Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal
4 Ekim 2018
Burada, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olayların orta-yüksek performans analizi için bir protokol sunulmuştur. Fosfo akış sitometresi sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.
Bu yöntem, hücre biyolojisi ve immünoloji alanlarında ki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir; Bu tekniğin en büyük avantajı, orta ve yüksek iş yapma modasında tek hücreli sinyal analizi yapmanızı sağlamasıdır. Tamamlayıcı RPMI hücreleri yeniden askıya sonra 16/40 orta, 96 iyi V-alt plaka kuyularına hücre süspansiyon gerekli miktarda aktarın.
Önceden ısıtılmış 37 derece santigrat su banyosu için plaka aktarın ve orada 10 dakika dinlenmeye bırakın. Sonra düzeltme plakası kurmak için yeni bir 96 iyi plaka her kuyuya sabit tampon bir 60 mikrolitre ekleyin. Bu tabağı 37 derece su banyosuna yerleştirin.
50 mikrolitrelik bir kontrol örneğini tabağa aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. İsteğe bağlı olarak, simülasyon zamanı kursuna başlamak ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırmak için hücrelere mililitre anti-IgM başına 10 mikrolitre ekleyin. Her zaman noktasında 50 mikrolitrelik bir numuneyi sabitleme plakasına aktarın ve her numuneeklendikçe karıştırın.
Son örnek eklendikten sonra, 10 dakika su banyosunda düzeltme plakası bırakın. İlk olarak, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.
Daha sonra, her bir barkodlama reaktifi beş mikrolitre borulama tarafından, barkodlama reaktifleri ile taze bir 96 iyi V-alt plaka hazırlamak kuyu her örnek leke için gerekli kuyu sayısını doldurarak. Sabit hücre plakasında, her kuyudaki hücreleri 190 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Daha sonra, her iyi iyice karıştırma, barkodlama plaka karşılık gelen kuyuya hücrelerin her kuyu aktarın.
Plaka karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında dinlendirin. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, akış yıkama ile her iki kuyuda iki kez hücreleri yıkayın.
Sonra hücrelerin her kuyusu için akış yıkama 190 mikrolitre ekleyin. Barkodlu tüm örnekleri 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve her bir telafi kontrolünü ayrı bir 1,7 mililitrelik tüpe aktarın. 5 dakika için 500 kez G santrifüj ve supernatant atın.
Başlamak için, perm tampon üç bir mililitre iki mililitre aktarın 15 mililitrelik bir tüp. Eksi 20 santigrat derecede saklayın, böylece kullanıldığında buz gibi olacak. Hazır olduğunuzda, hücre kümelenmesini önlemek için girdap yaparken barkodlu hücre popülasyonu damla cıkan içeren 15 mililitrelik tüpe 1,5 mililitre buz gibi perma tampon ekleyin.
Aynı şekilde tazminat kontrolleri her 100 mikrolitre buz soğuk perm tampon ekleyin. Hücreleri hemen eksi 80 derecede en az 30 dakika dondurucuya aktarın. Antijen boyama başlamak için hazır olduğunuzda, dondurucu hücreleri çıkarın ve buz bir kutu ya transfer.
Hücreleri fazla akışla üç kez yıkayın. Hücreleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yeniden akış yıkama hacmi barkodlu hücre popülasyonu askıya, böyle fosfo-antikor leke başına hücre süspansiyon 25 mikrolitre olmasıdır.
200 mikrolitre akış yıkamada telafi kontrollerini yeniden askıya alın. Boyama için antikorhazırlamaya başlamak için, taze bir 96 iyi V-alt plaka her kuyuya, akış yıkama seyreltilmiş fosfo-spesifik antikor 10 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 50 mikrolitre lik son bir hacim için her kuyuya akış yıkamada seyreltilmiş 15 mikrolitre yüzey kalemi ve 25 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Karanlıkta oda sıcaklığında hücreler 30 dakika dinlendirin. Bundan sonra, akış yıkama ile iki kez lekeli hücreleri yıkayın. 5 dakika 500 kez G'de santrifüj.
Supernatant atın ve akış yıkama 150 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometri analizi ni gerçekleştirin. Sunulan protokolde, üç boyutlu barkodlama üç barkodlama boyaları birleştirilerek gerçekleştirilir.
Tek tek örnekler daha sonra her barkodlama reaktifi ve yan dağılım alanı üzerinde sonraki gating tarafından kıvrık. B hücre reseptörünün aşağısındaki 20 sinyal molekülünün bazal ve stimülasyona bağlı fosforilasyon düzeyleri daha sonra CLL hastalarınDan B hücrelerinde ve çeşitli koşullar altında normal kontrollerde karakterize edilir. Stat3 fosfo tirozin 705'in önemli ölçüde düzenlendiği görülmektedir.
