Name: Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Öğrenin, böcek hücrelerinde floresan etiketli proteinlerin geçici ifadesi ve hücresel yerelleştirme yöntemini. Bu teknik, protein fonksiyonu ve hücresel trafik çalışmaları için hızlı ve etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz teknik yardım için Lynn forlow-JECH ve Dannialle LeRoy teşekkür ederim. Bu makale amacıyla sadece bir ticaret adları veya ticari ürünlerin JAF ve JJH Mansiyon için Bitki Koruma ve Karantina [Proje # 2020-22620-022-00D] - Bu çalışma USDA ARS taban -CRIS fon, Ulusal Program 304 tarafından desteklenmiştir spesifik bilgi sağlama ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.

Ifade plazmitlerinin yapımı 1. OE-PCR, Not: OE-PCR kullanılan tüm primerler için Tablo 1&#39;e bakınız. yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanımı bütün amplifikasyonlar için tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu enzimler, genellikle bırakmak çünkü bir 3&#39; A, bir Taq DNA polimeraz ile kısa olmayan amplifiye inkübasyon gerçekleştirmek için gerekli olan &#39;A-kuyruk&#39; PCR ürünleri bir TA böcek hücresi ekspresyon içerisine klonlanması önce vektör. Bu protokol, böcek sentezleme plasmidleri hücre içi protein işaretleyicileri (iki Bemisia tabaci aquaporin proteinlere, bu durumda) veya ilgilenilen genlerin karboksil terminine çerçeve içinde kaynaşmış floresan proteinleri ile, kimerik proteinleri barındıran oluşturmak için bir yöntemi gösterir (Şekil 1). <ol><li> Amplifikasyon iki bağımsız tur oluşur OE-PCR, kullanın oluşturmak için: (1) ilgi konusu genlerin kodlayan dizileri (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) EGFP ya da (2) alt hücresel markerler (Drosophila melanogaster cinsiyet peptid reseptör olarak adlandırılan yeşil floresan protein varyantı ile çerçeve kaynaşık: DmSPR Homo sapiens fosfolipaz A2: HsPLA2) MCherry kodlama dizisi ile. Doğrudan pIB / V5-His-ta plazmidine son OE-PCR ürünlerini bağlayacaktır. <ol><li> OE-PCR ilk kez için, (Tablo 1 &#39;de kalın karakterlerle gösterilmiştir), gene özgü bir sens primeri ve bir kimerik antisens primeri (AD ve A&#39;-D Şekil 1&#39; de&#39; ile gösterilen), karşılık gelen (Tablo 1&#39; de italik) İlgi / hücre içi işaretleyici genin (durma kodunu ile veya olmaksızın) son 15 bp ve istenen floresan protein ve 5&#39;-ucunun 15 bp (EGFP ya da mCherry) bir 3&#39; çıkıntı ile bir ürün üretmek için. Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2&#39;ye bakın. </li><li> Ayrı bir tüp içinde, bir gen-özel kullanımıİstenen floresan 5&#39;-ucundan çıkar / hücre içi işaretleyici genin 3 &#39;ucunda 15 bp, 15 bp içerir ve bir kimerik sens primer (Tablo 1&#39; de, bir alt çizgi ile gösterilir) ic floresan protein antisens primeri protein, bir 5&#39; çıkıntı ile bir ürün üretmek için. Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2&#39;ye bakın. PCR şablonu, daha çok tercihen, plazmid DNA, istenen dizisini barındıran bir dizi-doğrulanmış PCR ürünü, ya da olabilir,. Burada tarif edilen bir çalışma sekansı geçerliliği plazmidler kullanır. </li><li> (Standart moleküler dereceli agaroz kullanılarak)% 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın. </li><li> Tüketim ve ticari olarak mevcut bir DNA jel ekstre etme kiti kullanılarak beklenen boyutları (bakınız Tablo 2) &#39;de elde saflaştırmak (Bu protokolde kullanılan özel kit için malzeme tabloya bakınız). </li><li> Nihai örtüşme e oluşturmak için adım 1.1.4 elde edilen jel-saflaştırılmış PCR ürünleri kullanınxtension ürünleri (A &#39;ile gösterilen&#39; - D &#39;&#39; Şekil 1 &#39;de). İlgi / hücre içi işaretleyici gen ve istenen kimerik dizisi üretmek için flüoresan protein için karşılık gelen gen-spesifik antisens primer için bir gen spesifik sens primer kullanın. Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2&#39;ye bakın. Deneysel son, tam uzunluktaki kimerik PCR ürünü elde etmek için reaksiyon karışımına ekleyin birinci tur örtüşme uzatma ürünlerinin uygun miktarlarını belirlemek için gerekli olabilir. </li><li> % 1 agaroz jel elektroforezi ile ikinci tur OE-PCR ürünleri ayırın. Tüketim bir ticari olarak temin edilebilir DNA jel ekstre etme kiti kullanılarak ürünler arındırmak ve. </li><li> TA klonlama için gerekli olan 3&#39; adenillenmiş (yani bir kuyruklu) ürünleri üretmek için 72 ° C &#39;de 10 dakika boyunca Taq DNA polimeraz ana karışımı 1 birim jel-saflaştırılmış ikinci tur OE-PCR ürünleri inkübe edin. </li><li> Elde edilen adenylated ürünlerini bağlayacaktırpIB ekspresyon vektörüne ve kimyasal olarak kompetan (ısı şoku) ya da