Name: Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinin motor nöronlara verimli farklılaşmasını. Bu yöntem, retinoik asit ve immunofloresan mikroskopi kullanarak motor nöron hastalıkları araştırmalarını ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu yazının May 26, 2011 tarihinde vefat Dr Wenlan Wang anısına adanmıştır. Biz cömertçe Bu çalışmada kullanılan HBG3 MES hücreler sağlamak için Dr Douglas A. Kerr teşekkür ederim. Bu çalışma Nemours tarafından finanse edildi, bir Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (NCRR) ve Merkezi desteklemek için NCRR bir Cobre hibe (5 P20 RR020173-05) INBRE program kapsamında hibe (2 RR016472-10) Çocuklar, Wilmington, Delaware, ABD için Alfred I. duPont Hastanesi Pediatrik Araştırma.

1. Adım 1: Fare Embriyonik Kök (MES) Hücre Kültürü (Zamanlama: 3 gün) 1. Kaplama birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF) <ol><li> PMEF yapışması için jelatin ile kaplayın dört adet 100 mm doku kültürü yemekleri. Her bir çanak% 0.1 jelatin çözeltisi (StemCell Technologies) 8 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yemeklerinden jelatin fazla çıkarın. Bulaşıkları durulama yapmayın. </li><li> Yaklaşık içeren Mitomisin C-inaktive PMEF (Millipore) bir şişe sulandırınız. 5 x 10 6 PMEF ortam 40 ml içine hücreleri (Tablo 1 &#39;de tarif bakınız) ve dört adet 100 mm&#39;lik doku kültürü plakası üzerine tabaklar. PMEF MES hücreleri için bir besleyici tabakası oluşturmak. </li><li> PMEF MES hücre kültürleri eklemeden önce en az bir gün kaplama edilmelidir. PMEF kaplama sonra 1 hafta kadar kullanılabilir. </li></ol> 2. Kaplama MES Hücreleri Motor nöronların içine MES hücre farklılaşmasının etkinliğini izlemekBiz HBG3, motor nöron özel yükseltici HB9 kontrolü altında eksprese EGFP bir transjenik fare elde edilen bir ES hücre hattı kullanılır. <ol><li> Defrost 37 ° C su banyosunda HBG3 MES hücrelerin 1 flakon (yaklaşık 1 x 10 7, Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından katkı). 15 ml tüp ES medya (Tablo 1 tarife bakınız) 5 ml ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 rpm&#39;de hücreleri aşağı spin. </li><li> 10 ng / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon taze olarak eklendi Lösemi inhibe edici faktör (LİF) ile ES ortam 20 ml süpernatan aspirat ve Pastör pipetiyle MES hücreleri. NOT: LİF kullanım gününde ilave edilmesi ve farklılaşmadan durumda MES hücreleri korumak için gereklidir. </li><li> Her yemekte PMEF 10 ml PMEF ortamı çıkarın ve her yemek için HBG3 ES hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin. </li><li> 24 saat sonra kaplama, MES hücre boyutu Şekil 1B ok ile gösterilen koloni benzer küçük koloniler oluştururlar. Kaplama sonrası 72 saat, koloniboyutu es artış, çok sayıda çapı yaklaşık 100 mikron (Şekil 1B, oklarla gösterilen) olmak. Bu hücrelerin farklılaşması için hazırız. Ortam hücrelerinin proliferasyon korumak için günlük değiştirilmesi gerekir. </li></ol> 2. Adım 2: Sinir İndüksiyon (Zamanlama: 2 gün) Motor nöron içinde MES hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek için, MES hücreleri PMEF ayrılmış ve bir süspansiyon bir ortamda yetiştirilir gerekir. Jelatin kaplı şişeler MES hücrelerinden PMEF ayırmak için kullanılır. <ol><li> MES koloniler nöral indüksiyon (farklılaşma gün 0 olarak tanımlanır), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin (18 ml / şişe) ile kat 2 T150 şişeler için hazır ve ardından aşırı jelatin kaldırmak ve 1x PBS üç kez yıkayın zaman. NOT: Her 100 mm çanak kültür PMEF ayırmak için bir T150-jelatin kaplı şişesi gerekir. </li><li> Dikkatle gevşek bağlı koloniler çıkarmak için değil emin, aspirasyon ortamı çıkarın. 10 ml PBS kısa eklely ve sonra yıkama adımı tamamlamak için aspirasyon kaldırın. </li><li> PMEF gelen MES hücreleri ayırmak için,% 0.25 eklemek tripsin / EDTA (3 ml / çanak, StemCell Teknolojileri) ve 37 &#39;de 3-5 dakika inkübe ° C kök hücre ve PMEF levhadan ayırmak kadar. Koloniler (15-20 kez) kırmak için aşağı LIF ve pipet hücreleri olmadan 15 ml taze ES medya ekleyin ve. Daha sonra, bir% 0.1 jelatin kaplı T150 şişesine ilave ve 37 C&#39;de 30 dakika inkübe ° C. ES hücrelerinin yüzen gerekirken inkübasyondan sonra, PMEF jelatinize yüzey eklemek gerekir. 