Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Aşağıdaki deneyin genel amacı, transkripsiyon faktörleri gibi DNA bağlayıcı proteinlerin bağlanmasını veya taş modifikasyonlarını tespit etmektir. Bu, önce kromatinin ikinci bir adım olarak hazırlanmasıyla elde edilir. İlgilenilen proteine bağlı DNA parçalarını aşağı çekmek için bir kromatin immünopresipitasyon reaksiyonu kurulur.

Daha sonra, ilgilenilen proteine bağlanan DNA fragmanı PCR ile amplifiye edilir. QPCR analizine dayalı olarak, ilgilenilen proteine bağlı DNA fragmanının, bağlanmamış bir bölgeye kıyasla kat olarak zenginleştiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, farklı modifiye edilmiş veya modifiye edilmemiş proteinlerin ne zaman ve nerede mevcut olduğu gibi transkripsiyon, kromatin ve epigenetik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

DNA üzerinde: Bu yöntem T hücresi gen regülasyonu hakkında fikir verebilir. B lenfositleri, lösemi örnekleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre dizileri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu deney için kromatin, fare dalağı naif CD dört T hücresinden hazırlanacaktır.

Bu işleme başlamak için, DMEM'deki CD dört T hücreli süspansiyona% 1'lik bir nihai konsantrasyona% 37 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hafifçe sallayın. Bu, DNA protein komplekslerini çapraz bağlayacaktır. 125 milimolar nihai konsantrasyona bir molar glisin ekleyerek çapraz bağlamayı durdurun.

Oda sıcaklığında beş dakika sallanmaya devam edin. Hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı çıkarın ve proteaz inhibitörleri içeren beş mililitre buz gibi soğuk PBS'de hücreleri yeniden süspanse edin, son yıkamadan sonra hücreleri bu şekilde toplam üç kez yıkayın, süpernatanı atın ve hücreleri proteaz inhibitörleri içeren bir mililitre buz gibi soğuk hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu 1.7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Çekirdekleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı dikkatlice atın, çekirdekleri 500 mikrolitre nükleer liziste yeniden süspanse edin.

Proteaz inhibitörleri içeren tampon buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir. Daha sonra, 1.6 milimetrelik bir prob ve 15 saniye boyunca dört sonikat çıkış seviyesi kullanarak hücreleri sonikleştirin. Aşırı ısınmayı önlemek için numuneyi bir ila iki dakika buz üzerinde soğutun ve 15 saniye boyunca tekrar sonikasyon yapın.

Sonikasyon ve soğutmayı toplam dört kez santrifüj için tekrarlayın, sonik kromatin 16.000 G'de beş dakika boyunca. Dört dört santigrat derecede. Berrak süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpünde toplayın.

20 mikrolitrelik bir berrak süpernatan alikotunu çıkarın. DNA yükleme boyası ekleyin ve sonikasyonlu DNA'yı% 2'lik bir agro jel ile elektroforez ile kontrol edin. Çoğu uygulama için ideal sonikasyonlu DNA boyutu 200 ila 500 baz çiftidir.

Son olarak, bir UV spektrofotometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. Kesilmiş kromatin, bir kromatin immünopresipitasyon reaksiyonu oluşturmak için hemen kullanılabilir veya kromatin immünopresipitasyonu için negatif 80 santigrat derecede saklanabilir veya çip seyreltik sonikated kromatini, proteaz inhibitörleri ile çip seyreltme tamponunda toplam iki mililitre hacimde mililitre başına beş ila 10 mikrogram DNA konsantrasyonuna kadar saklanabilir. Bu prosedürdeki tüm adımlar sıfır ila dört santigrat derece arasında gerçekleştirilmelidir.

Bu örnekte 200 mikrolitre olan% 10 tasarruf edin, seyreltilmiş sonikasyonlu kromatinin giriş deposu olarak, kalan numunenin buzunda 450 mikrolitre, izotip kontrolü ve ilgilenilen antikor olarak etiketlenmiş dört adet 1.7 mililitrelik mikro görüntüleme tüpünün her birine saklayın. Aynı izotipin birden fazla antikoru kullanılıyorsa, tek bir izotip kontrolü yeterli olacaktır Bu analizi gerçekleştirmek için, kullanılan antikorun özgüllüğüne veya ilgili tüplere izotip kontrolüne bağlı olarak iki ila beş mikrogram spesifik antikor ekleyin. Ertesi sabah kromatin antikor komplekslerinin oluşumuna izin vermek için tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede sallayın.

