Etiketli Protein-Fosfolipid Vezikül Etkileşimlerini İncelemek için Kantitatif Akış Sitometrisi

Hücre zarı üzerindeki protein-fosfolipid etkileşimleri, çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesi için çok önemlidir.

Kantitatif akış sitometrisi kullanarak in vitro olarak hedef protein-fosfolipid etkileşimlerini tespit etmek için, tamponda istenen konsantrasyonda hücre zarı taklidi - mikron boyutlu, lipofilik boya etiketli fosfolipid vezikülleri içeren bir tüp alın.

Çözeltiye uygun bir floresan etiketli farklı hedef protein konsantrasyonu ekleyin.

Süspansiyonu akış sitometresine enjekte edin. Protein-fosfolipid etkileşimleri için yeterli zaman tanımak için akışkan sistem parametrelerini düşük bir akış hızına ayarlayın.

Floresan etiketli proteinler ve fosfolipid veziküller akış kanalında etkileşime girdikçe, veziküllere bağlı proteinlerin konsantrasyonu artar.

Bu kompleksler, uygun dalga boylarını sağlayan belirli floresan kanallarından lazer ışınlarından geçerken uyarılırlar. Kompleks içindeki bu uyarılmış proteinler ve fosfolipid veziküller, uygun dedektörler tarafından yakalanan temel duruma gevşeme üzerine ilgili floresan sinyallerini yayar.

Proteinlerin yüksek bir ortalama floresan yoğunluğunun saptanması, proteinin fosfolipid veziküllere bağlanmasının bir göstergesidir.

Tyrode tamponundaki fosfolipid vezikülleri 1 mikromolar konsantrasyona ve toplam 250 mikrolitre hacme seyrelterek kinetik bağlanma deneylerine başlayın. Daha sonra, toplam 500 mikrolitre hacim elde etmek için floresan etiketli pıhtılaşma faktörü X veya fX-fd'yi 500 nanomolar konsantrasyonda fosfolipid veziküllerle 1: 1 oranında karıştırın.

500 mikrolitre karışık süspansiyonu, 488 nanometre uyarma dalga boyuna sahip bir akış hızında ve FL2 kanalı için 42 genişliğinde 585 nanometre emisyon filtresinde akış sitometresine hemen enjekte edin.

Daha sonra, 633 nanometrede uyarma ile FL4 kanalındaki ortalama floresan ve 20 genişliğinde 660 nanometrede emisyon filtresini ölçün. Bağlanma doygunluğu elde edildiğinde, numuneyi Tyrode'un tamponu ile 20 kat hızla seyreltin ve bir taban çizgisi floresan veya bir platoya ulaşılana kadar ayrışmayı izleyin.