Hücreler, B hücre reseptör yolu ile indüklenen sinyal sapmalarını belirlemek için 30 dakikaya kadar anti-IgM ile uyarılır. Mutasyona uğramamış IGVH'li hastalardan alınan CLL hücreleri anti-IgM stimülasyonuna karşı duyarlılığı artırırken, AKT fosfor serini 473 için istatistiksel olarak anlamlıdır. Hücreler daha sonra anormal AKT pS473 sinyalinin tersine çevrilip tersine çevrilemeyebileceğini test etmek için PI 3-kinaz delta inhibitörü idelalisib'e maruz kalır.
Burada gösterildiği gibi, kinap inhibitörlerinin CLL hücrelerinde anormal sinyalizasyonu normalleştirmek için uygulanabileceğini gösteren konsantrasyona bağlı bir şekilde tedavi üzerine anormal düzeyler önemli ölçüde azalır. Bu yordamı denemeden önce barkodlama reaktifleri ve antikorları titrat hatırlamak ve seçilen yüzey işaretleri fiksasyon ve permeabilizasyon reaktifleri ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. Hücrelerin fosfor analizi için süspansiyon olması gerekir, hala protokol anormal hücrelere veya doku tek hücre süspansiyon elde etmek için prosedürleri aşağıdaki adapte edilebilir, tüm tripzinasyon gibi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fosfo akış sitometrisi kullanarak hücresel düzeydeki protein fosforilasyon olaylarının orta ila yüksek kapasiteli analizi için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, sinyal iletim sapmalarının karakterize edilmesi, biyobelirteçlerin tanımlanması ve doğrulanması ile farmakodinamik değerlendirmeler için etkilidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
- Sinyal İletimi
Arka Plan
- Fosfo akış sitometrisi, tek hücre düzeyinde sinyal analizine olanak tanır.
- Bu teknik, sinyal yolaklarının çeşitli stimüliler veya ilaçlar tarafından nasıl etkilendiğini belirleyebilir.
- Orta ila yüksek kapasiteli analizler için uygundur.
- Yöntem, hücresel yanıtların ayrıntılı bir düzeyde incelenmesi kapasitesini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Protein fosforilasyonunu analiz etmek için güvenilir bir protokol sağlamak.
- Hücresel sinyal iletimindeki biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
- Farklı tedavilerin farmakodinamiğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücreler, takviye edilmiş RPMI 16/40 besiyerinde yeniden süspanse edilir.
- Belirli bir miktar hücre süspansiyonu, 96 kuyucuklu V-tabanlı plakaya aktarılır.
- Plaka, 37 °C'ye önceden ısıtılmış bir su banyosunda inkübe edilir.
- Analiz için tespit plakası hazırlamak amacıyla tespit tamponu eklenir.
Temel Sonuçlar
- Bu yöntem, sinyal yolaklarının verimli bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır.
- İlaçların hücresel sinyalizasyon üzerindeki etkilerine dair içgörüler sağlar.
- Tek hücre çözünürlüğü, hücresel yanıtların anlaşılmasını geliştirir.
- Sonuçlar, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yol açabilir.
Sonuçlar
- Fosfo akış sitometrisi, protein fosforilasyonunu incelemek için değerli bir araçtır.
- Protokol, yüksek kapasiteli analize olanak tanıyarak çeşitli araştırma uygulamaları için erişilebilir hale getirir.
- Gelecekteki çalışmalar, karmaşık sinyal ağlarını keşfetmek için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Floresan hücre barkodlamalı fosfo akış sitometrisi, protein fosforilasyonunun orta ila yüksek kapasiteli tek hücre analizine olanak tanıyarak onkoloji ve immünolojide hedef doğrulamayı ve biyobelirteç keşfini destekler. İlaç kaynaklı sinyalizasyon değişikliklerini tek hücre çözünürlüğünde nicelleştiren bu yöntem, preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır ve terapötik geliştirmedeki devam/dur kararlarını bilgilendirir. Standart sitometre donanımıyla uyumluluğu, yolak sorgulama ve farmakodinamik değerlendirme için keşif iş akışlarına ölçeklenebilir entegrasyon sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili hücrelerde B hücresi reseptörü gibi reseptörlerin altındaki sinyal proteinlerinin fosforilasyon dinamiklerini ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Stimüle edilmiş ve inhibe edilmiş koşullar altında, hastadan türetilmiş primer hücrelerde 20 sinyal molekülünün çoklu tespiti aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: İlaç duyarlılığı ve direnç mekanizmalarıyla korelasyon gösteren AKT pS473 ve STAT3 pY705 gibi aberan düğümleri tanımlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Floresan hücre barkodlama, birden fazla örneğin ve koşulun tek bir tüpte toplanmasına olanak tanıyarak standart akış sitometrelerinde işlem kapasitesini artırır ve analizler arası değişkenliği azaltır.
