Name: Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin fosfo akış sitometrisi ile tek hücreli protein fosforilasyon analizi yapmayı. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve immünolojide sinyal yolu bozukluklarını ve biyobelirteçleri keşfetmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Profesör Kjetil Taskén laboratuarda yapılmıştır ve Norveç Kanser Derneği ve Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen tarafından desteklenmiştir. Johannes Landskron ve Marianne Enger el yazması eleştirel okuma için kabul vardır.

Yazılı onam tüm bağış takip kan örnekleri alındı. Tıp ve sağlık araştırma etik ve Güney-Doğu Norveç için çalışma bölge Komitesi tarafından kabul edildi ve insan kanı üzerinde araştırma Helsinki Bildirgesi8uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Not: 1-3 adımları bir doku kültürü başlıklı steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
1. yalıtım periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) CLL hasta kan örnekleri
Dikkat: İnsan kanı seviye 2 için düzenlemelere göre ele alınmalıdır.
<ol><li>Kan fosfat tamponlu tuz ile 1:1 oranında seyreltin (PBS: 136.9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1.8 mM KH2PO4, pH 7,4) ve 50 mL tüpler (30 mL/tüp) aktarmak.</li>
	<li>Dikkatli bir yoğunluk gradient Orta (Örneğin, Lymphoprep) 10 mL tüp 10 mL pipet kullanarak alt katman.</li>
	<li>4 ° C'de 20 dk için 800 x g, santrifüj PBMCs şimdi yoğunluğu üzerinde gradyan orta katmanı görülebilir.</li>
	<li>Pasteur pipet hücreleri iki yeni 50 mL tüpler içine aktarmak için kullanın. PBS (tüpler doldurmak) iki kez yıkayın.</li>
	<li>15 dk. atma süpernatant 350 x g, santrifüj kapasitesi ve PBS 3 mL resuspend.</li>
	<li>Tercih edilen bir yöntem kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>350 x g 5 dk. atmak için de hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi. Not: 1.8-3.2 isteğe bağlı adımlardır. Doğrudan 3.3 tutamaçlarından mümkündür.</li>
	<li>% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş fetal Sığır serum (FBS) hücrelerde resuspend ve aşağı cryo borular kullanarak uygun aliquots dondurma. Not: DMSO hücrelere toksiktir. Hızlı hücreleri FBS/DMSO ile karışınca iş. Hücreler sıvı azot içinde saklı uzun süreli olabilir.</li>
</ol>2. hücreleri çözme
<ol><li>Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu hücrelerde çözülme. Not: DMSO hücrelere toksiktir. Hızlı DMSO maruz sınırlamak için çalışırlar.</li>
	<li>Bir kez 10 mL soğuk Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI 1640 tamamlayıcı GlutaMAX ile bkz: Malzemeler tablo) içeren hücreleri yıkayın.</li>
	<li>5 dakika süreyle 300 x g, santrifüj süpernatant atmak.</li>
	<li>Sodyum pyruvate, MEM esansiyel olmayan amino asitler ve penisilin/streptomisin (1 x seyreltme talimatlara göre ekledi) ve % 10 RPMI 1640 orta hücrelerde resuspend FBS. Hücreleri bir küçük hücreli kültür şişesi aktarmak ve bir kuluçka %5 CO2, 37 ° C hücrelere ayarlamak izin vermek 1 saat bırakın.</li>
</ol>3. hücre hazırlanması
<ol><li>Tercih edilen bir yöntem kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücreleri bir 50 mL tüp aktarmak ve 5 dakika süreyle 300 x g, santrifüj süpernatant atın.</li>
	<li>%1 ile desteklenmiş RPMI 1640 Orta (adım 2.2) hücrelerde resuspend FBS en fazla 50 x 106 hücre/ml.</li>
	<li>Hücre süspansiyon gerekli miktarda 96 iyi V-alt plaka wells aktarın. Not: Kuyu sayısı koşulları test edilecek sayısına karşılık gelir. Bir stimülasyon zamanlı kurs için örnekleri tek bir kuyudan çizilir. Zaman noktası + 50 µL ölü biriminin başına 50 µL örnek hesaplayın. Örnekleri için tazminat denetimleri (bir günahı örnek + barkod boya başına bir örnek) kaydedin.</li>
	<li>Transfer 96 iyi plaka önceden ısıtılmış 37 ° C su banyosu. Hücreler için 10 dk bekletin.</li>
</ol>4. stimülasyon ve hücreleri fiksasyonu
Not: 4-8 (Yani, değil steril) laboratuvar bankta adımları.
Dikkat: Arabellek düzeltmek ana madde ben olduğunu zehirli paraformaldehyde (solunum yolu ve deri temas). Özenle hallederim.
<ol><li>96 iyi V-alt plaka düzeltmek arabelleği 60 µL ile hazırlamak ben iyi örnek başına ücret. 37 ° C su banyosu içinde bırakın. Not: Hücreler: Düzeltme arabellek 1:1 olmalıdır. 37 ° C'de buharlaşma için izin vermek için düzeltme arabellek başlangıçta bolluk içinde olur.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, uyuşturucu stimülasyon önce hücrelerle tedavi.</li>
