Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Bu yöntem, bitki moleküler ve hücre biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, hücredeki proteinleri nasıl yapabiliriz. Bu tekniğin ana avantajı, tek bir ekspresyon vektöründe hücresel füzyon proteinlerinin birlikte eksprese edilmesinin yüksek verimliliğidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Guitao Zhong olacak.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi DNA parçalarının moleküler klonlanması için primerleri tasarlayın. Yarı bağımsız protein ekspresyon kasetlerinin inşası için gerekli olan DNA parçalarını, karşılık gelen primerleri ve yüksek kaliteli polimeraz ile standart PCR reaksiyonları ile çoğaltın. Bunlar arasında promotör, floresan raportör, hedef gen ve sonlandırıcı bulunur.

%1 agaroz jel kullanarak DNA bozunması ve DNA elektroforezi ile kontaminasyon arayarak ilk tur PCR ürünlerinin kalitesini inceleyin. PCR ürünlerini bir spektrofotometre ile ölçün. PCR ürünlerinin 260 ve 280 nanometredeki okumaları arasındaki oran 1.6 ile 1.8 arasında olmalıdır.

Aynı protein ekspresyon kaseti için tasarlanmış DNA parçalarını bir PCR tüpünde beş mikrolitrelik bir son hacme kadar karıştırın. DNS'yi farklı ifade kaseti verilerinden karıştırma hakkında. Eşit olduğundan, bağlanması gereken DNA moleküllerinin sayısının artması nedeniyle DNA montajının verimliliğini azaltır.

Şimdi, 5 mikrolitrelik DNA karışımına 15 mikrolitre 2x ana karışım ekleyin ve 50 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Tüm yarı bağımsız protein ekspresyon kasetini ikinci bir PCR turu ile çoğaltın. En dıştaki astarlarda şablon olarak ilk tur izotermal montaj reaksiyonundan 0,5 ila bir mikrolitre ürün kullanın.

30 döngü için 50 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde bir birim yüksek kaliteli polimeraz kullanın, ardından beş dakika boyunca 68 santigrat derecede son bir uzatma yapın. Daha sonra, son 10 mikrolitrelik reaksiyon hacmine dört birim küçük bir birim ekleyerek nihai protein ekspresyonu omurga vektörü POC 18'i ve vektör CAMBIA 1300'ü doğrusallaştırın. Bu vektörler, protein geçici ekspresyonu ve genetik transformasyon için tasarlanmıştır.

Kısıtlama sindirimini 25 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin. Sindirimi takiben, 65 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek kısıtlama enzimini etkisiz hale getirin. Daha sonra, protein ekspresyon kasetlerinin eşmolar DNA moleküllerini ve doğrusallaştırılmış son vektörü beş mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmine karıştırın.

Son olarak, reaksiyonu 15 mikrolitre 2x ana tampon ile karıştırarak ve 50 santigrat derecede 60 dakika inkübe ederek ikinci DNA rekombinasyonu turunu gerçekleştirin. Tütün BY-2 süspansiyon hücrelerini bombardımana hazırlamak için, vakum basıncını 40 milibar'a ayarlayarak, 30 mililitre 3 günlük kültürlenmiş BY-2 hücresini bir vakum pompası aracılığıyla 70 mililitrelik otoklavlanmış filtre kağıdına filtreleyin. Bu arada, bir petri kabına birkaç damla BY-2 hücre sıvı kültürel ortam ekleyin.

Üzerinde BY-2 hücreleri bulunan filtre kağıdını petri kabına aktarın. Arabidopsis yavru bitkilerini bombardımana hazırlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yedi günlük örnek bitkileri hazırlayın. Ardından, bombardımanın verimliliğini artırmak için bunları yeni bir yarı güçlü MS orta plakanın ortasındaki bir dikdörtgene aktarın.

Bitkileri aktarırken ve tabağa yerleştirirken üst üste binmemeye dikkat edin. Nemi korumak ve kalan adımlarda bitkilerin kurumasını önlemek için bitkilerin veya dokuların yüzeyine birkaç damla yarı kuvvetli MS sıvı ortamı ekleyin. Altın parçacıklarını plazmid DNA ile kaplamak için, önce altın mikro taşıyıcı çözeltisini üç dakika boyunca iyice girdaplayın.