- Kantitatif Çıktı: Fosforilasyon seviyeleri hakkında tek hücre çözünürlüğünde veriler üretir; bu da CLL modellerinde idelalisib gibi kinaz inhibitörlerinin doz-yanıt analizine imkan tanır.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Standardize edilmiş fiksasyon, permeabilizasyon ve antikor boyama adımları, boylamsal tarama kampanyaları için farklı immün hücre tiplerine ve stimülasyon paradigmalarına adaptasyonu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Sinyal iletim sapmalarını modellemek için primer KLL hasta hücrelerini kullanarak, hedeflenmiş tedavilerin değerlendirilmesi için klinik olarak ilgili bir sistem sunar.
- Translasyonel Süreklilik: pS473 azalmasını IGVH mutasyon durumuyla ilişkilendirerek ex vivo ilaç yanıtını biyobelirteç keşfiyle bağlar ve hasta stratifikasyon stratejilerini destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: PI3Kδ inhibisyonu ile anormal sinyal iletiminin geri döndürülebildiğini kanıtlayarak, preklinik modellerde kinaz inhibitörleri için hedef etkileşimini ve etki mekanizmasını doğrular.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Yöntem; özellikle sinyal iletim modülatörlerine odaklanan immünoloji ve onkoloji programlarında, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Primer insan B hücrelerinde stimülasyonla indüklenen fosforilasyon değişikliklerini nicelendirerek hipotez testlerini destekler; bazal ve ilaçla işlem görmüş koşullar altındaki yolak aktivasyon durumlarını netleştirir.
- Tarama: Bileşiklerin sinyal ağları üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir, multipleks değerlendirmesine olanak tanır; barkodlama ise dozların, zaman noktalarının ve genetik arka planların yan yana karşılaştırılmasını kolaylaştırır.
- Analitik: Koşullar arasında sinyal durumlarının istatistiksel karşılaştırmasına izin veren kantitatif, tek hücreli fosforilasyon çıktıları sağlayarak biyobelirteç eşik değerlerinin belirlenmesini ve yanıt sınıflandırmasını destekler.
- Translasyonel Araştırma: Primer CLL örneklerini kullanarak in vitro ilaç yanıtını ex vivo biyobelirteç doğrulamasıyla ilişkilendirir ve preklinikten kliniğe geçiş kriterleriyle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standardize reaktif paneli ve barkodlama stratejisi; sitokin sinyalleme, antijen reseptör aktivasyonu veya immün ve malign hücre popülasyonlarındaki ilaç mekanizmaları üzerine çalışan projeler genelinde yeniden kullanıma olanak tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Heterojen primer hücre örneklerinde reseptör stimülasyonunu, tek hücre çözünürlüğünde aşağı akış efektör fosforilasyonuna bağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Barkodlama içeren standardize edilmiş iş akışı, örnek işlem kapasitesini artırır, teknik varyasyonu minimize eder ve mevcut akış sitometrisi platformlarında cihaz kullanımını maksimize eder.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonu ve yolak inhibisyonuna dair erken kanıtlar sunarak devam/dur kararlarını iyileştirir ve biyolojik aktivitesi yetersiz olan bileşiklere yapılan yatırımı azaltır.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilgili insan hücrelerinde hedef etkileşimi ve sinyalizasyon normalizasyonuna dayalı olarak, risk ayarlı öncü madde önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Sinyal özgüllüğünü sağlamak ve arka plan gürültüsünü minimize etmek için akış sitometrisi, antikor titrasyonu ve fosfo-spesifik reaktif validasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- Çoklu fosfo- ve yüzey belirteç panelleri için yeterli lazer ve detektör konfigürasyonuna sahip akış sitometrelerine erişime bağlıdır.
- Fosforilasyon sinyallerinin tekrarlanabilirliğini korumak için fiksasyon, permeabilizasyon ve yıkama adımlarının kullanıcılar ve merkezler arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Spektral örtüşmeyi önlemek ve analiz sırasında doğru örnek dekonvolüsyonu sağlamak için barkodlama reaktif konsantrasyonlarının optimizasyonunu gerektirir.
- Süspansiyon halindeki hücrelerle sınırlıdır; adezyon bağımlı veya doku örneklerinin, valide edilmiş enzimatik veya mekanik yöntemler kullanılarak önceden tek hücreli süspansiyona ayrılması gerekir.
