Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon

Bu prosedürün amacı, fare serebral korteks ve hipokampüsündeki dendritleri ve spine'leri görselleştirmek ve genetik olarak manipüle etmek için in utero elektroporasyon yöntemini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle istenen plazmit DNA solüsyonunun embriyoların lateral ventrikülüne in utero enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, Palo elektrotlarının farklı konumları kullanılarak işlem tamamlanır.

DNA enjeksiyonuna bağlı olarak, serebral korteks veya hipokampus elektropore edilir ve ardından istenen postnatal veya yetişkin evreler beklenir. Fareler perfüze edilir ve beyinler toplanır. Son olarak, beyinler vibratom ile dilimlenir.

Nihayetinde, dendritler ve spine'lar konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilebilir. Üniter elektroporasyon tekniği, dendrit ve spine'ların incelenmesine yönelik diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında birçok avantaj sunar. Nitekim bu teknik, her şeyden önce bu özelliğin doğrudan in vivo olarak incelenmesine olanak tanır.

Ayrıca, nakavt farelerin oluşturulmasıyla karşılaştırıldığında, elektroporasyon, gen baskılanmasının veya gen ekspresyonunun dendrit ve spinal gelişim üzerindeki etkilerini sadece belirli hücre yapılarında değil, aynı zamanda gelişimin belirli bir noktasında incelemek için hızlı bir yaklaşımdır. İndüklenebilir sistemlerin elektroporasyonda kullanılması, dendrit ve spinal gelişime dahil olan genler arasındaki fonksiyonel etkileşimleri belirlemek için de faydalı bir araçtır. Nitekim, örneğin virüslerin aksine, aynı hücre popülasyonunda birden fazla DNA'yı veya birden fazla transgeni birleştirmek bizim için daha kolaydır. Başlangıç olarak, DNA'yı su içinde istenen konsantrasyonlara seyreltin ve son konsantrasyonu 0,05% olacak şekilde fast green boyası ekleyin. Enjeksiyon için cam iğneler çekmek amacıyla bir mikro pipet çekici kullanın.

Gebe bir fareyi isofloran kullanarak bir anestezik indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijeni dakikada iki litreye ayarlayın. Hayvan sağrılıma refleksini kaybettiğinde, onu ameliyat öncesi maskesine transfer edin. Her göze bir damla IGEL damlatın ve karın bölgesindeki tüyleri tıraş etmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.

Uçuşan kılları toplamak için tıraş edilen bölgeyi bir kez klorheksidin ile temizleyin. Hayvanı, sırtı ısıtma pedinin üzerinde olacak şekilde cerrahi alandaki ikinci bir maskeye aktarın. Pedal refleks kaybolduğunda cerrahi işleme başlayın.

Maske ve steril eldivenleri takın ve hayvanın üzerini steril bir örtüyle kapatın. Tıraş edilmiş bölgeyi klorheksidin ile en az üç kez temizleyin. Cilt boyunca orta hat üzerinden dikey bir insizyon yapmak için bir skalpel kullanın.

Makas kullanarak, lineer dirsek boyunca abdomen kası üzerinde benzer bir insizyon yapın. En erişilebilir embriyoları seçin.

Halka pensi iki embriyo arasına yerleştirin ve embriyo zincirini karın boşluğundan dikkatlice dışarı çekin. Bu noktadan itibaren, embriyoları önceden ısıtılmış steril PBS ile nemli tutun. Halka pens kullanarak.

Embriyoyu amniyotik kese içinde nazikçe hareket ettirin ve başını halkalar arasında sabitleyin. Embriyoyu uterus duvarına daha yakın olacak şekilde yukarı itmek için hafifçe sıkın. Diğer elinizle kapiler tutucuyu alın ve lateral ventrikülü hedeflemek için iğneyi dikkatlice hemisferin ortasına yerleştirin.

Rahim duvarı yüzeyindeki iğne hareketini minimize etmeye dikkat ederek ve kan damarlarını delmekten kaçınarak, yaklaşık 0,5 µL yeşil DNA solüsyonu enjekte etmek için pedala basın. Korteks elektroporasyonu için pozitif pedalı enjekte edilen ventrikül ile aynı tarafa, hipokampus elektroporasyonu için ise enjekte edilen ventrikülün karşı tarafına gelecek şekilde elektrotları embriyonun başının yanlarına yerleştirin. Ardından, bir saniye aralıklarla, 50 ms süreli beş adet 30 V elektrikli puls uygulayın.

Embriyo ölümüne yol açacağı için plasenta üzerinden akım uygulamaktan kaçının. Sağkalım şansını artırmak için tüm embriyoları 30 dakika içinde enjekte edin ve elektrooperasyon işlemini gerçekleştirin; işlem tamamlandığında PBS ile karın boşluğunu yıkayın ve uterus kornusunu orijinal konumuna yerleştirmek için halka pens kullanın. Karın duvarını ve cildi kapatmak için vicryl emilebilir süturlar kullanın. Hayvan, uyanana kadar bir iyileşme odasına yerleştirin.

Ardından, ameliyattan 24 ve 48 saat sonra hayvanı ısıtma pedli bir kafese aktarın. Ağrı, acı veya stres durumunu değerlendirmek için farenin davranışlarını kontrol edin ve beyin analizleri için hayvanı tartın. Postnatal aşamalarda, önceden perfüze edilmiş ve postfikse edilmiş beyinleri dilimlemek için bir vibratom kullanın ve dendritler ile spine'leri görüntülemek için kesitleri aqua poly mount ile monte edin.

Bu şekil, E 14.5 evresinde elektroporasyon uygulanan farelerin serebral korteksinde, hipokampusun ca1 bölgesinde ve dentat girusunda elektropore edilmiş hücre örneklerini göstermektedir; GFP konstrüktü uygulanmış ve beyinler postnatal 14. günde hasat edilmiştir. Küçük hacimde DNA solüsyonu enjekte edilerek birkaç hücre işaretlenmiş; bu durum, izole GFP pozitif hücrelerin dendritik arborizasyonunun ve daha yüksek büyütmede spinalarının görüntülenmesine olanak sağlamıştır. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca birkaç hücreyi hedeflemek ve spinaları veya elektropore nöronları görüntüleyip nicelleştirebilmek için küçük hacimde DNA enjekte edilmesi gerektiği unutulmamalıdır.