50 ml&#39;lik bir tüp içine kayar MES hücreler toplanır. </li><li> (Tablo 1 tarife bakınız) Sinir Farklılaşma Orta 10 ml 800 rpm ve Pastör pipetiyle hücreleri aşağı Spin. </li><li> Bir 100 mm bakteriyel ya da süspansiyon kültürü çanağı üzerine bir hemasitometre ve ardından plaka yaklaşık 2 x 10 6 MES hücreleri kullanılarak hücreleri hesaplama. Bu plakalar süspansiyon kültürleri büyüme izin ve embriyoid organları (EBS) oluşumunu arttırabilir. </li><li> Differentia AçıkTION gün 1, MES hücrelerinin ışık mikroskobu altında görülebilen küçük kayan agrega (EBS) oluştururlar. Herhangi bir bulaşma, PMEF çanak eklemek. 3 dk için düşük hızda (500 rpm) 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve içine süspansiyon hücreleri ve medya transfer edin. Dikkatli medya aspire, yeni bir bakteriyel çanak plaka hücreleri daha sonra pelet EBS taze Sinir Farklılaşma Orta 10 ml ekleyin ve. Ortam ikmal ek olarak, bu adım adım önceden arta taşıyan herhangi bir PMEF kaldırır. </li><li> Farklılaşma Gün 2, EBS motor nöronlar indüklenen hazırdır. </li></ol> 3. Adım 3: Motor Nöron Özelliği (Zamanlama: 5 gün) <ol><li> Farklılaşma gün 2, girdap kültürü çanak ve 15 ml tüp içine medya ve EBS aktarmak Açık. EBS ağırlık (~ 10 dakika) ile ya da 3 dk için düşük hızda (500 rpm) santrifüje edilerek dinlendiriniz. </li><li> (Tarifi bkz. Motor Nöron Farklılaşma 10 ml (MSB) orta dikkatli ve Pastör pipetiyle EBS orta aspire <strong&gt; Tablo 1). Plaka yeni bir bakteriyel çanak EBS ve 5 gün boyunca günde ortamı değiştirmek. </li><li> Çapı 200 mikron ve kuvvetli GFP sinyali (Şekil 1C) ifade olmalıdır - farklılaşma 7. günde, EBS yaklaşık 150 olmalıdır. Bu EBS kaplı yemekleri veya lamelleri poly-DL-ornithine/laminin üzerine disosiye ve kaplama olmaya hazırız. </li></ol> 4. Adım 4: Poly-DL-ornithine/laminin Kaplı lameller hazırlanması (Zamanlama: 2 gün) İki gün EBS dissociating önce (farklılaşma 5. gününde yani), poly-DL-ornithine/laminin-coated lamelleri hazırlamak. <ol><li> 24-iyi plakanın altına yerleştirin 12 mm yuvarlak lamelleri (Warner Araçlar). 10X bir stok çözelti (1 mg / ml) elde etmek için 25 mg 25 ml&#39;de poli-DL-ornitin (Sigma-Aldrich), steril, çift damıtılmış su (d 2 H 2 O) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, konsantrasyonlarda elde etmek için d 2 H 2 O ile poli-DL-ornitin bir 1/10 dilüsyon yapmak100 mcg / ml oranı. Gece boyunca 4 at 24-kuyulu plakalı ve inkübe her bir yanı ° C ila 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Ertesi gün (farklılaşma günde 6), aspirat poli-DL-ornitin ve doku kültürü kaputu plakaları ve kuru kapak slipleri hava sağlar. D 2 H2O ile üç kez plakası kuyuları çalkalayın. Bir saat için hava kurumasını bekleyin. </li><li> 100X stok solüsyonu (200 ug / ml) yapmak için buzlu soğuk PBS 1X 5 ml içinde 1 mg fare laminin (Millipore) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, buzlu-soğuk 1X PBS (2 mcg laminin / ml) 1/100 dilüsyon olun. 0.5 mL / 4 iyi bir 24-iyi plaka ve inkübe ° C gece için. Tohum hücreleri önce, aşırı laminin kaldırılır ve kuyular 1X PBS iki defa durulanmalıdır. Lamelleri MSB&#39;nin ortamı (0.5 ml / oyuk) saklanabilir. </li></ol> 5.. Adım 5: Axon Uzama (Zamanlama: 2 gün) <ol><li> Farklılaşma Gün 7 günü, 15 ml tüp içine EBS toplamak ve EBS (yaklaşık 3 dakika) yerleşmesine izin. Aspirat ortam ve yeniden sPBS içinde uspend EBS. EBS yerleşmek ve sonra PBS aspire izin verin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, EBS üzere Accumax (Millipore) 1 ml ilave edilir. Sonra EBS kapsayan aşırı Accumax aspire. </li><li> EBS ayırmak için, MSB orta 3 ml ekleyin. EBS bozmak için 1 ml Eppendorf mikropipet (mavi uç) kullanarak pipet aşağı yukarı 20 kez. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre süzgecinden kap (BD Falcon) ile 12x75 mm tüp için hücre süspansiyonu aktarın. Tek hücrelerin verim zenginleştirmek şekilde filtre tarafından tutulan kalan topaklar ve hücreler ile ayrışma adımda tekrar edin. Nihai tek bir hücre süspansiyonu 6 ml olacaktır. </li><li> Yavaşça bu tek hücre süspansiyonu karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 2x10 ml başına 5 bir hücre yoğunluğuna MND ortamı (10, her BDNF ng / ml, GDNF, CNTF ve NT-3 ile desteklenmiş) içine hücreleri ile seyreltilir. Po içeren 24 kuyucuklu plaklar hücre süspansiyonu (0.5 ml / oyuk) ekleyinly-DL-ornithine/laminin kaplamalı lamelleri (yukarıda tarif edildiği gibi, daha önce hazırlanmış). Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün (Şekil 1D) sonra uzun neurites uzatmak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A protokolünün bir taslağını göstermektedir. 