elektro (elektroporasyon) Escherichia coli hücrelerini dönüştürmek için standart molekül klonlama teknikleri kullanımı. Uygun seçim işaretleyici (örn, ampisilin veya karbenisilin) içeren ortamda Plaka gece boyunca karıştırıldı. </li><li> Sentezleme plasmidleri, 5&#39;-3&#39; yönünde bir ek barındıran transforme edilmiş uç pozitif kolonileri tanımlamak için bir vektör-spesifik primer ve bir sokma özgü primer kullanılarak koloni PCR 12 gerçekleştirin. Beklenen boyuttaki PCR ürünlerini üreten kolonilerin gecelik kültürler hazırlayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilir DNA saflaştırma kiti (Bu protokolde kullanılan özel kit için malzemeler Tablo) kullanılarak plazmid DNA izole edilir. doğrudan DNA dizileme ile her bir parçanın dizisi bütünlüğünü doğrulamak. </li></ol></li></ol> Not: steril koşulların muhafaza bir laminer akış başlığı içinde doku kültürü şişesi açılmasını gerektirmeyen tüm hücre manipülasyonlar yapmak. daha önceki bir hücre manipülasyonlar laminer akış dedantörü UV mikrop öldürücü lambasını en az 1 saat çevirin. nitril eldivenleri giymeli ve kullanılmadan önce% 70 etanol ile tezgah, pipetler, mutfak eşyaları, tüpler, ve şişe yüzeyi dezenfekte. Temel hücre kültürü teknikleri ile aşinalık 13 önerilir. <ol><li> Serumsuz ortama uyarlanmıştır TnI hücreleri (Trichoplusia ni yumurtalık dokudan alınan bir yerleşik hücre kültürü hat) kullanarak ve 28 ° C T25 doku kültürü şişelerinde serum içermeyen böcek ortamı içinde yapışkan bir tek tabakalı kültürü olarak muhafaza. </li><li> Sf9 hücrelerinin (Spodoptera frugiperda yumurtalık dokudan alınan bir yerleşik hücre kültürü hat), benzer fakat TNM-FH böcek kültür ortamı takviyesi bakımı% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile ed. </li><li> -80 ° C ila stok şişeler çıkarılması ve bunların 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde erimesine izin dondurulmuş Sf9 veya TnI hücrelerden başlangıç ​​kültürü Seed. çözdürme sonrası% 70 etanol ile şişeleri dekontamine ve buz üzerine koyun. </li><li> Yeni bir T25 şişesi ve transfer çözülmüş böcek hücre süspansiyonu 1 ml böcek hücresi ortamında 4 mL ekleyin. bir 28 ° C olmayan nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir ve hücreler, 30-45 dakika boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> Uygun ortamın 5 mL&#39;si ile tohumlama ortamı yerini ve bir 28 ° C olmayan nemlendirilmiş inkübatör döküm kalıplarının transferi. Günlük hücre izdiham izleyin. Passage hücreleri% 90 birleşik duruma ulaştılar zaman. Not: T25 şişesi tam kapsama ~ 5 x 10 6 hücre karşılık gelir. </li><li> Böcek hücre geçit. <ol><li> hücrelerin geçişi için, ilk olarak 5 ml steril bir serolojik pipet kullanılarak konfluent hücreler içeren şişeden bitmiş orta çıkarın.orta uzağa hücre tek tabaka, bir köşesinde akar, böylece şişeyi eğin. Dikkatle hücreleri bozmadan pipet kullanarak orta kaldırmak. </li><li> hafifçe yeni, steril, 5 ml serolojik pipet kullanarak serumsuz böcek ortamı 4 mL konfluent tek tabaka içeren T25 şişeleri durulanarak TnI hücreleri çıkarmak. şişeye boyunca pipet getirin ve yavaş yavaş gevşek şişe tabanına bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır yıkayınız. <ol><li> Tüm medyayı çıkarmadan üzerinde şişeyi çevirerek ve şişenin alt açıktır ki gözlemleyerek hücrelerin yeterli dekolmanı kontrol edin. </li></ol></li><li> daha sıkı bir şekilde yapışır Sf9 hücreleri için, taze TNM-FH ortamında 4 ml eklemek ve ekli hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanılır. nazikçe karıştırın ve hücre topaklanma azaltmak için 5 ml serolojik pipet kullanın. </li><li> ortamın hacmi başına canlı böcek hücrelerinin sayısını tahmin etmek için otomatik hücre sayacını kullanın. 1.5 mL hücre / orta karışımı 0.1 mL aktarmamikrofüj tüpü. Ayrı bir 0.5 ml mikrofüj tüpe olarak, tripan mavisi 10 uL hücre / orta karışımın 10 uL ekleyin. </li><li> paketinden bir hücre sayacı odasına slayt çıkarın ve sayma sürgünün her iki yanında hücre / orta / tripan mavisi karışımın 10 uL ekleyin. Hücre tezgahın içine slayt takın ve hücre yoğunluğu ve canlılığı belirler. </li><li> Hücre yoğunluğu kullanılarak, hesaplamak ve yeni, steril T25 balonlarına böcek hücre ortamında (en fazla 5 mL) uygun hacim ekleyin. </li><li> Taze ortam ile T25 şişeleri, yaklaşık 11.5 x 10 6 hücre transferi; (Pn hücrelerinin, önceki nesil için geçit sayısı Pn + 1 üretimi,) hücre kullanılan çizgi, tarih, orta, ilave edilen hücrelerin sayısı ve kanal adedi ile şişeler etiket; ve en fazla 72 saat için 28 ° C inkübatör şişeler yerleştirin. Not: Böcek hücreleri sürekli olarak