	<li>50 µL denetimi örneğini düzeltme plakasına aktarın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, stimülasyon zamanlı kurs 10 µg/mL anti-IgM hücrelere ekleyerek başlayın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>50 µL örnek her zaman-nokta düzeltme plakasına aktarın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Not: Anti-indüklenen genellikle erken başlatılır sinyal IgM (dakika).</li>
	<li>Son örnek eklendikten sonra 10 dk 37 ° C'de düzeltme plaka bırakın.</li>
</ol>5. floresan cep Barkod (FCB)
Not: Barkodlama reaktifler bir listesi için bkz. Tablo 1 .
<ol><li>Sabit hücreleri 3 yıkama x PBS (kuyuları doldurmak) ile.</li>
	<li>5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.</li>
	<li>96 iyi V-alt plaka barkodlama reaktifleri ile hazırlayın. Damlalıklı 5 µL her barkod reaktif boyama matris, Örneğin, Şekil1B takip tüm örneklerini leke için gerekli kombinasyon kuyuda başına. Her örnek farklı tedarikçilerden konsantrasyonları benzersiz bir kombinasyonu gerekir.</li>
	<li>PBS ve aktarma barkodlama plaka 190 µL hücrelerde resuspend. İyice karıştırın. Not: Her barkod reaktif için kullanılan en yüksek son konsantrasyon ile bir tazminat örnek leke ve bir günahı örnek kaydedin.</li>
	<li>Hücre içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dakika bırakın.</li>
	<li>Lekeli hücreleri 2 yıkama ile akış yıkama (PBS, %1 FBS, %0,09 sodyum azid) x (kuyuları dolgu).</li>
	<li>5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.</li>
	<li>Akış yıkama 190 µL hücrelere ekleme ve bir 15 mL tüp barkodlu örneklerinde birleştirir. Her tazminat ayrı 1.7 mL tüp aktaracağım.</li>
	<li>5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.</li>
</ol>6. hücre Permeabilization hücre içi antijen boyama için
Uyarı: Toksik (solunum yolu ve deri temas) ve yanıcı olan metanol perma arabellek III ana madde olduğunu. Özenle hallederim.
<ol><li>Perm arabellek III 2 mL 15 mL tüp aktarın. Yani üye olmakla kullanım buz gibi-20 ° C'de bırakın. Not: Perm arabellek-20 ° C'de deneme başından itibaren bırakılabilir.</li>
	<li>Barkodlu hücre nüfus (15 mL tüp içinde) buz gibi perma arabelleğe 1,5 mL ve 100 µL her tazminat denetimi (1.7 mL tüpler) drop-wise vortexing hücreleri birlikte yığın önlemek için ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri doğrudan-80 ° C'ye aktarma En az 30 dk için bırakın. Not: Bu noktada deneme duraklatmak için doğaldır. Perm arabellek hücrelerde-80 ° C'de saklı uzun vadeli olabilir</li>
</ol>7. antikor boyama
Not: Malzemeler tablo bildirilen Fosfo-özel antikorlar bir listesi için bkz:.
<ol><li>Hücreleri-80 ° C'den bir buz kutusuna aktarın.</li>
	<li>3 x akışı yıkama ile yıkayın. Not: Hücre Pelet görmek için fazla akışı yıkama eklemek önemlidir, Örneğin, her tazminat denetim akışı yıkama barkodlu hücre nüfus ve 1 mL 3 mL ekleyin.</li>
	<li>4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
	<li>Barkodlu hücre nüfus Fosfo-antikor leke hücre süspansiyon, 25 µL sağlayan akış yıkama hacmi resuspend. Tazminat denetim akışı yıkama 200 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Antikorlar 96 iyi V-alt plaka içinde boyama için hazırlayın. Son hacim 50 µL/iyi olacak. İyi 10 µL, yüzey marker son hacmi 15 µL ve hücre süspansiyon, 25 µL yıkamaya akışı içinde seyreltilmiş son hacmi yıkamaya akışı içinde seyreltilmiş Fosfo özgü antikor ekleyin. Not: Antikor dilutions deneme önce titre. İzotip kontrol içerir.</li>
	<li>Karanlık oda sıcaklığında 30 dk için hücreleri bırakın.</li>
	<li>Lekeli hücreleri 2 yıkama x akışı yıkama (kuyuları doldurmak) ile.</li>
	<li>5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.</li>
	<li>Akış yıkama 150 µL hücrelerde resuspend.</li>
</ol>8. tazminat denetimleri hazırlanması
<ol><li>Tazminat denetimleri antikor boyama paralel olarak antikor Birleşik fluorochromes için hazır olun. Tazminat boncuk göre için satıcının yönergelerini kullanın.</li>
</ol>9. Akış Sitometresi Analizi
Not: Deneme bir akış sitometresi bir yüksek üretilen iş örnekleyici (HTS) ile çalıştırılabilir.
<ol><li>Photomultiplier tüp (PMT) gerilim günahı kontrol ile en iyi duruma getirme.</li>
	<li>Tazminat denetimleri çalıştırmak ve tazminat matris hesaplayın.</li>
	<li>Çalışma örnekleri. Olay oranı uygun olarak araç özellikleri olmalıdır.</li>
</ol>10. geçişi strateji ve veri analizi
<ol><li>Akış Sitometresi Analizi Yazılım deneme alma FCS dosyaları FlowJo veya Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) gibi.</li>
	<li>Perdeleme strateji<ol>
