Yüzdürme ile aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak yüzdürme tabanlı T hücresi izolasyonu

Kaldırma kuvveti ile aktive edilen hücre sıralaması, BACS kullanarak bağışıklık sistemi için gerekli olan beyaz kan hücreleri olan T hücrelerini izole etmek için, periferik kan mononükleer hücrelerinin, PBMC'lerin bir süspansiyonunu alın. PBMC'ler, hedef T hücreleri ve B hücreleri, monositler, doğal öldürücü hücreler ve dendritik hücreler gibi hedef olmayan hücreleri içerir.

Yeterli miktarda biyotinile anti-CD3 antikoru içeren bir tampon ekleyin ve gereken süre boyunca inkübe edin. Antikor, hücre yüzeyinde multimerik bir protein kompleksi olan CD3 kompleksine bağlanır - T hücrelerinin tanımlayıcı bir özelliği.

Antikora bağlı T hücrelerinin pozitif seçimi için işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar - streptavidin ile kaplanmış küçük küresel parçacıklar - ekleyin. Her bir mikro kabarcığın çekirdeği içi boş bir küredir, bu da onları sulu bir çözelti içinde yüzebilen düşük yoğunluklu parçacıklar haline getirir.

Karışımı çalkalama altında inkübe edin, mikro kabarcıkların ve numunenin iyice karışmasına izin verin. İnkübasyon sırasında, mikro kabarcık üzerindeki streptavidin, T hücresine bağlı antikor üzerindeki biyotine bağlanır ve hücreleri mikro kabarcıklar üzerinde hareketsiz hale getirir.

Tüpü santrifüjleyin. Hedef olmayan hücreler alt kısımda bir pelet olarak karışımdan ayrılır.

Hedef T hücresine bağlı mikro kabarcıklar yüzeyde yüzer durumda kalır ve bu da T hücrelerinin kaldırma kuvvetine dayalı olarak ayrılmasına yol açar. Bu ayırma tekniği, hedef hücreler üzerindeki stresi sınırlar. İnce bir pipetle, mikro kabarcık tabakasını bozmadan peleti ve alt maddeyi çıkarın.

İzole edilmiş, mikro kabarcıklara bağlı T hücrelerini, daha sonraki işlemler için uygun bir kültür ortamında yeniden süspanse edin.

Başlamak için, ticari olarak elde edilen 3 x 10⁸ PBMC'yi biyotinile anti-CD3 antikoru ile 2.5 mililitre ayırma tamponunda inkübe edin. Bileşenleri pipetleme ile nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Üreticinin talimatlarına göre hücrelere 0,5 ila 1 oranında streptavidin mikro kabarcıkları ekleyin ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca 20 RPM'de ticari bir uçtan uca döndürücü kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler, streptavidin mikro kabarcıkları ile süspansiyonun tepesinde olacak ve kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır.

9 inçlik bir cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi katmanının altına tüpün altına yerleştirin. Hücre peletini ve alt natanı elektronik bir pipetle aspire edin ve yeni bir tüpe aktarın.

Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını 1 mililitre tam T hücresi ortamında yeniden süspanse edin. Subnatanı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve dolaylı saflık ve geri kazanım ölçümü için kullanın.