1. adımda, MES hücreleri PMEF üzerinde yetiştiriliyor ve spontan farklılaşmasını önlemek için LIF ile desteklenmiş. Genel olarak, farklılaşmamış MES koloniler yuvarlak ve kompakt olup, kenarları açıkça tanımlamıştır. Koloniler birbiri ile temas halinde değildir. Tipik olarak, MES hücrelerin her 2 ~ 3 gün 1:04 oranında bölünmüş olmalıdır. Ancak, her bir hücre hattı farklı bir oranda artacak ve split oranı ampirik olarak tespit edilmelidir. Şekil 1B oklar 3 gün için bir PMEF besleyici tabakaya kültürleme sonra MES hücrelerinin tipik görünüşünü göstermektedir. Bu koloniler büyük (çapı 50-100 mikron) ama yine yuvarlak ve tanımlanmış avantajı sağlamaks. Bu aşamada koloniler farklılaşma ya da alt kültür için hazırız. Şekil 1B bir ok ucu, genellikle kaplama 24 saat sonra bulduğu küçük bir MES koloni gösterir. Kaplama dört gün sonra, MES hücreleri büyümüş olur. Onlar ayrım başlıyor belirten düzleştirilmiş bir görünüm ve tanımlanan sınırlar kaybı gösterir. Böyle hücreler, nöronal hücre içine farklılaşma için optimal değildir. Motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için, MES hücreleri EB oluşumuna izin süspansiyon koşullarda yetiştirilen gerekir. Adım 2&#39;de, ES hücreleri EB oluşumunu teşvik etmek için bir besleyici tabakası olmadan bir kültür yüzey üzerine aktarılmaktadır. Bu adımda, bunlar bir sinir soyu için doğrudan hücrelere 2 gün süreyle Noggin, bFGF ve FGF-8 ile desteklenmiş Neural Farklılaştırma besiyerinde enkübe edilir. Küçük EBS farklılaşma 1. günde mikroskop altında görülebilir. Bunlar, orta yüzen edilmelidir. Bulaşma PMEF da gün 1 adresinde bulunabilirdiferansiyasyonun ve çıkarılması gerekir. Bu hücreler EBS yeni bir bakteriyel bir çanakla pasajlanmağa çok zaman ortadan kalkar bakteriyel yemekler uygun. Böylece, farklılaşma günde 2 tarafından, az ya da hiç PMEF kültürü tabağına görülmelidir. 3. adımda, yeni yemekler için EBS transferi kalan PMEF çıkarılmasını sağlamalıdır devam etti. EBS RA ile takviye Motor Nöron Farklılaşma (MSB) medya kültürü ve motor nöronların içine hücreleri ayırt etmek için 5 gün boyunca SAG edilir. Kültür sırasında, EBS boyutları büyümeye devam ediyor ve farklılaşma 3. günde çıplak gözle görülebilir ~ 4. Şekil 1C farklılaşma 7. günde EBS mikroskobik görünüm gösterir. Farklılaşmamış hücrelerin aksine, EBS GFP ekspresyonu nedeniyle güçlü floresans gösterir. Bu EBS optimal farklılaşmış ve ayrışma için hazırız. Akış sitometrisi% 51 ± ayrışmış EBS gelen hücreler% 0.8 &#39;i ifade eden hücrelerin 5 GFP ayrışmıştır olduğunu gösterdi. Adım 5, inci kültürdeGDNF, CNTF, BDNF, ve uzun akson uzantısı projeksiyonlar NT3 sonuçlar varlığında ese motor nöron. Şekil 1B 2 gün ayrışmış EBS&#39;nin sonra kaplama farklılaşmış hücreler görünümünü gösterir. Kaplamalı hücrelerin hücre gövdeleri uzanan uzun neurites not edin. Immünofloresan boyama GFP + hücrelerin pan-nöronal marker (nörofilaman-orta zincirli) ve iki motor nöron spesifik belirteçler, (Islet-1 ve kolin asetiltransferaz, Şekil 2) ifade gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Şekil 1. Motor nöronları (resim Wu ve ark güncellenmiştir. 5) MES hücrelerin Farklılaşma. MES hücrelerinden motor nöron için farklılaşma protokolünün A) şeması. B) ayrım MES hücreler fibroblast besleyici tabakasının üstünde yuvarlak koloniler oluştururlar. Onlar zayıf GFP var. C) MES hücreleri besleyici ve katmanlar ayrıldı kültürlerdekiEBS oluşturmak için düşük eki yemekler kırmızı. Farklılaştırma prosesi ilk iki gün boyunca, hücreler 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml FGF-8 maruz bırakıldı. Daha sonra, onlar 1 uM retinoik asit ve 5 gün süreyle 1 uM sonik kirpi agonisti SAG ile ayırt etmek için oluşturuldu. Farklılaştırılmış MES hücreleri güçlü GFP floresan dile getirdi. D)-7 gün sonra farklılaşma, EBS poly-DL-ornithine/laminin kaplı levhalar üzerine ekildi ve ayrıştırıldı. Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün sonra uzun nöral süreçleri uzatıldı. Ölçek çubuğu = 200 mikron. MN = motor nöron. B, C ve D parlak bir alan görüntüler ve B &#39;, C&#39; ve D &#39;ilgili floresans görüntülerdir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Şekil 2,. MES hücresinden türetilmiş motor nöron karakterizasyonu. Nörofilaman orta zincirli (NF-M, kırmızı), ChAT (kırmızı) ve Islet-1 (kırmızı) immünofloresan boyaması GFP (yeşil) ifade tesadüf olduession. DAPI (mavi) çekirdekleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 um.