<li>SSC-A karşı komplo tarafından lenfositler seçin FSC-A bir yoğunluk nokta arsa.</li>
		<li>Lenfosit görüntüleyip SSC-A karşı FSC -W. komplo tarafından gömlek seçin</li>
		<li>Tek hücre ve hücre yazın SSC-A karşı yüzey işaretçiyi komplo tarafından kapı görüntüler.</li>
		<li>Hücre türü nüfus Pasifik mavi karşı SSC-A yoğunluğu plan yaptığını görüntülemek ve onların Pasifik yoğunluğu boyama mavi üzerinde dayalı farklı FCB nüfus seçin ( Şekil 1A' ya bakınız).</li>
		<li>Fosfo antikor kanal FCB kanal karşı veya bir heatmap olarak arsa (şekil 1Afosforilasyon olaylarını görüntülemek için'ya bakınız).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fosfo-sinyalleri Fosfo-sinyal karşı izotip kontrol MFI (medyan floresan yoğunluğu) ters hiperbolik sinüsü (arcsinh) kullanarak hesaplamak (bazal fosforilasyon, bkz: düzeyleri Şekil 1 d), ya da uyarılmış karşı unstimulated hücre popülasyonlarının (bkz. Şekil 1E).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li>
<li>Myhrvold, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+phospho-protein+levels+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia.</a> Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).</li>
<li>Parente-Ribes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+tyrosine+kinase+inhibitors+reduce+CD40L-induced+proliferation+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+but+not+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells.</a> Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).</li>
<li>Blix, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+identifies+aberrant+signaling+in+indolent+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma.</a> BMC Cancer. 12, 478(2012).</li>
<li>Irish, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+potentiated+phospho-protein+networks+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells.</a> Cell. 118 (2), 217-228 (2004).</li>
<li>Myklebust, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+B-cell+receptor+signaling+in+non-Hodgkin+lymphomas+identified+by+single-cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling.</a> Blood. 129 (6), 759-770 (2017).</li>
<li>World Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Medical+Association+Declaration+of+Helsinki%3A+ethical+principles+for+medical+research+involving+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22THE+JOURNAL+OF+THE+AMERICAN+MEDICAL+ASSOCIATION%22%5BJournal%5D)">World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects.</a> THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).</li>
<li>Siveen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+STAT3+signaling+pathway+in+cancer%3A+role+of+synthetic+and+natural+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).</li>
<li>Fabbri, G., Dalla-Favera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+pathogenesis+of+chronic+lymphocytic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).</li>
<li>Arnason, J. E., Brown, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+B+Cell+Signaling+in+Chronic+Lymphocytic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> Current Oncology Reports. 19 (9), 61(2017).</li>
<li>Landskron, J., Tasken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+Detection+by+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Pollheimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+drives+a+proinflammatory+endothelial+activation+that+selectively+targets+nonquiescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).</li>
<li>Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsphere+cytometry+to+interrogate+microenvironment-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).</li>
<li>Lin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+phospho-specific+flow+cytometry+can+detect+dynamic+changes+of+phospho-Stat1+level+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells.</a> Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).</li>
<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Fosfo akış sitometresi tek hücrelerdeki protein fosforilasyon düzeyleri ölçmek için güçlü bir tekniktir. Antikorlar ile boyama yöntemi kullanır beri Fosfo akış sitometresi göre antikor miktarı sınırlıdır. Ayrıca, güvenilir sonuçlar elde etmek için tüm antikor olmalı titre ve kullanmadan önce doğrulanmadı. Titrasyon Fosfo özgü antikorların için detaylı bir protokol oldu başka bir bölümünde12. Panel Tasarım sırasında sinyal-gürültü oranı göz önüne alınması önemlidir. Sunulan örnekte, tüm Fosfo-antik...

