye dikkat ederek ve kan damarlarını delmekten kaçınarak, yaklaşık 0,5 µL yeşil DNA solüsyonu enjekte etmek için pedala basın. Korteks elektroporasyonu için pozitif pedalı enjekte edilen ventrikül ile aynı tarafa, hipokampus elektroporasyonu için ise enjekte edilen ventrikülün karşı tarafına gelecek şekilde elektrotları embriyonun başının yanlarına yerleştirin. Ardından, bir saniye aralıklarla, 50 ms süreli beş adet 30 V elektrikli puls uygulayın.Embriyo ölümüne yol açacağı için plasenta üzerinden akım uygulamaktan kaçının. Sağkalım şansını artırmak için tüm embriyoları 30 dakika içinde enjekte edin ve elektrooperasyon işlemini gerçekleştirin; işlem tamamlandığında PBS ile karın boşluğunu yıkayın ve uterus kornusunu orijinal konumuna yerleştirmek için halka pens kullanın. Karın duvarını ve cildi kapatmak için vicryl emilebilir süturlar kullanın. Hayvan, uyanana kadar bir iyileşme odasına yerleştirin.Ardından, ameliyattan 24 ve 48 saat sonra hayvanı ısıtma pedli bir kafese aktarın. Ağrı, acı veya stres durumunu değerlendirmek için farenin davranışlarını kontrol edin ve beyin analizleri için hayvanı tartın. Postnatal aşamalarda, önceden perfüze edilmiş ve postfikse edilmiş beyinleri dilimlemek için bir vibratom kullanın ve dendritler ile spine'leri görüntülemek için kesitleri aqua poly mount ile monte edin.Bu şekil, E 14.5 evresinde elektroporasyon uygulanan farelerin serebral korteksinde, hipokampusun ca1 bölgesinde ve dentat girusunda elektropore edilmiş hücre örneklerini göstermektedir; GFP konstrüktü uygulanmış ve beyinler postnatal 14. günde hasat edilmiştir. Küçük hacimde DNA solüsyonu enjekte edilerek birkaç hücre işaretlenmiş; bu durum, izole GFP pozitif hücrelerin dendritik arborizasyonunun ve daha yüksek büyütmede spinalarının görüntülenmesine olanak sağlamıştır. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca birkaç hücreyi hedeflemek ve spinaları veya elektropore nöronları görüntüleyip nicelleştirebilmek için küçük hacimde DNA enjekte edilmesi gerektiği unutulmamalıdır.

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Bu protokol, in utero elektroporasyon yoluyla C57BL/6 merkezi sinir sistemindeki farklı bölgelerin spesifik olarak nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Bu protokolde korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatuma dönüşen bölgelerin transfeksiyonları için ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Astrositler serebral korteksi düzgün bir şekilde döşer ve karmaşık morfolojilerinin analizini hücresel düzeyde zorlaştırır. Burada sağlanan protokol, kortikal astrositleri ayırmak ve hacimlerini ve morfolojilerini kullanıcı dostu bir görüntü analizi ardışık düzeni ile analiz etmek için rahim elektroporasyonunu temel alan çok renkli etiketleme kullanır.

Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

Öğrenin fare serebral korteks ve hipokampusta dendrit ve spine görselleştirme için uterus içi elektroporasyon yöntemini. Bu teknik genetik manipülasyon ve in vivo nöron gelişimi çalışmaları için hızlı bir alternatif sunar.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon Utero olarak Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon

Daha fazla video keşfet