<ol><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li>
<li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li>
<li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li>
<li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25(2011).</li>
<li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li>
<li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li>
<li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li>
<li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

MES hücrelerinin kalitesi motor nöron verimli bir kuşak için en önemli bir parametredir. MES hücreler spontan farklılaşmasını önlemek için PMEF yetişen gerekir. LIF eklenmesi farklılaşmadan devlet MES hücrelerin korunmasına yardımcı olur. MES hücreler her 12-15 saat, bölme olarak kültür ortamı hızla tüketilmiş hale gelir ve günlük olarak değiştirilmesi gerekir. Şşş yolunun Verimli aktivasyonu motor nöron özellikleri ikna etmek için gereken kritik bir parametredir. Şşş protein (Ar-Ge Sistemi)...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Hücre-Nitelikli FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Nükleosidlerin </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinir Farklılaşma orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 06905 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Mono-tiyo gliserol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Kafa </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (farklılaşma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Retinoik Asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (Motor Nöron kültürü) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 1. MES hücre kültürü veya farklılaşma için PMEF ve Medya. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;reaktifin strong&gt; Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Jelatin% 0.1 </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> D 0.1 mg / ml 2 H2O </td></tr><tr><td> Fare laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 mcg / ml PBS </td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin / EDTA </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 2. Kaplama ve ayrışma için Reaktifler.

motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücre verimli farklılaşma

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Fonksiyonel motor nöronların embriyonik kök (ES) hücreleri doğrudan farklılaşma, hastalık mekanizmaları incelemek için yeni ilaç bileşikleri taranması ve bu spinal müsküler atrofi (SMA) ve Amyotrofik lateral skleroz (gibi motor nöron hastalıkları için yeni tedaviler geliştirmek için bir umut kaynağı temsil ALS). Birçok mevcut protokoller motor nöronların 1-4 içine fare embriyonik kök (MES) hücreleri ayırt etmek için retinoik asit (RA) ve sonik kirpi (Sus) bir arada kullanabilirsiniz. Ancak, motor nöronların içine MES hücrelerin farklılaşması verimliliği sadece ılımlı bir başarı ile bir araya geldi. Şu anda önemli ölçüde standart prosedürlere göre farklılaşma etkinliğini arttırır iki adımlı bir farklılaşma protokolü 5 gelişmiştir. Birinci adımda Noggin ve fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ekleyerek neuralization işlemi arttırmaktır. Noggin bir kemik morfogenetik protein (BMP) antagonistidir ve nöral indüksiyon karışmış birnöron ve ön sinirsel desenlendirme 6 oluşumunda sonuçların varsayılan modeline ccording. FGF sinyal posterior nöral kimlik 7-9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep olarak Noggin ile sinerjik olarak hareket eder. Bu adımda, MES hücre soyları sinirsel doğru farklılaşmasını teşvik etmek için, iki gün süre ile Noggin, bFGF ve FGF-8 ile astarlanmış edildi. İkinci aşamada, motor nöron özellikleri elde edilmesini sağlanmaktadır. Noggin / MES hücreleri maruz FGFs motor nöron üretimi kolaylaştırmak için başka bir 5 gün süreyle RA ve bir Shh agonisti, düzeltilir agonisti (SAG) ile inkübe edildi. Motor nöron içinde MESS farklılaşma izlemek için, motor nöron özel yükseltici HB9 1 kontrolü altında, bir transjenik farenin ifade EGFP türetilmiş bir ES hücre dizisi kullanılabilir. Bu sağlam protokolü kullanarak, ± farklılaşma verimliliği% 0.8 51 elde (n = 3, p &lt;0.01, Student t-testi) 5. Immünofloresan elde edilen sonuçlar,boyama GFP + hücrelerin motor nöron spesifik belirteçler, Islet-1 ve asetil kolin (ChAT) olduğunu göstermiştir. Bizim iki adım farklılaşma protokolü spinal motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için etkili bir yol sağlar.