Fosfo akış sitometresi protein fosforilasyon düzeyleri tek hücreli çözünürlükte analiz etmek için kullanılır. Genel yöntem belirtilen koşullar altında hücresel sinyal desenleri eşlemek için hedeftir. Akış Sitometresi multiparameter kapasitesi sömürerek, birkaç sinyal yollar aynı anda periferik kan gibi türdeş olmayan hücre nüfusunun farklı alt kümeleri olarak analiz edilebilir. Bu özellikler diğer antikor tabanlı teknolojileri immünhistokimya, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), protein dizi ve ters faz protein dizi (RPPA)1gibi avantajlar sunuyor. Fosfo akış sitometresi floresan cep Barkod (FCB), böylece onlar birlikte karışık olabilir, lekeli ve tek örnek2olarak analiz tek hücre örnekleri floresan boyalar benzersiz imzaları ile etiketlenir anlamına gelir ile kombine edilebilir. Bu antikor tüketimini azaltır veri sağlamlık, kontrol ve tedavi örnekleri birleşimiyle artar ve edinme hızını artırır. Kombine FCB nüfus daha küçük örnekleri bölünmüş ve malzeme başlayan miktarına bağlı olarak 35 farklı Fosfo-özel antikorlar ile lekeli. Büyük profil oluşturma deneyler böylece, standart sitometresi donanım ile çalıştırabilirsiniz. Fosfo akış sitometresi yollar hasta numuneleri kronik lenfositik lösemi (CLL)3,4,5, akut miyeloid lösemi (AML) dahil olmak üzere birçok hematolojik kanserlerin sinyal profil uygulandı 6 ve non-Hodgkin lenfomalarin bazilarinin7. Fosfo akış sitometresi böylece sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.
Burada, analiz Fosfo akış sitometresi tarafından CLL hasta örnekleri için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı (Şekil 1A) sağlanır. Bazal sinyal karakterizasyonu, anti-IgM/B hücre reseptörü stimülasyon ve uyuşturucu pertürbasyon örnekleri gösterilir. Bir FCB matris ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Protokol kolayca diğer süspansiyon hücre tipleri için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>Hücre kültürü ortamına katkı maddesi</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>Hücre kültürü ortamına katkı</td></tr> maddesi <tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>Hücre kültürü ortamına katkı maddesi</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>Yoğunluk gradyan ortamı</td></tr><tr><td>Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>B hücre reseptörünün uyarılması için</td></tr><tr><td>BD Fosakış Düzeltme Tamponu I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>Fiksasyon tamponu</td></tr><tr><td>BD Fosakış Perma Tamponu III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>Geçirgenleştirme tamponu</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>Barkodlama reaktifi</td></tr><tr><td>Pasifik Mavisi Süksinimidil Ester</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>Barkodlama reaktifi</td></tr><tr><td>Pasifik Turuncusu Süksinimidil Ester, Trietilamonyum Tuzu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>Barkodlama reaktifi</td></tr><tr><td>Kompanzasyon boncukları</td><td>Kullanıcı</td><td></td><td>Doğru türler tarafından tanımlanır reaktivite</td></tr><tr><td>Falcon tüpleri</td><td> kullanıcı tarafından tanımlanır</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td> kullanıcı tarafından tanımlanır </td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu V-alt plakalar</td> <td> kullanıcı tarafından tanımlanır </td><td></td> <td>Akış sitometresi ile uyumlu</td></tr><tr><td>Santrifüjler</td><td> <kullanıcı tarafından tanımlanır / ></td><td></td> <td>Eppendorf tüpleri, Falcon tüpleri ve plakaları için</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td> kullanıcı tarafından tanımlanır</td><td></td> <td>Sıcaklık ayarlı</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td> kullanıcı tarafından tanımlanır</td><td></td> <td>Yüksek Verimli Örnekleyici (HTS) ile</td></tr><tr><td><güçlü > Adı< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td>< güçlü > antijen< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojileri</td><td>4075</td> <td>< güçlü > Klon: < / güçlü> D9E <güçlü > Referans: < / güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes ve diğerleri, 2016, Dalak tirozin kinaz inhibitörleri azaltır ve hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland ve diğerleri, 2014, CD2 ve CD28&hellip yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland ve diğerleri, 2012, Normal ve transforme edilmiş &hellip;'de proksimal sinyallemenin modülasyonu;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-8398</td><td>Clone: F-1 Referans: < / güçlü> Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28&hellip yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer ve ark., 2013, İnterlökin-33 proinflamatuar bir endotelyal&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>Clone: J117-1278 Referans: </güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes ve diğerleri, 2016, Dalak tirozin kinaz inhibitörleri azaltır ve hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland ve diğerleri, 2012, Normal ve transforme edilmiş proksimal sinyallemenin modülasyonu&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust ve diğerleri, 2017, B-hücresi reseptör sinyalinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td><güçlü>Klon: < / güçlü> N35-86 <güçlü>Referans: < / güçlü> Myklebust ve diğerleri, 2017, B hücresi reseptör sinyalinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558129</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> 24a/BTK (Y551)&nbsp; Referans: Kalland ve ark., 2012, Normal ve transformed&hellip'te proksimal sinyallemenin modülasyonu;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/ITK (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Referans: Myhrvold ve ark., 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes ve diğerleri, 2016, Dalak tirozin kinaz inhibitörleri azaltır ve hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta; (sayfa 