Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal
October 4th, 2018
Burada, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olayların orta-yüksek performans analizi için bir protokol sunulmuştur. Fosfo akış sitometresi sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.
Bu yöntem, hücre biyolojisi ve immünoloji alanlarında ki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir; Bu tekniğin en büyük avantajı, orta ve yüksek iş yapma modasında tek hücreli sinyal analizi yapmanızı sağlamasıdır. Tamamlayıcı RPMI hücreleri yeniden askıya sonra 16/40 orta, 96 iyi V-alt plaka kuyularına hücre süspansiyon gerekli miktarda aktarın.
Önceden ısıtılmış 37 derece santigrat su banyosu için plaka aktarın ve orada 10 dakika dinlenmeye bırakın. Sonra düzeltme plakası kurmak için yeni bir 96 iyi plaka her kuyuya sabit tampon bir 60 mikrolitre ekleyin. Bu tabağı 37 derece su banyosuna yerleştirin.
50 mikrolitrelik bir kontrol örneğini tabağa aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. İsteğe bağlı olarak, simülasyon zamanı kursuna başlamak ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırmak için hücrelere mililitre anti-IgM başına 10 mikrolitre ekleyin. Her zaman noktasında 50 mikrolitrelik bir numuneyi sabitleme plakasına aktarın ve her numuneeklendikçe karıştırın.
Son örnek eklendikten sonra, 10 dakika su banyosunda düzeltme plakası bırakın. İlk olarak, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.
Daha sonra, her bir barkodlama reaktifi beş mikrolitre borulama tarafından, barkodlama reaktifleri ile taze bir 96 iyi V-alt plaka hazırlamak kuyu her örnek leke için gerekli kuyu sayısını doldurarak. Sabit hücre plakasında, her kuyudaki hücreleri 190 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Daha sonra, her iyi iyice karıştırma, barkodlama plaka karşılık gelen kuyuya hücrelerin her kuyu aktarın.
Plaka karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında dinlendirin. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, akış yıkama ile her iki kuyuda iki kez hücreleri yıkayın.
Sonra hücrelerin her kuyusu için akış yıkama 190 mikrolitre ekleyin. Barkodlu tüm örnekleri 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve her bir telafi kontrolünü ayrı bir 1,7 mililitrelik tüpe aktarın. 5 dakika için 500 kez G santrifüj ve supernatant atın.
Başlamak için, perm tampon üç bir mililitre iki mililitre aktarın 15 mililitrelik bir tüp. Eksi 20 santigrat derecede saklayın, böylece kullanıldığında buz gibi olacak. Hazır olduğunuzda, hücre kümelenmesini önlemek için girdap yaparken barkodlu hücre popülasyonu damla cıkan içeren 15 mililitrelik tüpe 1,5 mililitre buz gibi perma tampon ekleyin.
Aynı şekilde tazminat kontrolleri her 100 mikrolitre buz soğuk perm tampon ekleyin. Hücreleri hemen eksi 80 derecede en az 30 dakika dondurucuya aktarın. Antijen boyama başlamak için hazır olduğunuzda, dondurucu hücreleri çıkarın ve buz bir kutu ya transfer.
Hücreleri fazla akışla üç kez yıkayın. Hücreleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yeniden akış yıkama hacmi barkodlu hücre popülasyonu askıya, böyle fosfo-antikor leke başına hücre süspansiyon 25 mikrolitre olmasıdır.
200 mikrolitre akış yıkamada telafi kontrollerini yeniden askıya alın. Boyama için antikorhazırlamaya başlamak için, taze bir 96 iyi V-alt plaka her kuyuya, akış yıkama seyreltilmiş fosfo-spesifik antikor 10 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 50 mikrolitre lik son bir hacim için her kuyuya akış yıkamada seyreltilmiş 15 mikrolitre yüzey kalemi ve 25 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Karanlıkta oda sıcaklığında hücreler 30 dakika dinlendirin. Bundan sonra, akış yıkama ile iki kez lekeli hücreleri yıkayın. 5 dakika 500 kez G'de santrifüj.
