Name: RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNAlar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Öğrenin, hücre ekstraktlarından ribonükleoprotein komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanması için RIP-Chip yöntemini. RNA bağlayıcı proteinlerin mRNA hedeflerini belirleyerek transkripsiyon sonrası gen regülasyonunu anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Savunma Bakanlığı (Fikir Ödülü W81XWH-07-0406) - Ulus Atasoy için NIH RO1 A1080870 - Ulus Atasoy için NIH R21 A1079341 - Ulus Atasoy için Missouri Kurumsal Fonlar Üniversitesi - Ulus Atasoy için

Deney hazırlığı Deney başlamadan önce, tüm reaktiflerin, kapların ve gereçlerin RNaz ücretsiz sahip olmak önemlidir. DEPC-işlenmiş su ile çalkalayın RNaz inhibitörü (RNaseZAP, Ambion) ile cam davranın. Tüm reaktifler RNaz ücretsiz olarak teyit emin olun. 1. MRNP Lizat hazırlayın <ol><li> Büyümek ve her RIP için toplam protein 2-5 mg arasında üretmek katlanarak büyüyen doku hücreleri hasat. <ol class="lalpha"><li> İki P150 kültür kabı genellikle yeterlidir. </li><li> Her RBP araştırılmaktadır için, toplam hücresel sayısı ve protein miktarlarının uygun hedef mRNA ve RBP etkileşimlerini maksimize etmek için optimize edilmelidir. </li><li> QRT-PCR analizi için RIP, özellikle Hur, AUF1, TIAR gibi yüksek bolluk RBPs için kendi amplifikasyon ve tespit yöntemi nedeniyle daha az hücre lisatı (yaklaşık 400 mg toplam protein) gerektirebilir. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> 4 8-10 dakika ° C, 200 x g&#39;de santrifüj yoluyla topak hücreleri daha sonra, buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, yavaşça RNaz ve proteaz inhibitörleri ile hazırlanmış polysome lizis tamponu (PLB) eşit hacimlerde tüpün alt ve tekrar süspansiyon hücre pelletini fiske. <ol class="lalpha"><li> Bu hücre pelet tesisinin hacmini ölçmek için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Hücre kümeleri parçalayın ve 5 dakika buz üzerinde lizat inkübe yavaşça pipeti karışımı (vorteks yok). </li><li> 4. 20 dakika boyunca 13.000 xg&#39;de Santrifüj ° C enkaz lizat temizleyin. </li><li> Hemen ön soğutulmuş mikrofuge&#39;de tüp supernatant temizlenir aktarın. </li><li> -80 Buz ve deposunda tutun ° C. <ol class="lalpha"><li> Hemen dondurma hücrelerin uygun lizis tamamlar ve istenmeyen bağlayıcı önler. RIP hemen aşağıdaki örnek çözülme ile devam edin ve RNA bozulmasını önlemek için buz üzerinde örnekleri tutmak. &lt;/ Li&gt; <li> Bu lizat -80 altı ay boyunca saklanabilir ° C Bu protein ve / veya mRNA bozulması neden olabilir gibi tekrarlanan donma çözülme döngüleri kaçının. </li></ol></li><li> Standart Bradford Protein testi kullanılarak lizat protein konsantrasyonu ölçmek. </li></ol> 2. Antikor ve Yıkama ile kaplayın Protein A Sepharose Boncuk <ol><li> % 5 BSA ile NT2 tamponu (3-4 cilt) gecede Pre-kabarma protein A Sepharose (PAS) boncuk. 4 ° C&#39;de depolayın <ol class="lalpha"><li> 4 azından birkaç ay kadar uzun süreli depolama ° C% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş zaman mümkündür. </li><li> Protein Sefaroz boncukları hedef RBP antikor izotipi göre seçilmelidir. Proteinler A, G, A / G tüm spesifik izotip hedefleri var ve hedef benzeşim değişir. Protein A Sepharose boncuk Hur protein antikor izotip özgünlüğü için ve afinite göre kullanılmıştır. </li></ol></li><li> Kullanmadan önce, bu yüzden, aşırı NT2 tampon kaldırmaktampon oranı nihai boncuk 1:1 dir ki. </li><li> 1.5 ml RNAse ücretsiz mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, PAS bulamaç 100 ul kaldırmak ve her IP reaksiyonu (örneğin, belirli RBP ve izotip kontrol) için antikor 30 mikrogram ekleyin. </li><li> Antikor boncuk karışımı NT2 tampon 100-200 ul ekleyin. <ol