Şimdi, 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe 25 mikrolitre altın parçacığı ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Litre spermidin başına 10 mikrolitre 25.46 miligram ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Daha sonra, mikrolitre plazmit DNA başına bir mikrogramdan beş mikrolitre ekleyin ve üç dakika boyunca girdap yapın.

Son olarak, litre kalsiyum klorür çözeltisi başına 25 mikrolitre 277.5 miligram ekleyin ve bir dakika boyunca girdap yapın. Tezgah üstü bir santrifüj kullanarak altın mikro taşıyıcıları beş saniye boyunca maksimum hızda döndürün. Santrifüjlemeyi takiben, peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice dışarı atın.

Daha sonra, peleti 200 mikrolitre mutlak etanol ile yıkayın ve peleti beş ila 10 saniye boyunca girdaplayarak yeniden askıya alın. Kazandıktan sonra, altın mikro taşıyıcıları beş saniye boyunca maksimum hızda döndürün ve etanolü çıkarın. Altın parçacıklarını 18 mikrolitre mutlak etanol içinde tekrar süspanse edin.

Ardından, üç mikro taşıyıcının ortasına altı mikrolitre partikül süspansiyonu alın ve kurumaya bırakın. DNA'yı parçacık bombardımanı yoluyla hücrelere ve bitkilere aktarmak için, önce parçacık dağıtım sistemini metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. Ardından, agromedium plakasındaki hücreleri veya bitkileri üç farklı pozisyonda üç kez bombardıman edin.

Floresan sinyallerinin gözlemlenmesinden önce bombardımana tutulan hücreleri ve bitkileri bitki büyüme odasında altı ila 72 saat karanlıkta tutun. Bitki büyüme odasını 24 saat karanlık ve 22 santigrat dereceye ayarlayın. Yavru bitkileri veya süspansiyon hücrelerini geleneksel bir cam slayt üzerine aktarın ve standart konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleme için üstüne nazikçe bir kapak sürgüsü koyun.

Metin protokolünde listelenen ayarları kullanarak, GFP etiketli proteinleri 485 nanometrede uyarın ve 525 nanometrede floresanı tespit edin. RFP etiketli proteinler için 585 nanometrede uyarın ve 608 nanometrede tespit edin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi floresan sinyallerin kolokalizasyon oranını hesaplayın.

Tütün BY-2 hücrelerinde arabidopsis VSR-2 ve arabidopsis SCAMP4'ün birlikte ekspresyonu, partikül bombardımanı ile sağlandı ve doğru lokalizasyonlar gösterdi. RFP arabidopsis VSR-2, arabidopsis SCAMP4-GFP'nin plazma membran lokalizasyonundan farklı olarak, bazı sitozolik punktat noktaları olan bir punktat paterni gösterir. Ayrıca, arabidopsis SCAMP4-GFP ve RFP arabidopsis VSR-2'yi birlikte eksprese eden arabidopsis transgenik bitkileri, agrobakteri aracılı dönüşüm yoluyla üretildi.

Kök ve kök saç hücrelerinde iki kimerik proteinin birlikte eksprese edilmesinin hücre altı lokalizasyonları gösterilmiştir. Geçirgen çalışmalarla tutarlı olarak, transgenik arabidopsis tedavisi, RFP arabidopsis VSR-2 işaretli prevakualar kompartmanlara neden olarak küçük halka benzeri bir yapı oluşturdu. Prefoldin A'nın indüklediği arabidopsis SCAMP GFP ile tedavi ise transgold G-ağı agregasyonunu etiketledi.

Negatif bir kontrol olarak, tütün BY-2 hücrelerinde ve arabidopsis kök ve kök kıl hücrelerinde aynı görüntü toplama ayarları uygulanarak çok az otofloresan sinyali gözlenir. Bu yöntem, proteinlerin hücre altı lokalizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir. Aynı zamanda protein yönündeki çalışmalara da uygulanabilir.

Bu teknik, geliştirilmesinden sonra bitki hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır. Canlı bitki hücresindeki proteinlerin hücre altı lokalizasyonlarını ve uzaysal etkileşimini uygun bir şekilde dışa aktarmak. Bu prosedürü takiben, bitkilerde birkaç füzyon proteininin nasıl birlikte eksprese edileceği gibi ek soruları yanıtlamak için PET aracılı transformasyon ve genetik çaprazlama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bombardımanla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman göz koruyucuları gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.