yayılabilir hücreler transfeksiyon ve / veya heterolog daha az açık olabilir, ancak30 geçişten sonra protein ekspresyonu. % 10 çamaşır suyu solüsyonu ile çıkartılan tüm hücre / ortamı tedavi ve atılmadan önce tek kullanımlık plastik eşya otoklav. </li></ol></li></ol> 3. Böcek hücre transfeksiyonu <ol><li> Bir T25 şişesi tohum kadar, 1 x 10 uygun bir böcek hücresi ortamında 6 TnI veya Sf9 hücreleri (Sf9 için TnI ve TNM-FH serumsuz böcek ortamı) ve 28 ° C &#39;de 72 saat boyunca birleşme oluşacak. </li><li> Çıkarın ve eski orta atmak ve taze serumsuz böcek orta 4 mL hücreleri çıkarmak (adımlar yukarıda 2.6.2 ve 2.6.3, bakınız). </li><li> otomatik bir hücre sayacı (yukarıdaki adım 2.6.4 bakınız) kullanılarak hücre yoğunluğu tahmin. </li><li> Tek tek 35 mm cam-alt yemekler için yaklaşık olarak 7 x 10 5 hücre ilave edin ve hücreleri, 28 ° C&#39;de 20-25 dakika boyunca birleşmeye izin verir. </li><li> Her transfeksiyon için plazmid DNA 2 ug ilave (ya da do iki plazmid her birinden gelen tek Transfeksiyonlar için bir plazmid ya da 2 ug1,5 mL steril bir mikrofüj tüpüne Sf9 ve TnI transfeksiyonlar) her ikisi için de FBS&#39;siz serumsuz böcek ortamı (0.1 mL uble transfeksiyon). </li><li> Ayrı bir tüp içinde, serumsuz böcek ortamı 0.1 mL transfeksiyon reaktifi 8 uL karıştırmak ve daha sonra ilgilenilen plazmid DNA içeren tüp bu çözümü aktarın. Hafif girdap ve 20 için oda sıcaklığında inkübe edin - 30 dakika. </li><li> toplam hacim 1 mL eşit olacak şekilde, serum içermeyen böcek ortamı, 0.8 mL plazmid transfeksiyon adımları 3.5 karışımın ve 3.6 seyreltin. </li><li> Dikkatle ekli hücreleri içeren cam yemekleri medya kaldırmak. seyreltilmiş plazmid transfeksiyon ortamı ile bağlanmış hücreler Yerleşimi. </li><li> 5 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Not: Transfeksiyon için koşullar maksimal transfeksiyon verimi (ampirik optimizasyon gerektirebilir, örneğin, bir gece boyunca transfeksiyon yerine 5 saat, kullanılan plazmid DNA&#39;nın miktarı transfeksiyon reaktifi kimyasıikinci, vb.). </li><li> Çıkarın ve transfeksiyon ortamı atılır ve yavaşça hücreleri çıkarmak için dikkatli olmak, serumsuz böcek orta 1 mL yıkama hücreleri. </li><li> Taze böcek hücresi ortamı (Sf9 için TnI ve TNM-FH serumsuz böcek ortamı) 2 mL ekleyin ve 48-72 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Yine, koşullar en fazla heterolog protein ekspresyonu için ampirik optimizasyon gerektirir. </li></ol> 4. Konfokal floresan mikroskobu <ol><li> 48-72 saat sonra, transfeksiyon de IPL-41 böcek ortamın bir kez 1 mL yıkama hücreleri ve daha sonra 2 mL IPL-41 görüntüleme ile kaplayın. Not: Bu yıkama aşaması, normal hücre bakımında kullanılan böcek hücre ortam maddesi ile gözlenen arka otomatik floresan azaltır. </li><li> Hoechst canlı hücre boyama reaktifi 4 damla ekleyin ortamına (Bu protokolde kullanılan spesifik nükleer boya için malzeme tabloya bakınız) ve 20-25 dakika süreyle 28 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Ek nükboya EGFP ve mCherry benzersiz bir floresan profile sahip olmalıdır, ancak emizle lekeleri, ikame edilebilir. </li><li> kendi içinde kapalı bir lazer konfokal mikroskop içine 35 mm tabak (Bu protokolde kullanılan özel cihaz için malzeme tabloya bakınız) yerleştirin. </li><li> Hoechst, EGFP ve MCherry gözlem koşulları için mikroskop ayarlama: Hoechst uyarma / emisyon - 359/461 nm; EGFP uyarım / emisyon - 489/510 nm; MCherry uyarım / emisyon - 580/610 nm. </li><li> Floresan ifadesini doğrulamak ve daha sonra bir 60X faz kontrast su daldırma objektif kullanarak tarama moduna geçmek için bir 10x objektif kullanarak bir başlangıç ​​tarama gerçekleştirin. </li><li> Görüntü kontrastı ve çözünürlüğü optimize etmek için lazer gücü (% 5-7), detektör duyarlılık (47-49%), tarama hızı, Z ekseni derinliği ve dijital zum ayarlayın. Görüntü 1.5x dijital zoom hücreler 90X büyütmesi toplam vermek. Not: Mikroskop parametreleri optimum için ampirik ayarlama yapılmasıve görüntü toplama kullanımda araca özgü olabilir. </li><li> TIFF resim dosyaları olarak ham veri aktarın ve şekil nesil için (kırpma ve bindirme) değiştirin. </li></ol>

<ol><li>Kost, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>van Oers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+baculovirus-insect+cell+protein+expression%3A+from+dark+horse+to+mainstream+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology.</a> J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).</li>