class="lalpha"><li> Karışım 4 birkaç hafta saklanabilir ° C% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş zaman. </li><li> Aynı türden bir izotip-eşleştirilmiş antikor ya da bütün serumu arka plan RNA karşı bir antikorun kontrol olarak paralel olarak kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> Boncuk karışımı uygun antikor ekleyin ve 4 ucuna sonuna yuvarlanan, gece inkübe ° C <ol class="lalpha"><li> (Antikor 1, 5, 10 veya 30 mg genellikle yeterlidir) araştırılmaktadır spesifik protein antikor titresi optimize edin. </li></ol></li><li> 1 ml yıkama ile, kullanımdan hemen önce, antikor-kaplı boncukların hazırlanmasıbuz NT2 tampon 5 kez. <ol class="lalpha"><li> 4 az 1-2 dakika ° C için 13.000 x g&#39;de santrifüj ile Boncuk karışımı yıkayın </li><li> Dikkatlice elle pipet veya aspiratör ile süpernatantından maksimum miktarda kaldırmak ancak pelet bozmamak için dikkatli olun. </li><li> Yıkama antikor karışımı ile ilişkisiz antikor gibi, RNaz kirletici maddeleri temizlenmesine yardımcı olur. </li></ol></li><li> Bir kez son yıkama işleminden sonra, 100 mM, 40 U / ml &#39;den, 10 ul az RNaz 10 ul dışarı dahil olmak üzere, hedef mRNA korumak için çeşitli RNaz inhibitörleri ile muamele, ardından buzda soğutulmuş tampon NT2, 700 ul içinde tekrar süspansiyon boncuk DTT ve 15 ul EDTA (15 mM). NT2 tamponu ile 1.000 ul hacim getir. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl Ribonükleozit kompleksleri EDTA inhibitör etkisine bağlı olarak kullanılmaz. </li></ol></li></ol> 3. Immünopresipitasyon ve RNA Yağış <ol><li> İsteğe Preclear Adım:<ol class="lalpha"><li> Arka planı azaltmak için, boncuk ve kontrol antikoru ön berrak lisatı için kullanılabilir. Bu, çıkış sinyal azaltabilir. </li><li> Bu adım mikrodizi ardından IP yaparken arka planı azaltmak için gerekli olabilir. Genellikle qRT-PCR tarafından takip IP için gerekli değildir. </li><li> Preclear 30 dk / 4 ucuna ° C yuvarlanan sonu için izotip kontrol 15 mikrogram ile. </li><li> Adım 2.1 &#39;dan antikor ile kaplı olmayan preswollen PAS boncuklar 50 ul ekle. </li><li> Ucu üzerinde 30 dak / 4 ° C rotasyon sonu ile inkübe </li><li> 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin IP için süpernatant kaydedin. </li></ol></li><li> Hazırlanan antikor karışımı izole temizlenir lizat (yaklaşık 2-5 mg) 100 ul ekleyin. <ol class="lalpha"><li> Lizat Sulandırma arka plan ve nonspesifik bağlayıcı azaltmaya yardımcı olacaktır. </li><li> Lisatı giriş miktarı tespit yöntemi ve RBP o bolluğu bağlı olarak değişebilirRBP antikor r verimliliği gibi adım 1.1.c. belirtildiği </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) hemen yavaşça 4 10.000 xg&#39;de kısa santrifüj izledi birkaç kez hafifçe vurarak tüpü karıştırın ° C pelet boncuk ve derhal standart RNA izolasyonu teknikleri kullanarak qPCR analizi için toplam giriş mRNA temsili olarak süpernatant 100 ul çıkarın. <ol class="lalpha"><li> Bu adım, o giriş lizat RNA IP için en iyi olduğunu ve sadece bir onay adımı olarak veya kötü RNA sonuçları RIP sonrasında bir sorun giderme adımı olarak yapılmalıdır onaylamak içindir. </li></ol></li><li> Parafilm içinde Wrap tüpün ucuna sonuna yuvarlanan, 2 ila 4 saat boyunca 4 de sızdırmazlık ve inkübe ° C sağlamak. <ol class="lalpha"><li> Inkübasyon Zamanlama hedef bereket göre optimize edilmeli ve karmaşık düzenini veya bozulmasını önlemek için minimize edilmelidir. Bazı RBPs için kısa inkübasyonlar daha uygun olabilir. </li></ol></li><li> 5.000 xgf at Pelet boncukveya 5 dakika 4 ° C ve Western blot ile potansiyel analizi için süpernatant kaydedin. -80 Mağaza alikotları ° C <ol class="lalpha"><li> Kalıntı hedef proteinin yüksek miktarlarda yüzey maddesinin alikotları Sepharose boncuklar bir çökeltisi ile