Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal

Burada, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olayların orta-yüksek performans analizi için bir protokol sunulmuştur. Fosfo akış sitometresi sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.

Bu yöntem, hücre biyolojisi ve immünoloji alanlarında ki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir; Bu tekniğin en büyük avantajı, orta ve yüksek iş yapma modasında tek hücreli sinyal analizi yapmanızı sağlamasıdır. Tamamlayıcı RPMI hücreleri yeniden askıya sonra 16/40 orta, 96 iyi V-alt plaka kuyularına hücre süspansiyon gerekli miktarda aktarın.

Önceden ısıtılmış 37 derece santigrat su banyosu için plaka aktarın ve orada 10 dakika dinlenmeye bırakın. Sonra düzeltme plakası kurmak için yeni bir 96 iyi plaka her kuyuya sabit tampon bir 60 mikrolitre ekleyin. Bu tabağı 37 derece su banyosuna yerleştirin.

50 mikrolitrelik bir kontrol örneğini tabağa aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. İsteğe bağlı olarak, simülasyon zamanı kursuna başlamak ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırmak için hücrelere mililitre anti-IgM başına 10 mikrolitre ekleyin. Her zaman noktasında 50 mikrolitrelik bir numuneyi sabitleme plakasına aktarın ve her numuneeklendikçe karıştırın.

Son örnek eklendikten sonra, 10 dakika su banyosunda düzeltme plakası bırakın. İlk olarak, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.

Daha sonra, her bir barkodlama reaktifi beş mikrolitre borulama tarafından, barkodlama reaktifleri ile taze bir 96 iyi V-alt plaka hazırlamak kuyu her örnek leke için gerekli kuyu sayısını doldurarak. Sabit hücre plakasında, her kuyudaki hücreleri 190 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Daha sonra, her iyi iyice karıştırma, barkodlama plaka karşılık gelen kuyuya hücrelerin her kuyu aktarın.

Plaka karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında dinlendirin. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, akış yıkama ile her iki kuyuda iki kez hücreleri yıkayın.

Sonra hücrelerin her kuyusu için akış yıkama 190 mikrolitre ekleyin. Barkodlu tüm örnekleri 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve her bir telafi kontrolünü ayrı bir 1,7 mililitrelik tüpe aktarın. 5 dakika için 500 kez G santrifüj ve supernatant atın.

Başlamak için, perm tampon üç bir mililitre iki mililitre aktarın 15 mililitrelik bir tüp. Eksi 20 santigrat derecede saklayın, böylece kullanıldığında buz gibi olacak. Hazır olduğunuzda, hücre kümelenmesini önlemek için girdap yaparken barkodlu hücre popülasyonu damla cıkan içeren 15 mililitrelik tüpe 1,5 mililitre buz gibi perma tampon ekleyin.

Aynı şekilde tazminat kontrolleri her 100 mikrolitre buz soğuk perm tampon ekleyin. Hücreleri hemen eksi 80 derecede en az 30 dakika dondurucuya aktarın. Antijen boyama başlamak için hazır olduğunuzda, dondurucu hücreleri çıkarın ve buz bir kutu ya transfer.

Hücreleri fazla akışla üç kez yıkayın. Hücreleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yeniden akış yıkama hacmi barkodlu hücre popülasyonu askıya, böyle fosfo-antikor leke başına hücre süspansiyon 25 mikrolitre olmasıdır.

200 mikrolitre akış yıkamada telafi kontrollerini yeniden askıya alın. Boyama için antikorhazırlamaya başlamak için, taze bir 96 iyi V-alt plaka her kuyuya, akış yıkama seyreltilmiş fosfo-spesifik antikor 10 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 50 mikrolitre lik son bir hacim için her kuyuya akış yıkamada seyreltilmiş 15 mikrolitre yüzey kalemi ve 25 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Karanlıkta oda sıcaklığında hücreler 30 dakika dinlendirin. Bundan sonra, akış yıkama ile iki kez lekeli hücreleri yıkayın. 5 dakika 500 kez G'de santrifüj.

Supernatant atın ve akış yıkama 150 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometri analizi ni gerçekleştirin. Sunulan protokolde, üç boyutlu barkodlama üç barkodlama boyaları birleştirilerek gerçekleştirilir.

Tek tek örnekler daha sonra her barkodlama reaktifi ve yan dağılım alanı üzerinde sonraki gating tarafından kıvrık. B hücre reseptörünün aşağısındaki 20 sinyal molekülünün bazal ve stimülasyona bağlı fosforilasyon düzeyleri daha sonra CLL hastalarınDan B hücrelerinde ve çeşitli koşullar altında normal kontrollerde karakterize edilir. Stat3 fosfo tirozin 705'in önemli ölçüde düzenlendiği görülmektedir.

Hücreler, B hücre reseptör yolu ile indüklenen sinyal sapmalarını belirlemek için 30 dakikaya kadar anti-IgM ile uyarılır. Mutasyona uğramamış IGVH'li hastalardan alınan CLL hücreleri anti-IgM stimülasyonuna karşı duyarlılığı artırırken, AKT fosfor serini 473 için istatistiksel olarak anlamlıdır. Hücreler daha sonra anormal AKT pS473 sinyalinin tersine çevrilip tersine çevrilemeyebileceğini test etmek için PI 3-kinaz delta inhibitörü idelalisib'e maruz kalır.

Burada gösterildiği gibi, kinap inhibitörlerinin CLL hücrelerinde anormal sinyalizasyonu normalleştirmek için uygulanabileceğini gösteren konsantrasyona bağlı bir şekilde tedavi üzerine anormal düzeyler önemli ölçüde azalır. Bu yordamı denemeden önce barkodlama reaktifleri ve antikorları titrat hatırlamak ve seçilen yüzey işaretleri fiksasyon ve permeabilizasyon reaktifleri ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. Hücrelerin fosfor analizi için süspansiyon olması gerekir, hala protokol anormal hücrelere veya doku tek hücre süspansiyon elde etmek için prosedürleri aşağıdaki adapte edilebilir, tüm tripzinasyon gibi.