<li>Contreras-Gòmez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Kollewe, C., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://thescipub.com/abstract/10.3844/ajbbsp.2013.255.271">Production of recombinant proteins in insect cells.</a> Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).</li>
<li>Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltmann%2C+F+%22Glycotechnology%22">Glycotechnology</a>. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+plasmid-based+transient+gene+expression+method+using+High+Five+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells.</a> J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+membrane+protein+expression+in+transiently+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells.</a> Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-free+transient+protein+production+in+Sf9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-free transient protein production in Sf9 cells.</a> J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).</li>
<li>Loomis, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InsectDirect+System%3A+rapid%2C+high-level+protein+expression+and+purification+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).</li>
<li>Wurch, T., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1023%2FA%3A1008848517221">A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes.</a> Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).</li>
<li>Woodman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+intact+bacteria+%28colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of intact bacteria (colony PCR).</a> Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).</li>
<li>Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0">http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0</a> (2014).</li>
<li>Mathew, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+functional+aquaporin+water+channel+protein+from+alimentary+tract+of+whitefly%2C+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).</li>
<li>Van Ekert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+Bemisia+tabaci+aquaporins+reveals+the+water+channel+diversity+of+hemipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).</li>
<li>Hull, J. J., Brent, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+sex+peptide+receptor-like+transcript+from+the+western+tarnished+plant+bug+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus.</a> Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).</li>
<li>Maroniche, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+set+of+Gateway-compatible+vectors+for+live+imaging+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells.</a> Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).</li>
<li>Hull, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+western+tarnished+plant+but+%28Lygus+hesperus%29+olfactory+co-receptor+ORCO%3A+Expression+profile+and+confirmation+of+atypical+membrane+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology.</a> Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+the+PBAN+receptor+molecule%3A+Characterization+of+PBANR+variants+expressed+in+the+pheromone+glands+of+moths%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths.</a> Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).</li>
<li>Fabrick, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+multiple+aquaporin+water+channel+proteins+from+the+western+tarnished+plant+bug%2C+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).</li>
<li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+baculovirus+%28Bombyx+mori+nuclear+polyhedrosis+virus%29+repeat+element+functions+as+a+powerful+constitutive+enhancer+in+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells.</a> J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/286814771_Comparative_analysis_of_the_activity_of_two_promoters_in_insect_cells">Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells.</a> African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).</li>
<li>Kohnhorst, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+functions+of+proteins+under+fluorescence+single-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/263/5148/802">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Heterolog protein ekspresyon sistemleri çok sayıda alt uygulamalarda 4&#39;te kullanılan rekombinant proteinlerin üretimi için önemli bir araçtır. Mevcut çeşitli ifade sistemlerinden seçme ilgi protein için nihai hedef bağlıdır. Çeşitli böcek hücresi ifade sistemleri prokaryotik ve ökaryotik hücre ekspresyon sistemleri 5, 6 esnek alternatifler sunan mevcuttur. Protein ifadesini sürmek için bakulovirüs enfeksiyonu gerektiren Böcek sistemle...

