Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara farklılaştırmaktır. İlk kültür faresi, birincil fare embriyonik fibroblastları üzerinde embriyonik kök hücreler ve lösemi inhibitör faktör ile takviye. Daha sonra, noggin BFG F ve FGF sekizini ekleyerek normalizasyon sürecini geliştirin, retinoik asit ve düzleştirilmiş agonist ile inkübasyon yoluyla motor nöron spesifikasyonunu indükler, ardından akson uzaması ve motor nöron olgunlaşması gelir.

Son olarak, güçlü GFP floresan ifade eden farklılaşmış MES hücrelerini incelemek için immünofloresan mikroskobu kullanın Büyük miktarlarda motor nöron üretmek, mevcut protokollere kıyasla motor nöron hastalıklarında araştırmayı kolaylaştırdı. Fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara ayırmaya yönelik bu yaklaşım daha etkilidir. Bu yöntem, spinal müsküler atrofi hakkında bilgi sağlayabilir.

Amyotrofik lateral skleroz gibi diğer motor nöron hastalıklarına da uygulanabilir: Primer embriyonik fare fibroblastlarını kaplamak için dört, 100 milimetrelik doku kültürü kaplarını sekiz mililitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplar. Oda sıcaklığında 30 dakika bekledikten sonra fazla sıvıyı atın. Şimdi aktive edilmiş PMEF'de bir şişe mitomisin C'yi dört plaka üzerine 40 mililitre PMEF ortam plakasına seyreltin ve bir haftaya kadar kültürleyin.

Daha sonra, 37 derecelik bir su banyosunda bir MES hücresi şişesinin buzunu çözün. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte beş mililitre E ES ortamı ile yıkayın. Beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjledikten sonra.

Süpernatanı aspire edin ve MES hücrelerini yeni eklenmiş lösemi inhibitör faktörü ile 20 mililitre ES ortamında yeniden süspanse edin. PMEF kültürlerinden 10 mililitre ortamı çıkarmaya devam edin ve 10 mililitre HBG üç ES hücre süspansiyonu ile değiştirin. MES hücrelerinin zaman içinde 24 saat sonra küçük kolonilerden, kaplamadan 72 saat sonra yaklaşık 100 mikrometre çapındaki kolonilere ilerlemesini izleyin.

MES hücrelerinin indüksiyonu için hücrelerin proliferasyonunu sürdürmek için ortamı günlük olarak değiştirin. Motor nöronlara farklılaşma. Fare embriyonik kök hücreleri önce PMEF besleyici hücrelerden ayrılmalı ve daha sonra indüksiyon gününde bir süspansiyon ortamında yetiştirilmelidir.

Her 100 milimetrelik ES kültürü için,% 0.1 jelatin ile kaplanmış bir T 50 şişe hazırlayın Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, fazla jelatini çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Gevşek bir şekilde bağlanmış kolonileri yerinden çıkarmamaya dikkat ederek medyayı ES kültüründen dikkatlice aspire etmeye devam edin. Sonra bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın.

Şimdi MES hücrelerini PMEF'ten ayırmak için, üç mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin ve üç ila beş dakika inkübe edin. 37 santigrat derecede, kök hücrelerin ve PMEF'in plakadan ayrıldığını doğrulayın. Ardından 15 mililitre taze ES besiyeri ekleyin ve pipetleyerek kolonileri parçalayın.

Hücre süspansiyonunu, PFS'nin jelatinleştirilmiş yüzeye yapışması için hazırlanan jelatin kaplı T one 50 şişe inkübatına 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Şimdi yüzen MES hücrelerini 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve santrifüjleme yoluyla peletleyin. Hücreleri 10 mililitre nöral farklılaşmada yeniden süspanse edin.

Bir hemo sitometre kullanarak orta numaralandırın ve daha sonra farklılaşma üzerine 100 milimetrelik bir süspansiyon kültür kabı üzerine plakalayın. Birinci gün, MES hücrelerinin embriyonik cisimler adı verilen küçük yüzen agregalar oluşturduğunu mikroskopi ile doğrulayın. Tabağa takılan herhangi bir PMEF taşındığından, ES süspansiyon hücrelerini ve ortamını 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından üç dakika boyunca 500 RPM'de santrifüjleyin.

Embriyonik cisimleri aspire etmek için, peletlenmiş ebs'ye dikkatlice 10 mililitre taze nöral farklılaşma, orta ekleyin ve ardından farklılaşma üzerine 24 saat boyunca hücreleri yeni bir bakteri tabağı kültüründe plakalayın. İkinci gün, kültür kabını döndürün ve ortamı ve EBS'yi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. EBS'nin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin, daha sonra ortamı dikkatlice aspire edin ve EBS'yi ve 10 mililitre motor nöron farklılaşmasını askıya alın.