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Embriyonik kök (EK) hücrelerin fonksiyonel motor nöronlara doğrudan farklılaştırılması, hastalık mekanizmalarını incelemek ve tarama yapmak için gelecek vadeden bir kaynak teşkil etmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara farklılaştırmaktır. İlk olarak fare embriyonik kök hücrelerini, primer fare embriyonik fibroblastları üzerinde kültüre edin ve lösemi inhibitör faktörü ile destekleyin. Ardından noggin, BFG F ve FGF sekiz ekleyerek nöralizasyon sürecini geliştirin; ardından retinoik asit ve smoothened agonisti ile inkübasyon yaparak motor nöron spesifikasyonunu indükleyin ve bu işlemi akson uzaması ile motor nöron maturasyonu ile takip edin.Son olarak, güçlü GFP floresansı gösteren diferansiye olmuş MES hücrelerini incelemek için immünofloresan mikroskopi kullanın. Büyük miktarlarda motor nöron üretimi, mevcut protokollerle karşılaştırıldığında motor nöron hastalıkları üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmıştır. Fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara diferansiye etmenin bu yaklaşımı daha verimlidir. Bu yöntem, spinal müsküler atrofi hakkında bilgi sağlayabilir.Bu yöntem, amyotrofik lateral skleroz gibi diğer motor nöron hastalıklarına da uygulanabilir. Primer embriyonik fare fibroblastlarını ekmek için, dört adet 100 milimetrelik doku kültürü kabını sekiz mililitre %0,1'lik jelatin çözeltisi ile kaplayın. Oda s

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz küçük bir molekül tabanlı oligodendrosit öncü hücreler (OPC) içine fare embriyonik kök hücreleri farklılaşma için protokol açıklar. Bu protokol, 30 gün farklılaşma, yüksek verimlilik ile Olig2 + NG2 + OPC üretir. Ayrıca, aksiyon potansiyelleri ateş "spike" OPC oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC'ler) nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) in vitro olarak üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. mESC'ler, embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra yapışık bir kültürde retinoik asit tedavisi yoluyla NPC'lere farklılaşmaya yönlendirilir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, omurilik nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) motor nöronlara ayırmak için bir yöntem gösterilmektedir. NPC'lerin olgun motor nöronlara farklılaşmasını kolaylaştırmayı amaçlayan spesifik inhibitörlerle zenginleştirilmiş özel ortam kullanılarak kaplanmış bir kültür plakası üzerinde NPC'lerin kültürleme sürecini detaylandırır.

Omurilik Nöral Progenitör Hücrelerinin Motor Nöronlara Farklılaşması

Bu video, işleyen sinapslara sahip ağa bağlı bir nöron popülasyonuna embriyonik kök hücre farklılaşması için bir tekniği göstermektedir. Embriyonik kök hücrenin nöronlara farklılaşması, nöronal ağ oluşumunun indüklenmesi ve kültürün ağa bağlı nöronlarla zenginleştirilmesi ile ilgili aşamaları ana hatlarıyla belirtir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

Bu video, insan iPSC'lerini motor nöronlara ayırma sürecini göstermektedir. Gerekçe, belirli transkripsiyon faktörlerini ifade etmek için genetik olarak değiştirilmiş iPSC'lerin kullanılmasını içerir. Doksisiklin içeren bir ortamda kültürlendiğinde, bu antibiyotik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu tetikler, böylece motor nöron progenitörlerine iPSC farklılaşmasını teşvik eder. Nihayetinde, progenitörler, olgun ve işlevsel motor nöronlar elde etmek için nöronal bir ortamda kültürlenir.

Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Fonksiyonel Motor Nöronlara Farklılaşması

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinin motor nöronlara verimli farklılaşmasını. Bu yöntem, retinoik asit ve immunofloresan mikroskopi kullanarak motor nöron hastalıkları araştırmalarını ilerletir.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Daha fazla video keşfet