Her karışıma 25 mikrolitre protein G manyetik boncuk ekleyin ve dört santigrat derecede en az iki saat sallayın. Ardından, boncukların mıknatıslanmış tarafta toplanmasını sağlamak için füge tüplerini 15 ila 20 saniye manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden çözeltiyi aspirasyon ile dikkatlice çıkarın.

Bir mililitre düşük tuzlu yıkama solüsyonu ekleyin ve mutatör üzerinde beş dakika boyunca hafifçe sallayın. Manyetik standı kullanarak boncukları toplayın ve yıkama solüsyonunu çıkarın. Tekrar bir mililitre düşük tuzlu yıkama solüsyonu ekleyin ve beş dakika boyunca hafifçe sallayın.

Düşük tuzlu yıkama solüsyonunu çıkardıktan sonra, bir mililitre yüksek tuzlu yıkama solüsyonu ekleyin ve beş dakika boyunca sallayın. Manyetik standı kullanarak boncukları toplayın ve yıkama solüsyonunu çıkarın. Yıkamayı yüksek tuzlu yıkama solüsyonu ile tekrarlayın.

Yüksek tuzlu yıkama solüsyonunu çıkardıktan sonra, bir mililitre lityum klorür yıkama solüsyonu ekleyin ve beş dakika boyunca sallayın. Manyetik standı kullanarak boncukları toplayın ve yıkama solüsyonunu çıkarın. Lityum klorür yıkamasını bir kez tekrarlayın.

Bir mililitre TE çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca sallayın. Manyetik standı kullanarak boncukları toplayın ve yıkama solüsyonunu çıkarın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 mikrolitre elucian tampon kaya ekleyerek boncuklardan DNA'yı çıkarın.

EIT'yi pipetleyin ve bu malzemeyi yeni bir 1,7 milimetrelik füj tüpünde saklayın. Bir kez daha tekrarlayın ve her iki elu'yu birleştirin, çapraz bağlantıları tersine çevirmek için boncukları atın. Kaçan DNA'ya, 0.3 molar ve bir mikrolitre RNA'nın nihai konsantrasyonuna beş molar sodyum klorür ekleyin.

Daha önce kaydedilen girişlere 400 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Hacmi her girişe 500 mikrolitre yapmak için, 0.3 molar bir mikrolitre RNA'ya sodyum klorür, 10 mikrolitre 0.5 molar EDTA 20 mikrolitre bir molar tris, HCL pH 6.5 ve bir mikrolitre proteinaz K.Tüpleri kapatın ve ertesi sabah kuru bir ısıtma bloğunda 65 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin, Tüpleri oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Daha sonra bir mililitre %100 etanol ekleyin ve iki saat boyunca negatif 80 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.

DNA santrifüjünü çökeltmek için, tüpler 15 dakika boyunca 16.000 G'de. DNA yıkamasını peletlemek için, DNA peleti bir kez% 70 etanol ve havayla kurutulur, pelet yeniden askıya alınır, DNA peleti 100 mikrolitre otoklav damıtılmış su içinde yapılır, kano, hızlı döndürme kolonları kullanarak DNA'yı saflaştırın ve toplam 50 mikrolitre elüsyon tamponu hacminde elüte edin. Bu DNA artık PCR amplifikasyonu için kullanıma hazırdır.

Kontrole bağlı olmayan bir bölge üzerinde tam zenginleştirme elde etmek için QPCR rezervlerinin analizi, bu protokolün en önemli yönüdür. QPCR yazılımını kullanarak, düzenleyiciye gidin ve çeşitli seyreltmelerin giriş örneklerini içeren kuyucukları standart eğri değerleriyle işaretleyin. Ayrıca, kuyucukları tam olarak PCR plakasının yerleştirildiği gibi bilinmeyen çip örnekleriyle etiketleyin.

Bilinmeyen spesifik ve izotip numunelerindeki DNA miktarlarını enterpolasyon yapmak için standart bir eğrinin kullanılması, numunelerde bulunan konsantrasyon aralığı boyunca tüm primer setlerinin kalite ve verimliliğinin değerlendirilmesine ve eşleştirilmesine olanak tanır. Alt küme düzenleyicisine gidin ve giriş örneklerinin yanı sıra bilinmeyen çip örnekleri içeren kuyular da dahil olmak üzere alt kümeleri işaretleyin. Bilinmeyen numuneler, analiz için giriş numunelerinin bilinen konsantrasyonlarından oluşturulan standart eğri kullanılarak nicelleştirilecektir.

PCR amplifikasyonu tamamlandıktan sonra, analizi ABS quant ile gerçekleştirin. İkinci türev maks. Analiz için alt kümeyi seçin ve tuşuna basın. Tamam.

