Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Bu prosedürün genel amacı, protein fonksiyonunun ve / veya proteinlerin hücresel ticaretinin daha iyi aydınlatılması için ticari olarak temin edilebilen böcek hücreleri içinde floresan etiketli proteinleri ifade etmektir. Bu yöntem, protein işlevselliği, protein etkileşimleri ve/veya hücre altı protein lokalizasyonu ile ilgili temel hücre biyolojisi ve biyokimya temelli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yapıların hızlı bir şekilde üretilebilmesi ve presprese edilebilmesi, proteinlerin canlı hücrelerde bakulovirüs ekspresyonu ile ilişkili zararlı etkiler olmaksızın işlevsel olarak değerlendirilmesi ve böylece verimin iyileştirilmesidir.

Bu yöntem, böcek proteinlerinin incelenmesinde içgörü sağlayabilse de, protein fonksiyonu veya hücresel lokalizasyon çalışmasının istendiği herhangi bir sisteme de uygulanabilir. Böcek hücre kültürü ve transfeksiyon prosedürünü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Danni LeRoy olacak. Bu işleme başlamak için, donmuş SF9 ve Tni hücrelerinin stok şişelerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve 37 santigrat derece su banyosunda çözülmelerine izin verin.

Çözüldükten sonra, şişeleri %70 etanol ile dekontamine edin ve buzun üzerine koyun. Şişelerin ve doku kültürü şişelerinin açılmasını gerektiren tüm hücre manipülasyonları, steril koşulları korumak için bir laminer akış başlığı içinde gerçekleştirilmelidir. Yeni bir T25 şişesine dört mililitre serumsuz böcek ortamı ve başka bir T25 şişesine dört mililitre TNM-FH ortamı ekleyin.

Bir mililitre çözülmüş Tni hücresini serumsuz böcek ortamı ile şişeye ve bir mililitre çözülmüş SF9 hücresini TNM-FH ortamı ile şişeye aktarın. Şişeleri 28 santigrat derece nemlendirilmemiş bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 30 ila 45 dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Tohumlama ortamını beş mililitre uygun ortamla değiştirin.

Ve şişeleri 28 santigrat derece nemlendirilmemiş inkübatöre geri koyun. Hücre birleşmesini günlük olarak izleyin. Bu temsili görüntülerde gösterildiği gibi% 90 birleşme noktasına ulaştıklarında hücreleri geçin.

Birleşen hücreleri içeren şişeyi, ortam hücre tek katmanından bir köşeye doğru akacak şekilde eğin ve hücreleri rahatsız etmeden ortamı dikkatlice çıkarmak için steril beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. Tni hücreleri için, birleşen tek tabakaya dört mililitre serumsuz böcek ortamını nazikçe eklemek için yeni bir steril beş mililitre serolojik pipet kullanın. Pipet ucunu şişenin üzerinde hareket ettirin ve şişenin tabanına gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri çıkarmak için yavaşça sulayın.

Hücrelerin yeterli şekilde ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için, tüm ortamı çıkarın, şişeyi ters çevirin ve şişenin tabanının temiz olduğunu gözlemleyin. Daha sıkı yapışan SF9 hücreleri için, dört mililitre taze TNM-FH ortamı ekleyin ve bağlı hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücre topaklanmasını nazikçe karıştırmak ve azaltmak için beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Hücreleri ayırdıktan sonra, her hücre ve orta karışımdan yaklaşık 0,1 mililitreyi 1,5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne aktarın. Ayrı bir 0.5 mililitrelik mikro fuge tüpünde, her hücreden 10 mikrolitre ve orta karışımdan 10 mikrolitre tripan mavisine ekleyin. Hücre sayaç haznesi sürgüsünü ambalajından çıkarın ve sayma sürgüsünün her iki tarafına 10 mikrolitre hücre ortamı tripan mavisi karışımı ekleyin.

Slaytı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin ve hücre yoğunluğunu ve canlılığını belirleyin. Yaklaşık bir ila 1,5 kez 10 ila 6. hücrelere taze ortam içeren T25 şişelerine aktarın. Şişeleri hücre satırı, tarih, kullanılan ortam, eklenen hücre sayısı ve geçiş numarası ile etiketleyin.

Şişeleri 72 saate kadar 28 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Böcek hücresi transfeksiyonu prosedürü de bir laminer akış başlığı içinde gerçekleştirilmelidir. Uygun bir böcek hücresi ortamında bir kez 10 ila 6. Tni veya SF9 hücresi olacak şekilde bir T25 şişesi

Bu gösteride Tni hücreleri kullanılmıştır. Hücreleri 18 santigrat derecede 72 saat boyunca birleşecek şekilde büyütün. 72 saat sonra, eski ortamı çıkarın ve atın ve Tni hücrelerini daha önce gösterildiği gibi dört mililitre taze serumsuz böcek ortamı ile yerinden çıkarın.

Bu prosedürün en zor yönü, transfeksiyon sırasında cam alt tabaklara tutturulmuş hücrelerin uygun yoğunluğunu elde etmektir. Her yemeğe yedi defadan fazla 10 ila 5. hücre eklenmemelidir. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için otomatik bir hücre sayacı kullandıktan sonra, tüpü ters çevirerek hücre süspansiyonunu iyice ama nazikçe karıştırın ve ayrı ayrı 35 milimetre cam tabanlı kaplara yaklaşık yedi kez 10 ila 5. hücreler ekleyin.

