Beyin Dokusundaki Anormal Prion Proteinlerinin İmmünohistokimya Kullanılarak Saptanması

Yanlış katlanmış prion protein agregatları sergileyen sabit bir memeli beyin bölümü ile bir slayt yapın.

Prion agregatlarının enfektivitesini azaltmak için bölümü formik asit ile muamele edin.

Hidratlı bir basınç odası içinde asidik bir tampon ile muamele edin. Yüksek ısı ve asidik pH kırma fiksasyonunun neden olduğu protein çapraz bağları, antijenik epitopları maskeler.

İstenmeyen arka plan lekelenmesini önlemek için endojen peroksidazı etkisiz hale getirmek için hidrojen peroksite daldırın.

Slaytı bir kapak plakasına yerleştirin ve doku hidrasyonunu korumak için bir tampon ekleyin.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önleyen bir bloke edici çözelti tanıtın.

Prion agregatlarına özgü bir primer antikor ekleyin.

Bağlanmamış antikor moleküllerini çıkarın. Birincil antikora bağlanan biyotinile edilmiş bir ikincil antikor tanıtın.

Bağlanmamış antikor moleküllerini çıkarın. İkincil antikor üzerindeki biyotine bağlanan avidin ile komplekslenmiş bir biyotinile peroksidaz enzimi ekleyin.

Peroksidazın renkli bir ürüne oksitlediği kromojenik bir substrat ekleyin.

Bir mikroskop kullanarak lekeli agregaları gözlemleyin.

Doku bölümlerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 98 formik aside dikkatlice daldırın. Bölümleri musluk suyunda 5 dakika durulayın, ardından damıtılmış suda iki kez durulayın. 10 milimolar sitrat tamponunu 20 dakika boyunca 98 santigrat derecede ön işleme tabi tutmak için 500 mililitre damıtılmış su ile doldurulmuş basınç odasında paslanmaz çelik bir boyama kabı kullanın.

Kalite kontrol amacıyla, sıcaklık ve basıncı izlemek için sepetin üzerine yapışkan otoklav gösterge bandının bir bölümünü yerleştirin. Alarm, ekipmanın program süresine ve sıcaklığına ulaştığını gösterdiğinde, sepeti sürgülerle daldırın. Ardından, ikinci noktayı ayarlamak için basınç odasındaki programı başlatın ve bu programın ilk ve son basıncını kaydedin.

Endojen peroksidazın inaktivasyonu için, numune bölümlerini içeren kayar sepeti 30 dakika boyunca metanol içinde% 3 hidrojen peroksit banyosuna daldırın. Bölümleri akan su altında 5 dakika durulayın. Boşalttıktan sonra, bölümleri 5 dakika daha üç tamponlu tuzlu suya batırın. İmmünolojik tespit için, her bir slaytı Tris tamponlu tuzlu su ile önceden nemlendirilmiş, piyasada bulunan bir kapak plakası tutucusuna yerleştirin.

Doku tarafı tutucuya bakacak ve kayar kenarlar tutucunun iki alt noktasıyla çakışacak şekilde hava kabarcıklarını önlediğinizden emin olun. Sürgülü tutucu tertibatını başparmak ve işaret parmağı arasında tutun. Bir parmağınızı numune slaytının üstünde, diğerini ise tutucunun altında tutun. Ardından montajı sistemin galerisine yerleştirin.

Setin iyi bir şekilde monte edildiğinden emin olmak için, numune lamı ile tutucu arasındaki kuyuyu taşmadan tris-tamponlu tuzlu su ile doldurun. Bu noktadan sonra, tutucu ile sürgü arasında yaklaşık 80 mikrolitre Tris tamponlu salin tutulması gerektiğinden emin olun. Bölümlerin kurumasına izin vermeyin.

Tris tamponlu salin içinde ikincil antikor konakçısı ile aynı türden% 20 normal serum ile slayt örneklerini 30 dakika boyunca ön inkübe ederek birincil antikor ile tedaviden önce arka plan lekelenmesini azaltın. Bölümleri yıkamadan, 200 mikrolitre birincil antikor solüsyonunu doğrudan slayt tutucu setinin her bir oyuğuna uygulayın ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.

Bölümleri yıkamak için kuyucukları tris-tamponlu tuzlu su ile doldurun ve 5 dakika bekleyin. Yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra, biyotinile edilmiş ikincil antikoru, tris-tamponlu salin içinde 1 ila 200 konsantrasyonda% 10 at serumu ile seyreltin.

Tedavi edilecek bölüm sayısına bağlı olarak gerekli hacmi onarın. Slayt tutucu setinin her bir oyuğuna 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyondan sonra, Tris tamponlu tuzlu su yıkamasını tekrarlayın.

Avidin-biotin kompleksi peroksidaz ile inkübasyon için, reaktifi kullanmadan 30 dakika önce hazırlayın. ve kayar plaka tutucusunun her bir oyuğuna 200 mikrolitre çözelti uygulayın. Bittiğinde, plaka tutucu setini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.