Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Bu prosedürün genel amacı, protein fonksiyonunun ve/veya proteinlerin hücresel taşınımının daha iyi aydınlatılması için, ticari olarak temin edilebilen böcek hücreleri içerisinde ilgilenilen floresan etiketli proteinlerin eksprese edilmesidir. Bu yöntem; protein işlevselliği, protein etkileşimleri ve/veya proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ile ilgili temel hücre biyolojisi ve biyokimya tabanlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, konstrüktların hızla oluşturulabilmesi ve eksprese edilen proteinlerin, basülovirüs ekspresyonu ile ilişkili zararlı etkiler olmaksızın canlı hücrelerde fonksiyonel olarak değerlendirilebilmesidir; bu durum böylece verimliliği artırır.

Bu yöntem böcek proteinlerinin incelenmesinde bilgi sağlayabilse de, protein fonksiyonunun veya hücresel lokalizasyonun incelenmesinin istendiği herhangi bir sisteme de uygulanabilir. Böcek hücre kültürü ve transfeksiyon prosedürünü laboratuvarımdan bir teknisyen olan Danni LeRoy uygulamalı olarak gösterecek. Bu prosedüre başlamak için, dondurulmuş SF9 ve Tni hücrelerinin stok tüplerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözülmelerini sağlayın.

Çözündürme işleminden sonra, tüpleri %70 etanol ile dekontamine edin ve buz üzerine yerleştirin. Tüplerin ve doku kültürü flasklarının açılmasını gerektiren tüm hücre manipülasyonları, steril koşulları korumak için laminar akışlı bir kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir. Yeni bir T25 flaskına dört mililitre serumsuz böcek medyumu ve bir başka T25 flaskına dört mililitre TNM-FH medyumu ekleyin.

Çözülmüş Tni hücrelerinden bir mililitreyi serumsuz böcek besiyerinin bulunduğu flaska ve çözülmüş SF9 hücrelerinden bir mililitreyi TNM-FH besiyerinin bulunduğu flaska aktarın. Flaskları 28 degree celsius sıcaklıktaki nemlendirilmemiş bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin yapışması için 30 ila 45 dakika bekleyin. Ekim besiyerini beş mililitre uygun besiyeri ile değiştirin.

Ardından flaskları 28 °C'lik nemlendirilmemiş inkübatöre geri yerleştirin. Hücre konfluensini günlük olarak izleyin. Bu temsili görüntülerde gösterildiği üzere, hücreler %90 konfluense ulaştığında pasajlama işlemini gerçekleştirin.

Konfluent hücreleri içeren balonu, besiyeri hücre monotabakasından uzaklaşarak bir köşeye doğru akacak şekilde eğin ve hücreleri rahatsız etmeden besiyerini dikkatlice uzaklaştırmak için steril beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Tni hücreleri için, konfluent monotabakanın üzerine dört mililitre serumsuz böcek besiyeri yavaşça eklemek amacıyla yeni ve steril bir beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. Pipet ucunu balon boyunca hareket ettirin ve balon tabanına gevşek şekilde tutunmuş hücreleri uzaklaştırmak için yavaşça irigasyon yapın.

Hücrelerin yeterince ayrıldığını kontrol etmek için tüm medyumu uzaklaştırın, flaskı ters çevirin ve flask tabanının temiz olduğunu gözlemleyin. Daha sıkı yapışan SF9 hücreleri için dört mililitre taze TNM-FH medyumu ekleyin ve yapışık hücreleri yerinden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücre kümelenmesini azaltmak ve nazikçe karıştırmak için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Hücreleri ayırdıktan sonra, her bir hücre ve besiyeri karışımından yaklaşık 0,1 mililitreyi 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ayrı bir 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne, 10 mikrolitre trypan blue içerisine 10 mikrolitre hücre ve besiyeri karışımı ekleyin. Hücre sayım odası lamını ambalajından çıkarın ve sayım lamının her iki tarafına 10 mikrolitre hücre-besiyeri-trypan blue karışımı ekleyin.

Lamı otomatik bir hücre sayıcısına yerleştirin ve hücre yoğunluğu ile canlılığını belirleyin. Yaklaşık 1 ila 1,5 × 10⁶ hücreyi taze besiyeri içeren T25 flasklara aktarın. Flaskları hücre hattı, tarih, kullanılan besiyeri, eklenen hücre sayısı ve pasaj numarası ile etiketleyin.

Flaskları 72 saate kadar 28 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Böcek hücresi transfeksiyon prosedürü ayrıca bir laminar akışlı kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir. Uygun bir böcek hücresi besiyeri içerisinde, bir T25 flask'a 1 × 10⁶'ye kadar Tni veya SF9 hücresi ekleyin.

Bu demonstrasyonda Tni hücreleri kullanılmıştır. Hücreleri 18 °C'de 72 saat boyunca konfluense ulaşana kadar büyütün. 72 saat sonra, eski besiyerini uzaklaştırıp atın ve daha önce gösterildiği gibi Tni hücrelerini dört mililitre taze serumsuz böcek besiyeri ile yerinden ayırın.

Bu prosedürün en zor kısmı, transfeksiyon sırasında cam tabanlı kaplara tutunan hücrelerin uygun yoğunluğunu elde etmektir. Her kaba 7 x 10⁵ hücreden fazlası eklenmemelidir. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için otomatik bir hücre sayıcı kullandıktan sonra, tüpü ters çevirerek hücre süspansiyonunu iyice ancak nazikçe karıştırın ve her bir 35 mm'lik cam tabanlı kaba yaklaşık 7 x 10⁵ hücre ekleyin.