böcek hücresi ifade sistemleri kullanılarak, rekombinant proteinlerin üretimi ökaryotik proteinlerin çalışma için sayısız avantajlar sunmaktadır. Yani, böcek hücreleri de benzer post-translasyonel modifikasyonları, işleme ve uygun biçimde katlanmış proteinler, 1, 2, 3 üretilmesi için avantajlı olan memeli hücrelerinde mevcut olanlar gibi ayırma mekanizmalara sahiptirler. Böcek hücre sistemleri, aynı zamanda, tipik olarak memeli hücre çizgileri 4, 5 den bakım için daha az kaynak ve daha az zaman ve çaba gerektirir. bakulovirüs ekspresyon sistemi, protein karakterizasyonu ve terapötik, yabancı peptidler ve aşı üretimi için viral proteinlerin imünojenik sunumu, çok sentezi için rekombinant proteinlerin üretimi de dahil olmak üzere artık birçok disiplinlerde kullanılan bir böcek hücre bazlı bir sistem, bir proteini kompleksleriVb glikosile proteinlerin üretimi. 1, 2, 4, 6. Bununla birlikte, çeşitli durum da baculovirüs ifade 3, 7 uygulanabilir olmayabilir ve nonlytic ve geçici böcek ifade sistemlerinin kullanılması daha uygun olabilir. Özellikle, geçici böcek hücresi ekspresyon rekombinant proteinin hızlı sentezi için imkanı sunar, viral-uygulanan hücre lizizi içermeyen az gelişim ve bakım gerektirir ve daha iyi bir protein sentezi 7, 8, 9 boyunca hücre hareketini incelemek için bir araç sağlar, 10. Bu protokol kullanılarak ekspresyon vektörlerinin hızla oluşturulmasını tarif etmektedir, iki aşamalı üst üste gelen uzatma PCR ile (OE-PCR) Escherichia coli içinde plazmid DNA standart klonlama. Plazmidler, çift transfekte ticari olarak temin edilebilen Kültürlenmiş böcek hücreleri kullanılır ve temsili proteinleri üretmek için. Protokol, iki farklı floresan etiketli hücre içi işaretleme proteinleri üretim ve kullanımını tarif eder ve böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinleri ile ko göstermektedir. Aşağıdaki protokol, OE-PCR, hedef proteinlerin hücresel lokalizasyon amacıyla böcek hücre bakım ve transfeksiyon, ve floresan mikroskobu için temel bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA Polimeraz</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>Örtüşme uzatma PCR ürünlerinin PCR amplifikasyonu için kullanılan yüksek kaliteli DNA polimeraz</td></tr><tr><td>ExTaq DNA Polimeraz</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>PCR ürünlerinin A-tailing'i için kullanılan DNA polimeraz</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polimeraz Master Mix</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>Bakteri kolonisi PCR</td></tr> <tr><td>için kullanılan DNA polimerazBiometra TProfessional Gradyan Termodöngüleyici</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Lekesi</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Montaj DNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His TOPO TA İfade Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>Doğrusallaştırılmış ve topoizomeraz I-aktive edilmiş pIB/V5-His-TOPO vektörü, One Shot TOP10 kimyasal olarak yetkin E. coli ve tuz çözeltisi dahil olmak üzere örtüşme uzatma PCR ürünlerini klonlamak için gereken bileşenleri içerir.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube Robotik İş İstasyonu</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Arıtıcı Dikey Temiz Tezgah</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Tni kültürlü böcek hücresi Hattı</td><td>Alel Biyoteknoloji</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 kültürlenmiş böcek hücresi Hattı</td><td>Alel Biyoteknoloji</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>Serumsuz Böcek Kültürü Besiyeri</td><td>Allel Biotech</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH Böcek Kültürü Besiyeri</td><td>Alel Biotech</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 Böcek Besiyeri</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16 cm Tek Kullanımlık Hücre Sıyırıcılar</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>Hücre İki Konumlu Bıçaklı Sıyırıcılar</td></tr><tr><td>25 cm2 (T25) Havalandırma Filtre Kapaklı Doku Kültürü Şişeleri</td><td>Yaşam Bilimleri Ürünleri</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipetleri</td><td>Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>Steril, 50 mL Biyo-Reaksiyon</td><td>Tüpleri Yaşam