142)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558489</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> K25-407.69 <güçlü>Referans:</güçlü> Sk&aring; nland ve diğerleri, 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histon H3 (pS10)</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojileri</td><td>9716</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> D2C8 <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>I&kappa; B & alfa;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>5743</td><td>Clone: L35A5 Reference: Myklebust ve diğerleri, 2017, B hücresi reseptör sinyallemesinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> I58-1169 <güçlü>Referans: < / güçlü> Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>Clone: 4/LCK-Y505&nbsp; <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> J114-64 <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profilinin çıkarılması.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> K10-895.12.50 <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28&hellip yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland ve ark., 2012, Normal ve transforme&hellip;'de proksimal sinyallemenin modülasyonu, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer ve ark., 2013, İnterlökin-33 proinflamatuar bir endotelyal&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS536)</td> <td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4887</td><td><güçlü>Klon: < / güçlü> 93H1 < güçlü > Referans: < / güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland ve diğerleri, 2014, CD2 ve CD28&hellip yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland ve diğerleri, 2012, Normal ve dönüştürülmüş&hellip;'de proksimal sinyallemenin modülasyonu;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4552</td><td>Clone: 28B10 Referans: </güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer ve ark., 2013, İnterlökin-33 proinflamatuar bir endotelyal&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4375</td><td>Clone: E10 Referans: </güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes ve diğerleri, 2016, Dalak tirozin kinaz inhibitörleri azaltır ve hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28&hellip yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland ve ark., 2012, Normal ve transforme&hellip;'de proksimal sinyallemenin modülasyonu, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer ve ark., 2013, İnterlökin-33 proinflamatuar bir endotelyal&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>NN</td><td>Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 çoğaltma ve Bcl-2 aşırı ekspresyonu&hellip;, Kan, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Referans: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplikasyonu ve Bcl-2 aşırı ekspresyonu&hellip;, Kan, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Referans: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 çoğaltma ve Bcl-2 aşırı ekspresyonu&hellip;, Kan, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>NN</td><td>Clone: Poliklonal Referans: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 çoğaltma ve Bcl-2 aşırı ekspresyonu&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 çoğaltma ve Bcl-2 aşırı ekspresyonu&hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma; 2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> K86-689.37 <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust ve diğerleri, 2017, B hücresi reseptör sinyallemesinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> J112-906 <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer ve diğerleri, 2013, İnterlökin-33, proinflamatuar bir endotelyal&hellip;, Arterioscler Tromb Vasc Biol, 33(2):E47-55</td></tr><tr><td>S6-Ribos. (pS235/236)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4851</td><td>Clone: D57.2.2E Referans: Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>9257</td><td>Clone: G9 Reference: Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer ve diğerleri, 2013, İnterlökin-33 proinflamatuar bir endotelyal&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>Clone: J141-668.36.58&nbsp; Referans: Sk&aring; nland ve ark., 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>Clone: 4a&nbsp; Referans: Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust ve diğerleri, 2017, B-hücresi reseptör sinyallemesinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td><güçlü>Klon: < / güçlü> 4 / P-STAT3 <güçlü> Referans: < / güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Clone: Polyclonal Referans: Uzel ve ark., 2001, Akış sitometrisi ile hücre içi fosforile STAT-4'ün tespiti, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> 47/Stat5(pY694) <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve ark., 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland ve diğerleri, 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust ve diğerleri, 2017, B hücresi reseptör sinyallemesinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> 18/P-Stat6 <güçlü>Referans: </güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojileri</td><td>12081</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> C87C1 <güçlü>Referans:</güçlü> Myhrvold ve diğerleri, 2018, Fosfo-protein seviyelerinin tek hücre profili.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes ve diğerleri, 2016, Dalak tirozin kinaz inhibitörleri azaltır ve hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td><güçlü>Klon:</güçlü> 17A/P-ZAP70 <güçlü>Referans:</güçlü> Sk&aring; nland ve diğerleri, 2014, CD2 ve CD28 yoluyla T hücresi ko-stimülasyonu&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland ve diğerleri, 2012, Normal ve dönüştürülmüş&hellip;'de proksimal sinyallemenin modülasyonu, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust ve diğerleri, 2017, B hücresi reseptör sinyallemesinin farklı kalıpları&hellip;, Kan, 129(6): 759-770</td></tr></tbody></table>

fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre analizi ve biyomarker keşif sinyal

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Anormal hücre sinyallemesi kanser gelişme ve ilerleme içinde merkezi bir rol oynar. En yeni hedefli tedaviler gerçekten de protein ve protein işlevleri yönlendirilir ve hücre sinyal aberasyonları bu nedenle kişiselleştirilmiş tedavi seçenekleri belirtmek için biyolojik hizmet verebilir. DNA ve RNA analizleri aksine, protein aktivite değişiklikleri ilaç duyarlılığı ve direnç temel mekanizmaları daha verimli bir şekilde değerlendirebilir. Fosfo akış sitometresi protein fosforilasyon olaylar hücresel düzeyde, bu yöntem diğer antikor tabanlı yaklaşımlardan ayıran önemli bir özelliği ölçer güçlü bir tekniktir. Yöntemi aynı anda birden çok sinyal proteinleri analiz için sağlar. Floresan cep barkod ile birlikte, daha büyük orta-yüksek performans veri setleri kısa sürede standart sitometresi donanım tarafından elde edilebilir. Fosfo akış sitometresi uygulamaları temel biyoloji çalışmalarda ve klinik araştırmada, sinyal analizi, biyomarker keşif ve özellikler bir değerlendirme de dahil olmak üzere var. Burada, detaylı bir deneysel protokol Fosfo akışı analizi arıtılmış periferik kan mononükleer hücre, kronik lenfositik lösemi hücreleri örnek olarak kullanarak sağlar.