Orta kültür EBS, farklılaşma üzerine beş gün boyunca yeni bir bakteri kabında. Yedinci gün, EBS'nin çapının yaklaşık 150 ila 200 mikrometre olduğunu doğrulayın ve farklılaşma konusunda güçlü GFP sinyalleri ifade edin. Beşinci gün, EBS'yi ayırmadan iki gün önce, 24 oyuklu bir plakanın altına 12 milimetre yuvarlak kapak fişleri yerleştirin.

Daha sonra mililitre başına 0,5 mililitre 100 mikrogram, poli DL ornitin ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Poli DL ornitin havayla kuruyan plakaları aspire edin ve bir doku kültürü başlığında fişleri kapatın. Plaka kuyularını üç kez çift damıtılmış su ile durulayın.

Kapak kızaklarını kaplamak için havanın kurumasını bekleyin. Beş mililitre buzlu soğuk bir XPBS'de mililitre fare laminini başına iki mikrogramlık taze bir seyreltme yapın. Oyuk başına 0,5 mililitre ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Farklılaşma üzerine PBS ile iki kez yıkayın. Yedinci gün, EBS'yi 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve EBS'nin yerçekimi ile çökelmesine izin verin. PBS ile dört yıkamadan sonra, EBS'ye bir mililitre ACU max ekleyin, hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, ardından ebs'yi kaplayan fazla ACU max'ı aspire edin.

Şimdi üç mililitre MND ortamı ekleyin ve bir mililitrelik einor mikro pipet kullanarak yaklaşık 20 kez pipetleyerek EBS'yi ayrıştırın, ardından oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, hücre süspansiyonunu bir hücre eğitici kapağından 12 x 75 milimetrelik bir tüpe geçirin. Bu ayrışma adımını, altı mililitrelik son tek hücre süspansiyonunda tek hücrelerin verimini zenginleştirmek için filtre tarafından tutulan kalan kümeler ve hücrelerle tekrarlayın. Tek hücreli süspansiyonu nazikçe karıştırın ve bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın, hücreleri tam MND ortamına seyreltin, mililitre plaka başına iki kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğuna getirin.

Poli DL ornitin laminin kaplı örtü fişleri içeren hazırlanan 24 oyuklu plakanın oyuklu başına 0.5 mililitre hücre süspansiyonu. Farklılaşmış hücreler iki gün sonra uzun nöritleri uzatır. Kültürde, HBG üç, tanımlanmış bir farklılaşma protokolüne sahip bir motor nöron spesifik promotör HB dokuz'un kontrolü altında EGFP'yi eksprese eden transgenik bir fareden türetilen bir ES hücre hattıdır.

MES hücreleri, motor nöronları türetmek için kullanılabilir. Farklılaşmamış MES hücreleri, bir fiberblast besleyici tabakasının üstünde yuvarlak koloniler oluşturur. Zayıf GFP ifadelerine sahiptirler.

Bu MES hücreleri, besleyici katmanlardan ayrıldı ve embriyonik cisimler oluşturmak için düşük bağlanma kapları üzerinde kültürlendi. Diferansiye MES hücreleri, yedinci günden sonra güçlü GFP floresan ifade etti. Diferansiyasyon EBS ayrıştırıldı ve poli DL ornitin laminin kaplı plakalar üzerine kaplandı.

Farklılaşmış hücreler, kültürde iki gün sonra kaplanmış hücrelerin hücre gövdelerinden uzun nöritleri uzatır, MES hücresinden türetilmiş motor nöronlar, immünofloresan boyama ile karakterize edilebilir. Bu GFP pozitif hücreler, pan nöronal belirteç nörofilamenti ve iki motor nöron spesifik belirteci eksprese eder. Göz kapağı bir ve kolin asetil transferaz DPI birlikte alınan çekirdekleri boyar.

İki aşamalı farklılaşma protokolümüz, MES hücrelerini spinal motor nöronlara ayırmak için etkili bir yol sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, fare embriyonik kök hücrelerini motor nöronlara nasıl verimli bir şekilde ayırt edeceğinizi anlamış olmalısınız. Sonuç olarak, fare embriyonik kök hücrelerinin yüksek kalitelerinin, motor nöronların verimli bir şekilde üretilmesi için en kritik parametre olduğunu unutmayın.