Bilimleri Ürünleri</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipetteBoy</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipetler</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Düz Kapaklı PCR Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Biyolojik Tehlike Otoklav Torbaları</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1.5 Cam Alt Tabaklar</td><td>Matsunami Cam</td><td>D35-14-1.5-U</td><td>35 mm çanak çapı, 14 mm cam çapı, 1.5 mm cam kalınlığı, kaplamasız</td></tr><tr><td>İnkübatör, Model 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II FL Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları, %0.4 Tripan Mavisi Reaktifli</td><td>ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 plazmid DNA</td><td>transOMIC Teknolojileri</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry Vector</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reaktifi (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

kültürlü böcek hücrelerinde geçici İfade ve rekombinant proteinlerin hücresel yerelleştirme

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterolog protein ekspresyon sistemler, rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan, selüler trafik / lokalizasyonu yorumlanması ve alt organizma seviyesinde protein biyokimyasal fonksiyonunun belirlenmesi. bakulovirüs ifade sistemleri giderek sayısız biyoteknolojik, ilaç ve endüstriyel uygulamalar, var açık yararlar viral enfeksiyon içermeyen ama çoğu zaman göz ardı ve kullanılamayan ama nonlytic sistemlerde protein üretimi için kullanılmasına rağmen. Burada, nonlytic ekspresyon vektörleri ve geçici rekombinant protein ekspresyonunu oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, rekombinant proteinlerin etkin hücresel lokalizasyonu için izin verir ve hızlı bir şekilde hücre içinde protein trafiğini ayırt etmek için kullanılabilir. Biz de, böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinler de dahil olmak üzere, ticari olarak mevcut böcek hücresi hattı dört rekombinant proteinlerin ekspresyonu gösterirHücre plazma zarının spesifik hücre içi markör proteinler olarak ve hücre içi lizozomlar için. Yeniden birleştirici tüm proteinler rekombinant proteinlerin doğrudan teşhis edilmesine izin verir, karboksil terminallerinde, floresan protein işaretleri ile kimeraları üretildi. plazmidler ilgi ve bilinen bir alt hücresel markör genler için konstruktlarını barındıran hücrelerin çift transfeksiyon canlı hücre görüntüleme ve hücresel protein lokalizasyonu geliştirilmiş doğrulama sağlar.

OE-PCR, OE-PCR, bir kez çıkar ve floresan markör proteinin herhangi bir test genine karşılık gelen rekombinant kimerik proteinlerin üretimi için izin bir ekspresyon vektörüne yerleştirilir, kimerik DNA ürünleri sentezine izin verir. Şekil 1, floresan protein markör EGFP ile çerçeve dizileri (BtDrip1 ve BtDrip2_v1) kodlama B. tabaci aquaporin içeren pIB ifade vektörlerinin üretimi için genel bir şema göst...

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Bu prosedürün genel amacı, protein fonksiyonunun ve/veya proteinlerin hücresel taşınımının daha iyi aydınlatılması için, ticari olarak temin edilebilen böcek hücreleri içerisinde ilgilenilen floresan etiketli proteinlerin eksprese edilmesidir. Bu yöntem; protein işlevselliği, protein etkileşimleri ve/veya proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ile ilgili temel hücre biyolojisi ve biyokimya tabanlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, konstrüktların hızla oluşturulabilmesi ve eksprese edilen proteinlerin, basülovirüs ekspresyonu ile ilişkili zararlı etkiler olmaksızın canlı hücrelerde fonksiyonel olarak değerlendirilebilmesidir; bu durum böylece verimliliği artırır.Bu yöntem böcek proteinlerinin incelenmesinde bilgi sağlayabilse de, protein fonksiyonunun veya hücresel lokalizasyonun incelenmesinin istendiği herhangi bir sisteme de uygulanabilir. Böcek hücre kültürü ve transfeksiyon prosedürünü laboratuvarımdan bir teknisyen olan Danni LeRoy uygulamalı olarak gösterecek. Bu prosedüre başlamak için, dondurulmuş SF9 ve Tni hücrelerinin stok tüplerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözülmelerini sağlayın.