Hücrelerin 28 °C'de 20 ila 25 dakika boyunca tutunmasını sağlayın. Her bir transfeksiyon için, steril bir 1,5 ml mikro-santrifüj tüpüne, FBS içermeyen 0,1 ml serumsuz böcek ortamına iki µg plazmit DNA ekleyin. Ayrı bir tüpte, sekiz µl transfeksiyon reaktifini 0,1 ml serumsuz böcek ortamı ile karıştırın.

Ardından çözeltiyi, ilgilenilen plazmid DNA'sını içeren tüpe aktarın. Hafifçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, plazmid transfeksiyon karışımını 0,8 ml serumsuz böcek besiyeri ile seyrelterek toplam hacmi bir mililitreye tamamlayın.

Hücrelerin yapıştığı cam kapta bulunan medyayı dikkatlice uzaklaştırın. Yapışmış hücrelerin üzerine seyreltilmiş plazmid transfeksiyon medyumunu ekleyin. Hücreleri 28 °C'de beş saat boyunca inkübe edin.

Beş saat sonra, transfeksiyon ortamını uzaklaştırıp atın ve hücreleri yerinden oynatmamaya dikkat ederek bir mililitre serumsuz böcek ortamı ile nazikçe yıkayın. İki mililitre taze serumsuz böcek hücresi ortamı ekleyin ve 28 °C'de 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin. Böcek hücrelerinin transfeksiyonundan 48 ila 72 saat sonra, hücreleri bir mililitre IPL-41 böcek ortamı ile bir kez yıkayın ve ardından görüntüleme için iki mililitre IPL-41 ile kaplayın.

Besiyerine dört damla Hoechst canlı hücre boyama reaktifi ekleyin ve 28 °C'de 20 ila 25 dakika inkübe edin. 35 mm'lik petri kabını kapalı sistem lazer taramalı konfokal mikroskoba yerleştirin. Piyasada birçok cam kap mevcut olsa da, bunların mikroskop tablasına uygun olması önemlidir ve hücre yapışmasıyla en uyumlu olan cam malzemelerin hangileri olduğunun ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir.

Mikroskobu Hoechst, EGFP ve mCherry gözlem koşulları için ayarlayın. Hoechst eksitasyon ve emisyonu için 359 nanometre ve 461 nanometre. EGFP eksitasyon ve emisyonu için 489 nanometre ve 510 nanometre.

mCherry eksitasyon ve emisyonu için 580 nanometre ve 610 nanometre kullanılır. Floresan ekspresyonunu doğrulamak için 10X objektif kullanarak başlangıç taraması gerçekleştirin. Ardından, 60X faz kontrastlı su daldırma objektif kullanarak tarama moduna geçin.

Görüntü kontrastını ve çözünürlüğünü optimize etmek için lazer gücünü, dedektör hassasiyetini, tarama hızını, Z-ekseni derinliğini ve dijital zumu ayarlayın. Toplamda 90X büyütme sağlamak için hücreleri 1.5X dijital zumda görüntüleyin. Ham verileri, daha sonra analiz etmek üzere TIFF görüntü dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın.

Tni hücreleri belirtilen plazmidlerle transfekte edilmiş ve rekombinant proteinlerin ekspresyonu konfokal floresan mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Rekombinant BtDrip1-EGFP'nin başarılı transfeksiyonu ve ekspresyonu, hücre yüzeyindeki yeşil floresan varlığıyla belirgindir. BtDrip2 versiyon bir EGFP ile transfekte edilen hücreler, BtDrip2 versiyon birin hücre içi ekspresyonunu gösteren dahili yeşil floresan sergilemektedir.

Benzer şekilde, PIB DmSPR-mCherry veya PIB PLA2G15-mCherry ile transfekte edilen hücreler, ilgili kimeraların ekspresyonunu belirten kırmızı floresans gösterir. Birleştirilmiş görüntülerde, turuncu veya sarı alanlar hem EGFP hem de mCherry ekspresyonunu göstermekte olup, bu durum proteinlerin aynı hücresel alt yapılarda ko-lokalize olduğunu kanırtmaktadır. PIB BtDrip1-EGFP ve PIB DmSPR-mCherry ile çift transfekte edilen hücrelerin üst üste bindirilmiş görüntüleri, BtDrip1-EGFP ve DmSPR-mCherry'nin hücre yüzeyinde ko-lokalize olduğunu göstermektedir.

BtDrip2 versiyon bir EGFP ve PIB DmSPR-mCherry ile çift transfekte edilen hücreler, yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinde çok az ko-lokalizasyon göstermektedir; bu durum BtDrip2 versiyon birin hücre içi ekspresyonunu doğrulamaktadır. Buna karşılık, PIB BtDrip2 versiyon bir EGFP ve lizozomal belirteç PIB PLA2G15-mCherry'nin ko-ekspresyonu, sitoplazmik yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinde önemli bir örtüşme ile sonuçlanmıştır. Bu durum, BtDrip2'nin hücre içi lizozomlara taşındığını güçlü bir şekilde göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş böcek hücrelerinde floresan protein kimeralarının nasıl eksprese edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu sistem, protein sentezinde hızlı vektör konstrüksiyonu sunar, virüs tabanlı ekspresyon sistemlerinin zorluklarını önler ve hücresel taşıma proteinlerini gözlemlemek için güçlü bir yol sağlar.