Supernatant atın ve akış yıkama 150 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometri analizi ni gerçekleştirin. Sunulan protokolde, üç boyutlu barkodlama üç barkodlama boyaları birleştirilerek gerçekleştirilir.
Tek tek örnekler daha sonra her barkodlama reaktifi ve yan dağılım alanı üzerinde sonraki gating tarafından kıvrık. B hücre reseptörünün aşağısındaki 20 sinyal molekülünün bazal ve stimülasyona bağlı fosforilasyon düzeyleri daha sonra CLL hastalarınDan B hücrelerinde ve çeşitli koşullar altında normal kontrollerde karakterize edilir. Stat3 fosfo tirozin 705'in önemli ölçüde düzenlendiği görülmektedir.
Hücreler, B hücre reseptör yolu ile indüklenen sinyal sapmalarını belirlemek için 30 dakikaya kadar anti-IgM ile uyarılır. Mutasyona uğramamış IGVH'li hastalardan alınan CLL hücreleri anti-IgM stimülasyonuna karşı duyarlılığı artırırken, AKT fosfor serini 473 için istatistiksel olarak anlamlıdır. Hücreler daha sonra anormal AKT pS473 sinyalinin tersine çevrilip tersine çevrilemeyebileceğini test etmek için PI 3-kinaz delta inhibitörü idelalisib'e maruz kalır.
Burada gösterildiği gibi, kinap inhibitörlerinin CLL hücrelerinde anormal sinyalizasyonu normalleştirmek için uygulanabileceğini gösteren konsantrasyona bağlı bir şekilde tedavi üzerine anormal düzeyler önemli ölçüde azalır. Bu yordamı denemeden önce barkodlama reaktifleri ve antikorları titrat hatırlamak ve seçilen yüzey işaretleri fiksasyon ve permeabilizasyon reaktifleri ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. Hücrelerin fosfor analizi için süspansiyon olması gerekir, hala protokol anormal hücrelere veya doku tek hücre süspansiyon elde etmek için prosedürleri aşağıdaki adapte edilebilir, tüm tripzinasyon gibi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olaylarının orta ila yüksek verimli analizi için fosfo akış sitometrisi kullanarak bir protokol sunar. Bu yöntem, sinyal bozukluklarını karakterize etmek, biyobelirteçleri tanımlamak ve doğrulamak ve farmakodinamiği değerlendirmek için etkilidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
- Sinyal İletimi
Arka Plan
- Fosfo akış sitometrisi, tek hücreli sinyal analizi için olanak tanır.
- Bu teknik, sinyal yollarının çeşitli uyaranlar veya ilaçlar tarafından nasıl etkilendiğini ele alabilir.
- Orta ila yüksek verimli analiz için uygundur.
- Yöntem, hücresel tepkileri detaylı düzeyde inceleme kabiliyetini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Protein fosforilasyonunu analiz etmek için güvenilir bir protokol sağlamak.
- Hücresel sinyalleşmede biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
- Farklı tedavilerin farmakodinamiklerini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücreler, takviyeli RPMI 16/40 ortamında yeniden süspanse edilir.
- Belirli miktarda hücre süspansiyonu, 96 kuyu V-tabanlı plakaya aktarılır.
- Plaka, 37 derece Celsius'ta ön ısıtılmış su banyosunda inkübe edilir.
- Sabitleme tamponu, analiz için sabitleme plakasının kurulması için eklenir.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, sinyal yollarının verimli analizini sağlar.
- Hücresel sinyalleşme üzerinde ilaçların etkileri hakkında bilgiler sağlar.
- Tek hücreli çözünürlük, hücresel tepkilerin anlaşılmasını artırır.
- Sonuçlar, potansiyel terapötik hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir.
Sonuçlar
- Fosfo akış sitometrisi, protein fosforilasyonunu incelemek için değerli bir araçtır.
- Protokol, çeşitli araştırma uygulamaları için erişilebilir kılan yüksek verimli analiz sağlar.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemi kullanarak karmaşık sinyal ağılarını keşfetmeye devam edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