Çözündürme işleminden sonra, tüpleri %70 etanol ile dekontamine edin ve buz üzerine yerleştirin. Tüplerin ve doku kültürü flasklarının açılmasını gerektiren tüm hücre manipülasyonları, steril koşulları korumak için laminar akışlı bir kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir. Yeni bir T25 flaskına dört mililitre serumsuz böcek medyumu ve bir başka T25 flaskına dört mililitre TNM-FH medyumu ekleyin.Çözülmüş Tni hücrelerinden bir mililitreyi serumsuz böcek besiyerinin bulunduğu flaska ve çözülmüş SF9 hücrelerinden bir mililitreyi TNM-FH besiyerinin bulunduğu flaska aktarın. Flaskları 28 degree celsius sıcaklıktaki nemlendirilmemiş bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin yapışması için 30 ila 45 dakika bekleyin. Ekim besiyerini beş mililitre uygun besiyeri ile değiştirin.Ardından flaskları 28 °C'lik nemlendirilmemiş inkübatöre geri yerleştirin. Hücre konfluensini günlük olarak izleyin. Bu temsili görüntülerde gösterildiği üzere, hücreler %90 konfluense ulaştığında pasajlama işlemini gerçekleştirin.Konfluent hücreleri içeren balonu, besiyeri hücre monotabakasından uzaklaşarak bir köşeye doğru akacak şekilde eğin ve hücreleri rahatsız etmeden besiyerini dikkatlice uzaklaştırmak için steril beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Tni hücreleri için, konfluent monotabakanın üzerine dört mililitre serumsuz böcek besiyeri yavaşça eklemek amacıyla yeni ve steril bir beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. Pipet ucunu balon boyunca hareket ettirin ve balon tabanına gevşek şekilde tutunmuş hücreleri uzaklaştırmak için yavaşça irigasyon yapın.Hücrelerin yeterince ayrıldığını kontrol etmek için tüm medyumu uzaklaştırın, flaskı ters çevirin ve flask tabanının temiz olduğunu gözlemleyin. Daha sıkı yapışan SF9 hücreleri için dört mililitre taze TNM-FH medyumu ekleyin ve yapışık hücreleri yerinden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücre kümelenmesini azaltmak ve nazikçe karıştırmak için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.Hücreleri ayırdıktan sonra, her bir hücre ve besiyeri karışımından yaklaşık 0,1 mililitreyi 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ayrı bir 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne, 10 mikrolitre trypan blue içerisine 10 mikrolitre hücre ve besiyeri karışımı ekleyin. Hücre sayım odası lamını ambalajından çıkarın ve sayım lamının her iki tarafına 10 mikrolitre hücre-besiyeri-trypan blue karışımı ekleyin.Lamı otomatik bir hücre sayıcısına yerleştirin ve hücre yoğunluğu ile canlılığını belirleyin. Yaklaşık 1 ila 1,5 × 10⁶ hücreyi taze besiyeri içeren T25 flasklara aktarın. Flaskları hücre hattı, tarih, kullanılan besiyeri, eklenen hücre sayısı ve pasaj numarası ile etiketleyin.Flaskları 72 saate kadar 28 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Böcek hücresi transfeksiyon prosedürü ayrıca bir laminar akışlı kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir. Uygun bir böcek hücresi besiyeri içerisinde, bir T25 flask'a 1 × 10⁶'ye kadar Tni veya SF9 hücresi ekleyin.Bu demonstrasyonda Tni hücreleri kullanılmıştır. Hücreleri 18 °C'de 72 saat boyunca konfluense ulaşana kadar büyütün. 72 saat sonra, eski besiyerini uzaklaştırıp atın ve daha önce gösterildiği gibi Tni hücrelerini dört mililitre taze serumsuz böcek besiyeri ile yerinden ayırın.Bu prosedürün en zor kısmı, transfeksiyon sırasında cam tabanlı kaplara tutunan hücrelerin uygun yoğunluğunu elde etmektir. Her kaba 7 x 10⁵ hücreden fazlası eklenmemelidir. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için otomatik bir hücre sayıcı kullandıktan sonra, tüpü ters çevirerek hücre süspansiyonunu iyice ancak nazikçe karıştırın ve her bir 35 mm'lik cam tabanlı kaba yaklaşık 7 x 10⁵ hücre ekleyin.Hücrelerin 28 °C'de 20 ila 25 dakika boyunca tutunmasını sağlayın. Her bir transfeksiyon için, steril bir 1,5 ml mikro-santrifüj tüpüne, FBS içermeyen 0,1 ml serumsuz böcek ortamına iki µg plazmit DNA ekleyin. Ayrı bir tüpte, sekiz µl transfeksiyon reaktifini 0,1 ml serumsuz böcek ortamı ile karıştırın.Ardından çözeltiyi, ilgilenilen plazmid DNA'sını içeren tüpe aktarın. Hafifçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, plazmid transfeksiyon karışımını 0,8 ml serumsuz böcek besiyeri ile seyrelterek toplam hacmi bir