Tasarlanmış Lentivirüsler Kullanılarak Nöronlarda İnsan Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

Yapışmış insan pluripotent kök hücrelerini bir transfeksiyon reaktifinde tasarlanmış lentivirüslerle tedavi edin.

Virüs, tetrasikline duyarlı ve düzenleyici elemanlar tarafından kontrol edilen antibiyotik direnci ve nörojenik transkripsiyon faktörü için genler taşır.

Pozitif yüklü transfeksiyon reaktifi, viral füzyonu ve içerik salınımını arttırır.

Viral RNA, DNA'ya ters kopyalar ve kök hücre DNA'sına entegre olur, bu da aktivatör proteinler üreten düzenleyici elementlerin ekspresyonunu sağlar.

Aktivatör proteinleri ile bir kompleks oluşturan tetrasiklin türevi ile bir bazal ortam ekleyin.

Bu kompleks, tetrasikline duyarlı elemente bağlanır, gen ekspresyonunu teşvik eder ve kök hücrenin nöronlara farklılaşmasını indükleyen nörojenik transkripsiyon faktörlerini üretir.

Transfekte edilmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için bir antibiyotik ilacı ile bir bazal ortam ekleyin.

Hücreleri, hücre dışı matrisi veya ECM'yi bozan ve hücreleri serbest bırakan proteolitik enzimler içeren bir ayırma solüsyonu ile tedavi edin.

Enzimleri çıkarın ve hücreleri, nöronal olgunlaşmayı teşvik eden bir olgunlaşma ortamı ile ECM kaplı oyuklara yeniden plakalayın.

Farklılaşma indüksiyonundan iki gün önce, 1 mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek ES hücrelerini ayırın. Hücreleri bir tüpe aktarın. Daha sonra kuyuyu 2 mililitre ortamla yıkayın ve aynı tüpe ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, peleti ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri, oyuk başına 1 çarpı 10 ila beşinci hücre oturma yoğunluğunda matris kaplı altı oyuklu plakalara plakalayın.

Ertesi gün, Ngn2 artı PuroR ve tetrasiklin transaktivatörünü eksprese eden lentivirüsleri polibren ile birlikte taze ES hücre bakım ortamına ekleyin. Sıfırıncı günde, N2 ile desteklenmiş ve morfojen içermeyen DMEM / F12 ortamında mililitre doksisiklin başına 2 mikrogram ekleyin. Birinci günde, taze DMEM / F12 artı N2 ve doksisiklin içinde puromisin ekleyin, mililitre başına 1 mikrogramlık nihai konsantrasyona kadar.

En az 24 saat boyunca puromisin içindeki transdüksiyon hücrelerini seçin. İkinci günde, farklılaşan nöronları hücre ayırma çözeltisi ile ayırın ve bunları matris çözeltisi ile kaplanmış 24 oyuklu plakalar üzerine yeniden plakalayın. Bunları doksisiklin içermeyen NBA/B27 ortamında muhafaza edin. Hücre dışı matris bazlı çözeltilerle kaplanmış plakalar üzerinde saf indüklenmiş nöronları kültürleyin.