Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı nöronların yüzeyindeki proteinleri işaretlemek ve ardından diferansiyel ikincil antikor işaretlemesi kullanarak yüzey proteinlerini internalize olmuş proteinlerden ayırt etmektir. Bunu gerçekleştirmek için, lamel üzerine kültüre edilmiş primer nöronlar, bir yüzey epitopuna yönelik bir antikor ile inkübe edilir ve internalizasyona izin vermek için bekletilir. İnkübasyonun ardından, yüzeye açık proteinleri tanımlamak için floresan işaretli bir ikincil antikor uygulanır.

Ardından, yüzeyde kalan herhangi bir protein primer antikor kompleksini bloke etmek için fazla miktarda işaretlenmemiş sekonder antikor uygulanır. Kültürlenmiş nöronlar daha sonra permeabilize edilir ve internalize olmuş proteini tespit etmek için farklı renkte bir sekonder antikor uygulanır. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskopi yoluyla internalize olmuş proteine karşı yüzey proteininin göreceli seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu prosedürün ardından, bazal ve stimüle edilmiş koşullar altında protein taşınma hızları hakkında bilgi sağlayan, kaynak yüzey protein internalizasyonunun bir zaman seyri elde edilebilir. Bu prosedüre, hücre kültürü yıkama için önceden hazırlanmış olan, bir gün önce PBS içeren üç ayrı durulama kabına daldırılarak hazırlanmış, polilizin kaplı 18 milimetrelik borosilikat cam lamelleri hazırlayarak başlayın. 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 500 µL laminat çözeltisi ekleyin ve ardından pens kullanarak lamelleri her bir kuyucuğun içine yerleştirin. Her bir lamelin kuyucuğun tabanına düz bir şekilde oturduğundan emin olmak için üzerine bastırın ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; bu protokol, E 15 fare korteksleri veya E 18 sıçan hipokampusları kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu gösterimde fare korteksleri kullanılmıştır. Yarım batın veya bir batın embriyodan alınan korteksleri, kalsiyum ve magnezyum içeren PBS bulunan bir mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerinde bekletin. Ardından, bir mililitrelik bir mikro pipet kullanarak PBS'yi kortikal dokudan uzaklaştırın.

Ardından, yarım batın embriyosundan alınan kortikal dokuya 500 µL Pappa DNA çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 15 ila 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresince iki kez, içeriği karıştırmak için tüpü nazikçe vurun; inkübasyon sonrası, hücre dağılımı sağlanana kadar dokuyu alevle cilalanmış silikonize bir Pasteur pipeti kullanarak nazikçe 10 ila 15 kez rerate edin.

Sosyasyon gerçekleşmemiş doku parçaları kalmamalı veya çok az kalmalıdır; kabarcık oluşumundan kaçının. Sosye edilmiş hücre süspansiyonunu, katkı maddeleri içeren Hank's BSS içindeki %4 BS, A'dan oluşan üç mililitrelik bir yastık katmanının üzerine dikkatlice ekleyin. Ardından, salınımlı rotorlu bir masaüstü santrifüjde 100 ×g'de yedi dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra, hücre peletini aspire etmemeye dikkat ederek süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, bir mililitre komple nörobazal besiyeri ekleyin ve peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için pipetle nazikçe aşağı yukarı hareket ettirin. Sonrasında, canlı hücre konsantrasyonunu belirlemek için bir hemositometre kullanın.

Ekimden hemen önce sadece faz kontrastında parlak görünen hücreler canlı kabul edilmelidir. Kuyucuklardaki lamellere ait fazla laminin serum çözeltisini aspire edin ve bunu primer nöron kültür ortamı ile değiştirin. Ardından, her bir kuyucuğa 75.000 ile 100.000 arasında primer nöron ekleyin.

Nöronları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nörobazal besiyerinde 21 güne kadar kültüre edin; yedinci günde ve sonrasındaki her hafta, glial aşırı büyümeyi önlemek için anti-mitotik florodeoksiridin ekleyin ve besiyerinin yarısını yenileyin. Kültürdeki ilk hafta boyunca nöronlar, iki günlük bir kültürün bu görüntüsünde gösterildiği gibi dendritik ağlar geliştirirler. İkinci ile üçüncü hafta arasında olgunlaşır ve sinaptogeneze girerler.

In vitro'da 14. günde çekilen bu şekilde geniş bir projeksiyon ağı gösterilmiştir; yüzeye açığa çıkmış ilgilenilen proteinleri işaretlemek için primer antikoru uygun konsantrasyonda doğrudan kondisyonlu medyuma ekleyin. Her durum üç paralel şeklinde test edilmelidir. Dört kontrol; pre-immün serum veya proteinin ekzositoz sırasında açığa çıkmayan hücre içi bölgelerini tanıyan antikorlar, test primer antikoru ile aynı dilüsyonda kullanılabilir. Hücreleri kültür inkübatörüne geri yerleştirin; bir, iki veya dört saatlik inkübasyonun ardından antikor içeren medyumu aspire edin ve kuyucukları PBS ile bir kez nazikçe ancak hızla yıkayın.