mililitreye tamamlayın.Hücrelerin yapıştığı cam kapta bulunan medyayı dikkatlice uzaklaştırın. Yapışmış hücrelerin üzerine seyreltilmiş plazmid transfeksiyon medyumunu ekleyin. Hücreleri 28 °C'de beş saat boyunca inkübe edin.Beş saat sonra, transfeksiyon ortamını uzaklaştırıp atın ve hücreleri yerinden oynatmamaya dikkat ederek bir mililitre serumsuz böcek ortamı ile nazikçe yıkayın. İki mililitre taze serumsuz böcek hücresi ortamı ekleyin ve 28 °C'de 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin. Böcek hücrelerinin transfeksiyonundan 48 ila 72 saat sonra, hücreleri bir mililitre IPL-41 böcek ortamı ile bir kez yıkayın ve ardından görüntüleme için iki mililitre IPL-41 ile kaplayın.Besiyerine dört damla Hoechst canlı hücre boyama reaktifi ekleyin ve 28 °C'de 20 ila 25 dakika inkübe edin. 35 mm'lik petri kabını kapalı sistem lazer taramalı konfokal mikroskoba yerleştirin. Piyasada birçok cam kap mevcut olsa da, bunların mikroskop tablasına uygun olması önemlidir ve hücre yapışmasıyla en uyumlu olan cam malzemelerin hangileri olduğunun ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir.Mikroskobu Hoechst, EGFP ve mCherry gözlem koşulları için ayarlayın. Hoechst eksitasyon ve emisyonu için 359 nanometre ve 461 nanometre. EGFP eksitasyon ve emisyonu için 489 nanometre ve 510 nanometre.mCherry eksitasyon ve emisyonu için 580 nanometre ve 610 nanometre kullanılır. Floresan ekspresyonunu doğrulamak için 10X objektif kullanarak başlangıç taraması gerçekleştirin. Ardından, 60X faz kontrastlı su daldırma objektif kullanarak tarama moduna geçin.Görüntü kontrastını ve çözünürlüğünü optimize etmek için lazer gücünü, dedektör hassasiyetini, tarama hızını, Z-ekseni derinliğini ve dijital zumu ayarlayın. Toplamda 90X büyütme sağlamak için hücreleri 1.5X dijital zumda görüntüleyin. Ham verileri, daha sonra analiz etmek üzere TIFF görüntü dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın.Tni hücreleri belirtilen plazmidlerle transfekte edilmiş ve rekombinant proteinlerin ekspresyonu konfokal floresan mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Rekombinant BtDrip1-EGFP'nin başarılı transfeksiyonu ve ekspresyonu, hücre yüzeyindeki yeşil floresan varlığıyla belirgindir. BtDrip2 versiyon bir EGFP ile transfekte edilen hücreler, BtDrip2 versiyon birin hücre içi ekspresyonunu gösteren dahili yeşil floresan sergilemektedir.Benzer şekilde, PIB DmSPR-mCherry veya PIB PLA2G15-mCherry ile transfekte edilen hücreler, ilgili kimeraların ekspresyonunu belirten kırmızı floresans gösterir. Birleştirilmiş görüntülerde, turuncu veya sarı alanlar hem EGFP hem de mCherry ekspresyonunu göstermekte olup, bu durum proteinlerin aynı hücresel alt yapılarda ko-lokalize olduğunu kanırtmaktadır. PIB BtDrip1-EGFP ve PIB DmSPR-mCherry ile çift transfekte edilen hücrelerin üst üste bindirilmiş görüntüleri, BtDrip1-EGFP ve DmSPR-mCherry'nin hücre yüzeyinde ko-lokalize olduğunu göstermektedir.BtDrip2 versiyon bir EGFP ve PIB DmSPR-mCherry ile çift transfekte edilen hücreler, yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinde çok az ko-lokalizasyon göstermektedir; bu durum BtDrip2 versiyon birin hücre içi ekspresyonunu doğrulamaktadır. Buna karşılık, PIB BtDrip2 versiyon bir EGFP ve lizozomal belirteç PIB PLA2G15-mCherry'nin ko-ekspresyonu, sitoplazmik yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinde önemli bir örtüşme ile sonuçlanmıştır. Bu durum, BtDrip2'nin hücre içi lizozomlara taşındığını güçlü bir şekilde göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş böcek hücrelerinde floresan protein kimeralarının nasıl eksprese edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu sistem, protein sentezinde hızlı vektör konstrüksiyonu sunar, virüs tabanlı ekspresyon sistemlerinin zorluklarını önler ve hücresel taşıma proteinlerini gözlemlemek için güçlü bir yol sağlar.

transient-expression-cellular-localization-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Öğrenin, böcek hücrelerinde floresan etiketli proteinlerin geçici ifadesi ve hücresel yerelleştirme yöntemini. Bu teknik, protein fonksiyonu ve hücresel trafik çalışmaları için hızlı ve etkili bir yaklaşım sunar.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Daha fazla video keşfet