Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı nöronların yüzeyindeki proteinleri etiketlemek ve daha sonra diferansiyel ikincil antikor etiketlemesi kullanarak yüzey proteinini içselleştirilmiş proteinlerden ayırt etmektir. Bunu yapmak için, kapak camı üzerinde kültürlenen birincil nöronlar, bir yüzey epitopuna karşı yönlendirilmiş bir antikor ile inkübe edilir ve içselleştirmeye izin vermek için inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, yüzeye maruz kalan proteinleri tanımlamak için floresan olarak işaretlenmiş bir ikincil antikor uygulanır.

Daha sonra, kalan yüzey proteini birincil antikor komplekslerini bloke etmek için fazla etiketlenmemiş ikincil antikor uygulanır. Kültürlenen nöronlar daha sonra perme yapılır ve içselleştirilmiş proteini tespit etmek için farklı renkte ikincil bir antikor uygulanır. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ile içselleştirilmiş ve yüzey proteininin nispi seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu prosedürü takiben, fesleğen ve uyarılmış koşullar altında protein kaçakçılığı oranları hakkında bilgi veren bir kaynak yüzey proteini içselleştirme süresi elde edilebilir. Bu işleme hücre kültürü yıkama için kapak fişleri hazırlayarak başlayın, bir gün önce hazırlanmış polilisin kaplı 18 milimetre bolik cam kapak fişlerini PBS içeren üç ayrı durulama kabına daldırarak yıkayın 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 500 mikrolitre laminat çözeltisi ekleyin ve ardından forseps kullanarak, kapak fişlerini her birine yerleştirin. Kuyu dibinde düz bir şekilde oturduğundan emin olmak için her bir kapak kızağına 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edildiğinden emin olmak için iyice bastırın, bu protokol E 15 fare korteksleri veya E 18 sıçan su aygırı Campi kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu gösteride fare korteksleri kullanılır. Kalsiyum ve magnezyum içeren PBS içeren bir mililitrelik einor içinde yarım çöp veya bir çöp embriyodan korteksleri buz üzerine yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, bir mililitrelik bir mikro pipet kullanarak, PBS'yi kortikal dokudan çıkarın.

Daha sonra 500 mikrolitre Pappa DNA'nın bir solüsyonunu yarım litre embriyodan alınan kortikal dokuya ekleyin. 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca iki kez, inkübasyondan sonra içeriği karıştırmak için tüpü hafifçe vurun, hücre dispersiyonu elde edilene kadar dokuyu 10 ila 15 kez nazikçe yeniden canlandırmak için alevle parlatılmış silikonlu bir macun pipeti kullanın.

Çok azı, ayrışmamış doku parçalarının kalması gerekiyorsa, kabarcık oluşumunu önleyin. Ayrışmış hücre süspansiyonunu, katkı maddeleri ile Hank'in BSS'sinde üç mililitrelik %4 BS, A yastığının üzerine dikkatlice katmanlayın. Daha sonra, yedi dakika boyunca 100 kez G'de açılır rotorlu bir santrifüje sahip bir tezgah üstü santrifüjde.

Döndürme işleminden sonra, hücre peletini aspire etmemeye dikkat ederek süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra bir mililitre tam nöro bazal ortam ekleyin, peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, canlı hücre konsantrasyonunu belirlemek için bir hemo sitometre kullanın.

Sadece faz parlak hücreler, kaplamadan hemen önce canlı olarak kabul edilmelidir. Fazla laminat serum solüsyonunu oyuklardaki kapak kızaklarından aspire edin ve birincil nöron kültürü ortamı ile değiştirin. Daha sonra her oyuğa 75.000 ila 100.000 birincil nöron ekleyin.

Nöronları 37 santigrat derecede, yedinci günde% 5 karbondioksitte nöro bazal ortamda 21 güne kadar kültürleyin ve bundan sonra her hafta, glial aşırı büyümeyi önlemek ve yarım orta bir değişiklik gerçekleştirmek için anti-mitotik floro, deoksi üridin üridin ekleyin. Kültürdeki ilk hafta boyunca, nöronlar, iki günlük bir kültürün bu görüntüsünde gösterildiği gibi dendritik arbors geliştirdi. İkinci ila üçüncü haftaya kadar olgunlaştılar ve sinaptogenez geçirecekler.

İlgilenilen yüzeye maruz kalan proteinleri etiketlemek için in vitro olarak 14 günde alınan bu şekilde geniş bir projeksiyon ağı gösterilmektedir, birincil antikoru uygun konsantrasyonda doğrudan şartlandırılmış ortama ekleyin. Her koşul üç kopya halinde test edilmelidir Dört kontrol, ön immün serum veya ekzositoz sırasında maruz kalmayan proteinin hücre içi bölgelerini tanıyan antikorlar, test birincil antikoru ile aynı seyreltmede kullanılabilir. İnkübasyondan sonra hücreleri bir, iki veya dört saat boyunca kültür inkübatörüne geri koyun, antikor içeren ortamı aspire edin, kuyuları bir kez nazikçe ama hızlı bir şekilde PBS ile yıkayın.