Fosfo akış sitometresi Protokolü ana adımları Şekil 1A' gösterilmiştir. Sunulan örnekte CLL hücreleri ile dört dilutions, Pasifik mavi barkodlama reaktif lekeli. Üç boyutlu barkod Şekil 1Badımında gösterildiği gibi üç barkodlama boya, birleştirerek gerçekleştirilebilir. Bireysel örnekleri sonra sonraki her barkod reaktif karşı üzerinde SSC-A (Şekil 1 c) çoğunluğuna tarafından deconvoluted. B...

Burada, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olayların orta-yüksek performans analizi için bir protokol sunulmuştur. Fosfo akış sitometresi sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.

Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Bu yöntem, hücre biyolojisi ve immünoloji alanlarında ki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir; Bu tekniğin en büyük avantajı, orta ve yüksek iş yapma modasında tek hücreli sinyal analizi yapmanızı sağlamasıdır. Tamamlayıcı RPMI hücreleri yeniden askıya sonra 16/40 orta, 96 iyi V-alt plaka kuyularına hücre süspansiyon gerekli miktarda aktarın.Önceden ısıtılmış 37 derece santigrat su banyosu için plaka aktarın ve orada 10 dakika dinlenmeye bırakın. Sonra düzeltme plakası kurmak için yeni bir 96 iyi plaka her kuyuya sabit tampon bir 60 mikrolitre ekleyin. Bu tabağı 37 derece su banyosuna yerleştirin.50 mikrolitrelik bir kontrol örneğini tabağa aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. İsteğe bağlı olarak, simülasyon zamanı kursuna başlamak ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırmak için hücrelere mililitre anti-IgM başına 10 mikrolitre ekleyin. Her zaman noktasında 50 mikrolitrelik bir numuneyi sabitleme plakasına aktarın ve her numuneeklendikçe karıştırın.Son örnek eklendikten sonra, 10 dakika su banyosunda düzeltme plakası bırakın. İlk olarak, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Daha sonra, her bir barkodlama reaktifi beş mikrolitre borulama tarafından, barkodlama reaktifleri ile taze bir 96 iyi V-alt plaka hazırlamak kuyu her örnek leke için gerekli kuyu sayısını doldurarak. Sabit hücre plakasında, her kuyudaki hücreleri 190 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Daha sonra, her iyi iyice karıştırma, barkodlama plaka karşılık gelen kuyuya hücrelerin her kuyu aktarın.Plaka karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında dinlendirin. Plakayı 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bundan sonra, akış yıkama ile her iki kuyuda iki kez hücreleri yıkayın.Sonra hücrelerin her kuyusu için akış yıkama 190 mikrolitre ekleyin. Barkodlu tüm örnekleri 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve her bir telafi kontrolünü ayrı bir 1,7 mililitrelik tüpe aktarın. 5 dakika için 500 kez G santrifüj ve supernatant atın.Başlamak için, perm tampon üç bir mililitre iki mililitre aktarın 15 mililitrelik bir tüp. Eksi 20 santigrat derecede saklayın, böylece kullanıldığında buz gibi olacak. Hazır olduğunuzda, hücre kümelenmesini önlemek için girdap yaparken barkodlu hücre popülasyonu damla cıkan içeren 15 mililitrelik tüpe 1,5 mililitre buz gibi perma tampon ekleyin.Aynı şekilde tazminat kontrolleri her 100 mikrolitre buz soğuk perm tampon ekleyin. Hücreleri hemen eksi 80 derecede en az 30 dakika dondurucuya aktarın. Antijen boyama başlamak için hazır olduğunuzda, dondurucu hücreleri çıkarın ve buz bir kutu ya transfer.Hücreleri fazla akışla üç kez yıkayın. Hücreleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yeniden akış yıkama hacmi barkodlu hücre popülasyonu askıya, böyle fosfo-antikor leke başına hücre süspansiyon 25 mikrolitre olmasıdır.200 mikrolitre akış yıkamada telafi kontrollerini yeniden askıya alın. Boyama için antikorhazırlamaya başlamak için, taze bir 96 iyi V-alt plaka her kuyuya, akış yıkama seyreltilmiş fosfo-spesifik antikor 10 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 50 mikrolitre lik son bir hacim için her kuyuya akış yıkamada seyreltilmiş 15 mikrolitre yüzey kalemi ve 25 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Karanlıkta oda sıcaklığında hücreler 30 dakika dinlendirin. Bundan sonra, akış yıkama ile iki kez lekeli hücreleri yıkayın. 5 dakika 500 kez G'de santrifüj.Supernatant atın ve akış yıkama 150 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi akış sitometri analizi ni gerçekleştirin. Sunulan protokolde, üç boyutlu barkodlama üç barkodlama boyaları birleştirilerek gerçekleştirilir.Tek tek örnekler daha sonra her barkodlama reaktifi ve yan dağılım alanı üzerinde sonraki gating tarafından kıvrık. B hücre reseptörünün aşağısındaki 20 sinyal molekülünün bazal ve stimülasyona bağlı fosforilasyon düzeyleri daha sonra CLL hastalarınDan B hücrelerinde ve çeşitli koşullar altında normal kontrollerde karakterize edilir. Stat3 fosfo tirozin 705'in önemli ölçüde düzenlendiği görülmektedir.Hücreler, B hücre reseptör yolu ile indüklenen sinyal sapmalarını belirlemek için 30 dakikaya kadar anti-IgM ile uyarılır. Mutasyona uğramamış IGVH'li hastalardan alınan CLL hücreleri anti-IgM stimülasyonuna karşı duyarlılığı artırırken, AKT fosfor serini 473 için istatistiksel olarak anlamlıdır. Hücreler daha sonra anormal AKT pS473 sinyalinin tersine çevrilip tersine çevrilemeyebileceğini test etmek için PI 3-kinaz delta inhibitörü idelalisib'e maruz kalır.Burada gösterildiği gibi, kinap inhibitörlerinin CLL hücrelerinde anormal sinyalizasyonu normalleştirmek için uygulanabileceğini gösteren konsantrasyona bağlı bir şekilde tedavi üzerine anormal düzeyler önemli ölçüde azalır. Bu yordamı denemeden önce barkodlama reaktifleri ve antikorları titrat hatırlamak ve seçilen yüzey işaretleri fiksasyon ve permeabilizasyon reaktifleri ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. Hücrelerin fosfor analizi için süspansiyon olması gerekir, hala protokol anormal hücrelere veya doku tek hücre süspansiyon elde etmek için prosedürleri aşağıdaki adapte edilebilir, tüm tripzinasyon gibi.

