Bir Biyotin Türevi Kullanılarak Hedef Yüzey Proteinlerinin İçselleştirilmesinin Değerlendirilmesi

Fare kortikal astrositlerini bölünebilir bir biyotin türevi ile tedavi edin.

Protein içselleşmesini önlemek ve biyotinin hedef yüzey proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırmak için düşük bir sıcaklıkta inkübe edin.

Yıkayın ve ılık bir ortam ekleyin, ardından biyotinile proteinlerin içselleştirilmesini inkübe etmek için inkübe edin.

İçselleştirilmemiş biyotini parçalamak için membran geçirimsiz bir indirgeyici madde ile yıkayın ve işlemden geçirin.

Reaksiyonu durdurmak ve yıkamak için bir söndürme reaktifi ekleyin.

Hücreleri ve santrifüjü hasat edin. Süpernatanı çıkarın.

Hücreleri parçalamak için bir lizis tamponu ekleyin, biyotinile edilmemiş ve içselleştirilmiş biyotinile proteinleri serbest bırakın.

Hücre kalıntılarını peletlemek için santrifüjleyin.

Süpernatan içeren proteinleri toplayın, streptavidin-agaroz boncukları ekleyin ve biyotinile proteinleri yakalamak için karıştırın.

Boncukları peletlemek için santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Proteinleri boncuklardan denatüre etmek ve serbest bırakmak için bir yükleme tamponu ve ısı ekleyin.

Proteini bir jel üzerinde çalıştırın ve bir lekeleme zarına aktarın.

Farklı bir protein bandını görselleştirmek için birincil ve ikincil antikorları kullanarak tespit edin ve başarılı protein içselleştirmesini doğrulayın.

İlk olarak, astrosit kültürlerini inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin. Daha sonra, hücreleri 4 mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve bulaşıkları kırılmış buzun üzerine yerleştirin. CM-PBS'yi aspire edin ve ardından her tabağa 3 mililitre biyotin tamponu pipetleyin. Tamponun iyi dağıldığından emin olmak için bulaşıkları birkaç kez ileri geri eğin ve 30 dakika buz üzerinde bırakın.

Ardından, biyotin tamponunu aspire edin ve 5 mililitre ılık ortamla değiştirin. Bir kültür kabını 37 santigrat derecede 15 dakika ve ikinci bir yemeği aynı sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin. Sıfır dakika örneği olarak 4 santigrat derecede başka bir tabak bırakın.

Kuluçka süresinin sonunda, ortamı atın ve hücreleri 4 mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, CM-PBS'yi aspire edin ve ardından hücrelerin üzerine 6 mililitre indirgeyici tampon pipetleyin ve numuneyi 15 dakika buz üzerinde bırakın.

Ardından, ortamı 6 mililitre taze indirgeyici tampon ile değiştirin ve numuneyi 15 dakika daha buzun üzerine koyun.

İndirgeyici tampon içinde bulunan glutatyon, hücre yüzeyinde kalan biyotin kısımlarını parçalayacağından bu adım kritiktir. Bu, yalnızca içselleştirilmiş proteinlerin önyargılı ve etiketli olmasını sağlar.

Bunu takiben, indirgeyici çözeltiyi çıkarın ve 6 mililitre söndürme tamponu ile değiştirin. Numuneyi 15 dakika daha buz üzerinde bırakın ve su verme adımını bir kez daha tekrarlayın. Ardından, söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mililitre soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın.

CM-PBS'yi aspire edin ve daha sonra, hücreleri bir hücre kaldırıcı kullanarak 1 mililitre soğutulmuş PBS'ye kazıyın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri üç dakika boyunca 100 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Üç dakika sonra, süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Numuneyi 30 dakika buz üzerinde bırakın ve her beş dakikada bir girdap yapın. Deterjanı ve çözünür malzemeleri peletlemek için lizatı 14.000 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, lizata 150 mikrolitre streptavidin agaroz bulamacı ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde üç saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Üç saat sonra, streptavidin agaroz boncuklarını 1.500 g'da 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüjleme ile peletleyin. Boncukları 1 mililitre yıkama tamponunda tekrar süspanse edin ve 4 santigrat derecede üç dakika sallayın. Boncukları peletleyin ve süpernatanı atın.

Biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın. Ardından, boncukları 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 1.500 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Üstteki yıkama tamponunu atın ve 50 mikrolitre 1x yükleme tamponu ekleyin.

95 santigrat derecede denatüre ederek boncuklardan biotin ve streptavidin salın. Bu fraksiyon sadece içselleştirilmiş hücre yüzey proteinlerini içermelidir. Ardından, girişi, hücre yüzeyini ve bağlanmamış fraksiyonları SDS-PAGE ile ayırın ve Western blotting ile analiz edin.