Gömülü Eksozomların Kesitlendirilmesi, Boyanması ve TEM Görüntülemesi: TEM Kullanarak Eksozomların Yapısal Özelliklerini Görselleştirmek İçin Bir Protokol

Eksozomlar, lümen içinde bulunan DNA, RNA ve protein moleküllerini içeren bir lipid çift tabakası ile çevrili nano boyutlu, küresel veziküllerdir.

Transmisyon elektron mikroskobu veya TEM kullanarak eksozom yapısını görselleştirmek için, gömülü eksozomları içeren katı bir matris bloğu olan bir eksozom bloğu alarak başlayın. Bir ultra-mikrotom kullanarak, eksozom bloğunun ultra ince kesitlerini elde edin.

Eksozom bölümünü uygun bir ızgara üzerinde toplayın ve yüzeye yapışmasına izin verin. Izgara, sonraki boyama adımları için eksozom örneğine stabil destek sağlar.

Ardından, ızgarayı bir damla uranil asetat - ağır bir metal lekesi - üzerine yerleştirin ve istenen süre boyunca inkübe edin. Uranil iyonları, eksozomlarda bulunan lipitler, proteinler, DNA'lar ve RNA'lar ile etkileşime girer.

Daha sonra, eksozom bölümünü, ekzozomal biyomoleküllere de bağlanan kurşun sitrat ile boyayın. Kurşun sitrat, önceden bağlanmış uranil iyonlarına zayıf bir şekilde bağlanır ve görüntüleme sırasında arka plana karşı kontrastı artırır.

TEM kullanarak çift lekeli eksozomları gözlemleyin. TEM, elektron demetini eksozom numunesine odaklar. Eksozomdaki lekeli bölgeler, elektronları lekelenmemiş bölgelere kıyasla daha güçlü bir şekilde saçar.

Objektif açıklık, bu yüksek oranda dağılmış elektronları filtreler. Böylece, lekeli biyomoleküller içeren eksozomlar arka plandan daha koyu görünür.

Bir ultra mikrotom kullanarak, 60 nanometre kalınlığında bölümler hazırlayın. Bölümleri bir nikel ızgara üzerine yerleştirin ve bazılarını 20 dakika boyunca %2 uranil asetat ile çift boyayın, ardından 10 dakika kurşun sitrat ile boyayın. Ardından, lekeli bölümü bir transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin ve view 80 kV kullanarak numune ve maruz kalma süresi için otomatik ayarları izleyin. Görünümde bir eksozom görüntüsü varken, mikroskobun yazılımını kullanarak görüntüyü alın ve kaydedin.