Bir Biyotin Türevi Kullanılarak Hedef Yüzey Proteinlerinin İçselleştirilmesinin Değerlendirilmesi

Fare kortikal astrositlerini bölünebilir bir biyotin türevi ile tedavi edin.

Protein içselleşmesini önlemek ve biyotinin hedef yüzey proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırmak için düşük bir sıcaklıkta inkübe edin.

Yıkayın ve ılık bir ortam ekleyin, ardından biyotinile proteinlerin içselleştirilmesini inkübe etmek için inkübe edin.

İçselleştirilmemiş biyotini parçalamak için membran geçirimsiz bir indirgeyici madde ile yıkayın ve işlemden geçirin.

Reaksiyonu durdurmak ve yıkamak için bir söndürme reaktifi ekleyin.

Hücreleri ve santrifüjü hasat edin. Süpernatanı çıkarın.

Hücreleri parçalamak için bir lizis tamponu ekleyin, biyotinile edilmemiş ve içselleştirilmiş biyotinile proteinleri serbest bırakın.

Hücre kalıntılarını peletlemek için santrifüjleyin.

Süpernatan içeren proteinleri toplayın, streptavidin-agaroz boncukları ekleyin ve biyotinile proteinleri yakalamak için karıştırın.

Boncukları peletlemek için santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Proteinleri boncuklardan denatüre etmek ve serbest bırakmak için bir yükleme tamponu ve ısı ekleyin.

Proteini bir jel üzerinde çalıştırın ve bir lekeleme zarına aktarın.

Farklı bir protein bandını görselleştirmek için birincil ve ikincil antik