Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

Hedef ve hedef olmayan translasyon sonrası modifikasyonlar veya PTM'ler ile histon peptitleri içeren bir mikrodizi slaytı alın.

Peptitler, streptavidin ile işlevselleştirilmiş cam slayt üzerindeki belirli noktalarda konjuge biyotin yoluyla hareketsiz hale getirilir.

Lekeler ayrıca, lekelerin tanımlanmasını kolaylaştıran hareketsizleştirilmiş bir biyotin konjuge yeşil florofor içerir.

Spesifik olmayan antikor etkileşimini önleyen bir bloke edici tampon yerleştirin.

Slaytı kurutmak için tamponu çıkarın ve santrifüjleyin.

Bir balmumu yazıcısının içinde, diziyi balmumu ile sınırlayın.

Diziyi bir hibridizasyon arabelleği ile dengeleyin.

Bir hedef PTM için spesifik primer antikorlarla inkübe edin.

Primer antikorlara bağlanan kırmızı florofor konjuge sekonder antikorları tanıtın.

Bağlanmamış antikorları çıkarın ve slaytı kurutmak için santrifüjleyin.

Bir mikrodizi tarayıcı kullanarak slaydı görüntüleyin. Yeşil floresan lekeleri tanımlamaya yardımcı olurken, kırmızı floresan PTM-antikor etkileşimini göstererek antikor özgüllüğünü gösterir.

Hedef PTM'nin tanınması antikor özgüllüğünü gösterirken, hedef olmayan PTM'lerin tanınması antikor çapraz reaktivitesini gösterir.

Kaynak plaka haritası tarafından yönlendirilen, her bir peptit özelliğinden 1 ila 2 mikrolitreyi bir veya daha fazla 384 oyuklu küçük hacimli plakanın belirlenmiş kuyucuklarına yükleyin. Her bir özelliği, %1 sığır serum albümini ve mikrolitre floresein etiketli biotin başına 5 mikrogram ile desteklenmiş 1x protein mikrodizi baskı tamponu ile on kat seyreltin. Daha sonra plakaları oda sıcaklığında 500 kez g'de 2 dakika santrifüjleyin. Ardından, mikrodizi yazıcının atık kabını boşaltın. Yıkama solüsyonunu nemlendirici kaplara steril damıtılmış su ile doldurun. Dizi slayt parametrelerini mikrodizi yazıcı yazılımına girin.

Yıkama prosedürünü tek bir daldırma ile 1 saniyelik bir yıkamaya, yıkama sonrası pimleri beş kez sıkmak için ve nemi% 60'a ayarlayın. Ardından, streptavidin kaplı cam slaytları alt tabaka plakalarına yerleştirin. Plakaları merdane asansörüne yükleyin. Kaynak plakalarını plaka tutuculara yerleştirin ve tutucuları kaynak plakası asansörüne yükleyin. Yazdırma işlemini çalıştırın.

Ardından, alt tabaka plakalarını cihazdan çıkarın. Basılı slaytları sallarken 30 dakika boyunca 1x protein mikrodizi engelleme tamponu ile bloke edin. Ardından, slaytları oda sıcaklığında pH 7.6 fosfat tamponlu tuzlu suda 10 dakika yıkayın. Yıkamayı yeni bir PBS partisi ile tekrarlayın. Slaytları oda sıcaklığında 30 saniye santrifüj ederek kurutun.

Ardından, bir mikrodizi balmumu yazıcısını 85 santigrat derecede 30 dakika veya balmumu eriyene kadar önceden ısıtın. Ardından, yazdırılacak yüzü aşağı bakacak şekilde bir slaytı tutucuya yerleştirin ve tutucuyu baskı makinesi kalıbıyla hizalayın. Kalıbı sürgü ile temas ettirin ve iki saniye basılı tutun. Ardından, sürgüyü tutucudan hızlı bir şekilde çıkarın ve dizilerin düzgün şekilde kapatıldığını doğrulamak için cila kenarlıklarını inceleyin. Bölünmüş slaytları 4 santigrat derecede kuru ve karanlık bir yerde saklayın.

Hibridizasyon prosedürüne başlamak için, plastik bir tabağa bölümlenmiş bir dizi slaydı yerleştirin ve slaydı hibridizasyon tamponu ile örtün. Düşük hızda sallarken sürgüyü 30 santigrat derecede 4 dakika boyunca dengeleyin. Oda sıcaklığında bir mikrodizi slayt santrifüjünde döndürerek slaytı kurutun. Daha sonra, dizinin en az iki oyuğuna her bir histon PTM antikor çözeltisinden 5 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve diziyi 4 santigrat derecede her biri 5 dakika boyunca üç kez soğuk PBS ile yıkayın. Daha sonra, diziyi bir floresan boya konjuge ikincil antikor çözeltisi içinde, ışık yokluğunda 4 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Slaytı daha önce olduğu gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın.

Fazla tuzları çıkarmak için diziyi oda sıcaklığında 0.1x PBS'ye batırın ve slaytı oda sıcaklığında kısa bir santrifüjleme ile kurutun. Slaytı en az 25 mikron çözünürlükte bir mikrodizi tarayıcı ile görüntüleyin.