Giriş numunelerinin bilinen konsantrasyonlarını kullanarak standart eğriyi oluşturacak ve bilinmeyen numunelerde bulunan mutlak DNA miktarını gösterecek olan calculate'e basın, eğer DNA'nın kalitesi iyiyse ve primerler spesifik olarak hedeflenen bölgeye bağlanıyorsa, PCR verimliliği ikiye yakın olmalıdır. Varsa, aynı alt küme için TM çağrısı ile bir erime eğrisi analizi gerçekleştirin. Tek bir tepe noktası, yalnızca belirli bir ürünün yükseltildiğini gösterir.

Spesifik DNA'nın amplifikasyonu, bir AROS jeli aracılığıyla DNA merdiveni ile birlikte PCR ürününün elektro ile de test edilebilir. Elde edilen veriler daha sonra daha fazla analiz için Microsoft Excel'de açılabilen sekmeyle ayrılmış bir metin dosyası olarak dışa aktarılır. Spesifik antikor için DNA miktarını, hedeflenen primerler için izotip kontrolü ile bölün.

Kontrol bölgesi Primerleri için bu adımı tekrarlayın. Farklı immünoçökeltiler için aynı izotipe sahip birden fazla antikor kullanılıyorsa, bunların her birini aynı izotip kontrolünden gelen değerlerle normalleştirin. Ayrıca, birden fazla hedeflenen primer çifti kullanılıyorsa, her bir hedefin normalizasyonu için tek bir kontrol primer onarım setinden alınan DNA miktarları kullanılmalıdır.

Çıktı değerleri, spesifik olmayan antikora göre her bir konumda spesifik antikor immünopresipitasyon kat zenginleştirmesini temsil eder Arka plan immünopresipitasyonu, hedeflenen primerler için kat zenginleştirmesini kontrol bölgesi primerleri için kat zenginleştirme ile bölerek bir kontrol bağlanmamış bölgesine göre zenginleştirme elde eder. Daha da önemlisi, her bir numune için toplam girdi DNA'sı ile standart eğrilerin oluşturulması nedeniyle, standarttan enterpolasyonlu immünopresipitasyon değerlerinin her birinin zaten makine yazılımı tarafından toplam girdinin fraksiyonu olarak normalleştirildiğini ve ifade edildiğini unutmayın. Burada gösterilen kromatin immünopresipitasyon protokolü, genomun bağlanmamış bir bölgesini amplifiye eden ve böylece bir yükleme kontrolü görevi gören bir primer çiftinin kullanılması yoluyla PCR'de kullanılan DNA miktarındaki farklılıkları kontrol eder.

Bu örnekte, fare beta aktin geninin kodlama bölgesi, ilgilenilen proteine bağlı olmayan bir bölge olarak kullanıldı ve fare üzerindeki transkripsiyon faktörü ve yağ bağlanma bölgesi, IL iki promotörü hedef bölge olarak kullanıldı. Bir Excel elektronik tablosunun bu anlık görüntüsü, sarı, yeşil ve mor renkli kutulardaki üç deneysel tekrardan ve üç teknik kopyadan elde edilen analiz verilerinde açıklanan hesaplama protokolünün kullanımını gösterir. Her biri kat zenginleştirmesini hesaplamak için kullanıldı.

Genomun farklı bölgelerine bağlı bir proteinin nispi zenginleşmesi, aynı izotip kontrolü ve spesifik antikorlar seçilirse karşılaştırılabilir. Antikorun özgüllüğü iyiyse, tipik olarak bağlanmamış kontrol bölgesi üzerinde iki ila on kat zenginleştirme gözlenir. Bu şekil, farelerden izole edilen geleneksel CD dört T hücresi ve düzenleyici CD dört T hücresi ile yapılan bir çip deneyinin sonuçlarını göstermektedir.

Konvansiyonel T hücrelerinin küçük bir kısmı 30 dakika boyunca PMA ve iyon misin ile uyarıldı. IL iki promotöründe NFA transkripsiyon faktörlerinin, N yağ C bir ve NFA C ikisinin nispi zenginleşmesi gözlendi ve burada bu prosedürü takiben, bağlanmamış bir bölge üzerinde kat zenginleştirmesi olarak tasvir edildi. ChIP-seq gibi diğer yöntemler, bir uyarana yanıt olarak transkripsiyon faktörlerinin küresel doluluğunu veya epigenetik işaretlerdeki küresel değişiklikleri ele almak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, sınırlı sayıda hücre kullanarak kromatin immünopresipitasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalı ve kontrole bağlı olmayan bir bölgeye kıyasla transkripsiyon faktörü bantlamasını belirlemek için QPCI verilerini analiz etmelisiniz.