Kuyucuklara çözelti ekleyerek oda sıcaklığını ekleyin, ardından aspire edin. Daha sonra taze hazırlanmış% 4 para formaldehit ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Sabitlemeyi takiben hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığını ekleyin.

Para formaldehit çözeltisini kuyulardan çıkarın ve çeker ocaktaki sıvı atık kabına atın. Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi PBS ile üç kez hızlıca durulayın. Kapak kaymasının kolayca çıkarılabilmesi için üçüncü yıkamayı yerinde bırakın.

Ardından, kapak fişlerini plakadan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın ve bunları hücre tarafı yukarı bakacak şekilde tek kullanımlık bir kültür plakasının tabanındaki veya kapağındaki bir param tabakasına yerleştirin. Boyama protokolünün geri kalanı bu yüzey üzerinde gerçekleştirilecektir: PBS% 5 BSA'nın bloke edici solüsyonunu hücrelere nazikçe pipetleyin ve kurumaması için kapak kızağı üzerinde yuvarlak kabarcık şeklinde bir damla yapın. 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Engelleme çözeltisine deterjan eklememeyi unutmamak önemlidir. Bu aşamada, sadece hücre yüzey proteinleri etiketlenmesi gerektiğinde hücrelere nüfuz edilmemelidir. Bloke ettikten sonra, bloke edici çözeltiyi aspire edin, daha sonra yüzeye maruz kalan proteinleri etiketlemek için, floresan etiketli bir ikincil antikor uygulayın, daha sonra inkübasyonu takiben oda sıcaklığında iki saat inkübe edin, ikincil antikoru aspire edin ve kapak fişlerini PBS ile iki kez yıkayın her seferinde beş dakika boyunca etiketli ikincil antikor tarafından bağlanmayan hücre yüzeyindeki herhangi bir proteini bloke etmek için.

Geçirgen olmayan nöronları gece boyunca yüksek konsantrasyonda etiketlenmemiş ikincil antikor ile inkübe edin. Oda sıcaklığında. Gece boyunca kuluçka çok önemlidir.

Daha kısa inkübasyon süreleri, etiketli ikincil antikor tarafından tam olarak bağlanmamış herhangi bir birincil antikoru tamamen bloke etmeyecektir. Ertesi gün, kapak fişlerini daha önce olduğu gibi PBS ile her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri% 4 para formaldehit ile fiksatifin çıkarılmasından sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca fosfat tamponunda

Hücreleri PBS ile iki kez hızlıca durulayın. Hücre içi etiketleme için daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 BSA ve% 0.1 Triton X 100 içeren PBS ile hücrelere nüfuz edin ve bloke edin. Geçirgenliği takiben, engelleme çözeltisini çıkarın.

Kapak kaymalarının kurumamasına özen gösteriniz. Farklı etiketlenmiş bir ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İkinci ikincil antikoru çıkardıktan sonra, kapak fişlerini PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra deiyonize su montajı ile kısa bir süre yıkayın. Kapak, solmayı önleyici bir madde içeren sulu bir montaj ortamı ile cam slaytlar üzerine kayar ve floresan sinyalinin en iyi şekilde korunması için slaytları karanlıkta dört santigrat derecede kuru bir şekilde saklamalarına izin verir. İmmüno-boyama hücrelerini, uygun uyarma ve emisyon filtrelerini kullanarak konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.

Görüntülemeyi takip eden tüm çoğaltmalar ve koşullar için aynı görüntüleme elde etme parametrelerini kullanın. Fiji Image J veya metamorf gibi standart görüntü analiz yazılımlarını kullanarak, standart ilgi bölgelerinin entegre yoğunluğunu veya nöbetle ilgili gen altı'nın veya diyelim ki altı'nın nöron yüzeyinde bulunup bulunmadığını ve nöron yüzeyinden içselleştirilip içselleştirilmediğini belirlemek için sayı ve boyut gibi Punta özniteliklerini kullanın. Kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronlarının çift renkli etiketlemesi bu videoda anlatıldığı gibi gerçekleştirildi.

Bu görüntüde etiketli hücre yüzeyi proteini camgöbeği ile gösterilmiştir ve içselleştirilmiş protein yeşil ile gösterilmiştir. Ok ucu ile gösterilen çift boyama, yalnızca antikor besleme inkübasyonu sırasında içselleştirilen proteinin endozomlarda lokalize olup olmadığını belirlemek için sağlıksız görünen bir hücrede gözlendi, erken geri dönüşüm endozom belirteci transferrin mCherry'yi eksprese eden nöronlar, dendritik çardağın bu bölgesinde gösterildiği gibi, penetrasyondan sonra immünograf boyandı, transferrin ile punktat boyamanın geniş bir örtüşmesi vardı, bu da içselleştirilmiş proteinin endozomlara lokalize olduğunu doğruladı. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücre yüzeyi ile içselleştirilmiş protein havuzlarını ayırt etmek için tek bir antikorun kullanılabilmesidir.