Hücrelerin 28 santigrat derecede 20 ila 25 dakika bağlanmasına izin verin. Her transfeksiyon için, steril bir 1.5 mililitrelik mikro-füj tüpünde FBS olmadan 0.1 mililitre serumsuz böcek ortamına iki mikrogram plazmit DNA ekleyin. Ayrı bir tüpte, sekiz mikrolitre transfeksiyon reaktifini 0.1 mililitre serumsuz böcek ortamı ile karıştırın.

Daha sonra çözeltiyi, ilgilenilen plazmit DNA'sını içeren tüpe aktarın. Hafifçe girdap yapın ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, plazmit transfeksiyon karışımını 0.8 mililitre serumsuz böcek ortamı ile seyreltin ve toplam hacmi bir mililitreye getirin.

Ortamı, ekli hücreleri içeren cam tabaktan dikkatlice çıkarın. Bağlı hücreleri seyreltilmiş plazmit transfeksiyon ortamı ile kaplayın. Hücreleri beş saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Beş saat sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri yerinden çıkarmamaya dikkat ederek hücreleri bir mililitre serumsuz böcek ortamı ile nazikçe yıkayın. İki mililitre taze serumsuz böcek hücresi ortamı ekleyin ve 28 santigrat derecede 48 ila 72 saat inkübe edin. Böcek hücrelerinin transfeksiyonundan 48 ila 72 saat sonra, hücreleri bir mililitre IPL-41 böcek ortamı ile bir kez yıkayın ve ardından görüntüleme için iki mililitre IPL-41 ile örtün.

Ortama dört damla Hoechst canlı hücre boyama reaktifi ekleyin ve 28 santigrat derecede 20 ila 25 dakika inkübe edin. 35 milimetrelik çanağı kendinden kapalı lazer taramalı konfokal mikroskoba yerleştirin. Her ne kadar birçok cam tabak ticari olarak mevcut olsa da, mikroskop aşamasına uymaları önemlidir ve hangi cam eşyanın hücre bağlanması ile en uyumlu olduğunu ampirik olarak belirlemek gerekebilir.

Mikroskobu Hoechst, EGFP ve mCherry gözlem koşulları için ayarlayın. Hoechst uyarma ve emisyon için 359 nanometre ve 461 nanometre. EGFP uyarma ve emisyon için 489 nanometre ve 510 nanometre.

Ve mCherry uyarması ve emisyonu için 580 nanometre ve 610 nanometre. 10X objektif kullanarak, floresan ifadesini doğrulamak için bir ilk tarama gerçekleştirin. Bundan sonra, 60X faz kontrastlı suya daldırma objektifi kullanarak tarama moduna geçin.

Görüntü kontrastını ve çözünürlüğünü optimize etmek için lazer gücünü, dedektör hassasiyetini, tarama hızını, Z ekseni derinliğini ve dijital yakınlaştırmayı ayarlayın. Toplam 90X amplifikasyon sağlamak için hücreleri 1,5X dijital yakınlaştırmada görüntüleyin. Ham verileri daha sonra analiz etmek için TIFF görüntü dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın.

Tni hücreleri belirtilen plazmitlerle transfekte edildi ve rekombinant proteinlerin ekspresyonu konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Rekombinant BtDrip1-EGFP'nin başarılı transfeksiyonu ve ekspresyonu, hücre yüzeyinde yeşil floresan varlığı ile belirgindir. BtDrip2 versiyon bir EGFP ile transfekte edilen hücreler, BtDrip2 versiyon bir'in hücre içi ekspresyonunu gösteren yeşil floresan gösterir.

Benzer şekilde, PIB DmSPR-mCherry veya PIB PLA2G15-mCherry ile transfekte edilen hücreler, ilgili kimeraların ekspresyonunu gösteren kırmızı floresan gösterir. Birleştirilmiş görüntülerde, turuncu veya sarı alanlar hem EGFP hem de mCherry'nin ekspresyonunu gösterir, bu da proteinlerin aynı hücre altı yapılar içinde birlikte lokalize olduğunu gösterir. PIB BtDrip1-EGFP ve PIB DmSPR-mCherry ile çift transfekte edilmiş hücrelerin bir katmanı, hücre yüzeyinde BtDrip1-EGFP ve DmSPR-mCherry'nin birlikte lokalizasyonunu önerir.

BtDrip2 versiyon bir, EGFP ve PIB DmSPR-mCherry ile çift transfekte edilen hücreler, BtDrip2 versiyon bir'in hücre içi ekspresyonunu doğrulayan yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinin çok az birlikte lokalizasyonunu gösterir. Buna karşılık, PIB BtDrip2 versiyon bir EGFP ve PIB PLA2G15-mCherry lizozomal markörün birlikte ekspresyonu, sitoplazmik yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinde önemli bir örtüşme ile sonuçlandı. Bu, BtDrip2'nin hücreler arası lizozomlara giden trafik olduğunu kuvvetle göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş böcek hücreleri içinde floresan protein kimeralarının nasıl ifade edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu sistem, protein sentezinde hızlı vektör yapımı sunar, virüs tabanlı ekspresyon sistemlerinin zorluklarını önler ve hücresel kaçakçılık proteinlerini gözlemlemek için sağlam bir araç sağlar.