Kuyucuklara solüsyon ekleyip ardından aspire ederek oda sıcaklığına getirin. Sonrasında taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Sabitleme işleminin ardından hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığına getirin.

Paraformaldehit solüsyonunu kuyucuklardan uzaklaştırın ve çeker ocaktaki sıvı atık konteynerine dökün. Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi üç kez hızlıca PBS ile durulayın. Lamelleme camının kolayca çıkarılabilmesi için üçüncü yıkama solüsyonunu içeride bırakın.

Ardından, pens yardımıyla lamelleri plakadan dikkatlice çıkarın ve hücre tarafı yukarı gelecek şekilde, tek kullanımlık bir kültür plağının tabanında veya kapağında bulunan bir parafilm parçasına yerleştirin. Boyama protokolünün geri kalanı bu yüzey üzerinde gerçekleştirilecektir; hücrelerin kurumaması için lamel üzerinde yuvarlak bir damla oluşturacak şekilde PBS %5 BSA bloklama çözeltisini nazikçe pipetleyiniz. 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bloklama çözeltisine deterjan eklememeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Sadece hücre yüzey proteinlerinin etiketleneceği durumlarda, bu aşamada hücreler permeabilize edilmemelidir. Bloklama işleminden sonra bloklama çözeltisini aspire edin, ardından yüzeye açık proteinleri etiketlemek için floresan işaretli bir sekonder antikor uygulayın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından sekonder antikoru aspire edin ve işaretli sekonder antikora bağlanmamış hücre yüzeyindeki herhangi bir proteini bloklamak için lamelletleri PBS ile her seferinde beş dakika olmak üzere iki kez yıkayın.

Geçirgen olmayan nöronları, yüksek konsantrasyonlu etiketsiz sekonder antikor ile oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Gece boyunca yapılan inkübasyon kritik öneme sahiptir.

Daha kısa inkübasyon süreleri, işaretli sekonder antikor tarafından tamamen bağlanmamış olan herhangi bir primer antikoru tamamen bloke etmeyecektir. Ertesi gün, lamelleri daha önce olduğu gibi PBS ile beşer dakikalık iki kez yıkama işleminden geçirin. Ardından, fiksatif kaldırıldıktan sonra hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca fosfat tamponu içindeki %4 paraformaldehit ile yeniden fikslenmiş hale getirin.

Hücreleri PBS ile iki kez hızlıca durulayın. Ardından hücre içi etiketleme için, hücreleri %5 BSA ve %0,1 Triton X 100 içeren PBS ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca permeabilize edin ve bloke edin. Permeabilizasyonun ardından bloklama çözeltisini uzaklaştırın.

Lamellerin kurumamasına dikkat edin. Farklı etiketlenmiş bir sekonder antikor ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. İkinci sekonder antikoru uzaklaştırdıktan sonra, lamelleri PBS ile beşer dakikalık üç yıkamaya tabi tutun.

Ardından bunları kısa süreliğine deiyonize su ile yıkayın. Lamlar üzerine, solma önleyici madde içeren sulu bir montaj ortamı ile kapatma lamlarını yerleştirin ve kurumaya bırakın; floresan sinyalinin optimal korunması için lamları dört derece santigrat sıcaklıkta karanlıkta saklayın. İmmün boyanmış hücreleri, uygun eksitasyon ve emisyon filtrelerini kullanarak konfokal mikroskopta görüntüleyin.

Görüntüleme sonrası tüm tekrarlar ve koşullar için aynı görüntüleme kazanım parametrelerini kullanın. Nöron yüzeyinde bulunup bulunmadığını ve hücre içine alınıp alınmadığını belirlemek için standart ilgi alanlarının entegre yoğunluğunu veya sayı ve boyut gibi punta özelliklerini belirlemek amacıyla Fiji Image J veya metamorph gibi standart görüntü analiz yazılımları kullanın. Kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronlarının çift renkli etiketlemesi, bu videoda açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir.

Bu görüntüde, hücre yüzeyi proteini siyan renkle, internalize olmuş protein ise yeşil renkle gösterilmiştir. Ok başı ile belirtilen çift boyanma, yalnızca sağlıksız göründüğü belirlenen bir hücrede gözlemlenmiştir; antikor besleme inkübasyonu sırasında internalize olan proteinin endozomlarda lokalize olup olmadığını belirlemek için, erken geri dönüşüm endozom belirteci transferrin mCherry eksprese eden nöronlar, permeabilizasyon sonrası immünoboyanmıştır. Dendritik arborun bu bölgesinde görüldüğü üzere, noktasal boyanma ile transferrin arasında yaygın bir örtüşme meydana gelmiş ve bu durum, internalize olan proteinin endozomlarda lokalize olduğu kanıtlamıştır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre yüzeyi ve internalize protein havuzlarını birbirinden ayırmak için tek bir antikorun kullanılabilmesidir.