phospho-flow-cytometry-with-fluorescent-cell-barcoding-for-single

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Bu videoda, kantitatif akış sitometrisi kullanarak proteinler ve yapay fosfolipid veziküller arasındaki etkileşimi gösteriyoruz. Floresan etiketli proteinlerin floresan etiketli fosfolipid veziküllere bağlanması, ortalama floresan yoğunluğunu arttırır ve bu artış bir akış sitometresi ile tespit edilir.

Etiketli Protein-Fosfolipid Vezikül Etkileşimlerini İncelemek için Kantitatif Akış Sitometrisi

Bu video, farklı hücre barkodlaması için ağır metal konjuge antikorlar kullanan tek hücreli bir proteomik yöntemi vurgulamaktadır. Daha sonra, insan tam kan kaynaklı immün hücrelerdeki immün fenotipik ve fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için immün boyama ve kitle sitometrisi uygulanır.

İmmün Hücrelerin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu için Bir Barkodlama Testi

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Yeşil floresan protein geninin keşfinden bu yana, floresan proteinler moleküler hücre biyolojisini etkilemiştir. Bu protokol, genetik mühendisliği yoluyla farklı floresan proteinlerin ekspresyonunun, tek tek hücreleri barkodlamak için nasıl kullanıldığını açıklar. Prosedür, çoğullanmış uygulamalar için ideal olan bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesini sağlar.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Öğrenin fosfo akış sitometrisi ile tek hücreli protein fosforilasyon analizi yapmayı. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve immünolojide sinyal yolu bozukluklarını ve biyobelirteçleri keşfetmek için kullanılır.

Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal

Daha fazla video keşfet