proteinin bir hata göstergesi olabilir. </li></ol></li><li> Daha önce anlatıldığı gibi, buz gibi soğuk tampon NT2 ve santrifüjleme 1 ml gomalaklar, 5 kez yıkayın (4, 5 dakika boyunca 5,000 x g ° C) sonra el pipet ya da bir aspiratör ile süpernatant çıkarın. <ol class="lalpha"><li> Daha sıkı yıkama yöntemleri sodyum deoksikolatın, üre ya da SDS ile NT2 tamponu ilave etmek suretiyle arka planı azaltmak için de kullanılabilir. </li><li> Buz mümkün olduğunca ilgili örnekler tutun ve hedef mRNA yıkımı en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışıyoruz. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: Western blot analizi kullanılarak hedef proteinin etkinliğini kontrol etmek için IP boncuk karışımı, küçük bir kısım (% 10) tasarruf veya paralel olarak ilave numune çalıştırın.</li></ol> 4. DNaz ve Proteinaz K Tedaviler <ol><li> Yıkamadan sonra, NT2 tampon 100 ul ile tekrar süspansiyon boncuk RNase içermeyen DNase 1 (2 U / ul) 5 ul ile desteklenmiştir. </li><li> 5-10 dakika süreyle 37 ° C&#39;de saklayın. NT2 tampon 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5,000 x g de santrifüjlenir. <ol class="lalpha"><li> Boncuklar bir küçük (~% 10) kısım SDS-PAGE analizi ile IP etkinliğini kontrol etmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> 100 ul tampon NT2, 5 ul proteinaz K (10 mg / ml) ve 1 ul% 10 SDS içinde yeniden süspanse PAS pelet. </li><li> Nazikçe her 10 dakikada flicking, 55 ° C su banyosu içinde 30 dakika boyunca yeniden süspanse boncuk karışımı inkübe edin. <ol class="lalpha"><li> Proteinaz K RNP bileşenlerinin serbest yardımcı olacaktır. </li></ol></li><li> 5 oda sıcaklığında (RT) dk ve süpernatant (~ 100 ul) toplamak için 5000 xg&#39;de Pelet boncuk. </li><li> Boncuk 200 ul NT2 tampon, santrifüj ekleOda sıcaklığında 2 dakika için 5000 x g&#39;da füg, süpernatant (~ 200 ul) eklendi ve atın boncuk toplamak. </li><li> Süpernatantlar (100 ul ve 200 ul) birleştirin ve asit fenol-CHCl3, 300 ul alt tabaka ilave edin. </li><li> Vortex, 1 dak RT (veya 37 ° shaker C) ve 1 dakika oda sıcaklığında 16.000 g&#39;de santrifüj. </li><li> Üst tabakanın 250 ul (arayüz bozabilir ETMEYİN) toplayın, pH 5.2, 625 ul% 100 ETOH ve 5 ul glycoblue az 25 ul sodyum asetat ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> -20 ° C de bir gece boyunca saklayın <ol class="lalpha"><li> RNA&#39;nın düzgün iyileşme sağlamak için, glycoblue ilavesiyle bir taşıyıcı molekül olarak hareket ederek RNA pelet görünürlüğünü artıracaktır. </li></ol></li><li> Ertesi gün, ters çevirme ile 3-5 kez karışımı tüpler, 30 dakika boyunca 4 12,000 xg&#39;de sıkma ° C ve süpernatan atılır. </li><li> Mavi pelet ve inversiyon veya vorteks ile karıştırın% 70 ETOH 1 ml ekleyin. </li><li> 2 dakika süreyle 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> DSüpernatant iscard ve 4 az 1 dakika için 12.000 x g santrifüj edilir ° C. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir pipet ve hava kuru pelet ile herhangi bir kalıntı% 70 ETOH çıkarın. </li><li> RNaz / DNaz ücretsiz su veya gerektiği gibi başka bir uygun ses 20-40 ul süspanse edin. <ol class="lalpha"><li> Örnek şimdi bu tür qRT-PCR veya mikroarray gibi, daha aşağıda uygulama için hazır hale gelir. </li><li> Nanodrop spektrofotometre örnek konsantrasyon değerlendirilmesinde kullanılabilir, ancak değerli örnekleri ile, bu savurgan ve nispeten yanlış olabilir olarak nanodropping örnekleri önlemek için yararlı olabilir. Biz değerli veya düşük verim örnekleri için saflık ve IP etkinliğini değerlendirmek için temizlik gen transkript normalizasyon örnekleri öneririz. </li></ol></li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Prosedürü iyileştirilmiş ve doğru yapılırsa, immünopresipitasyon mRNA hedeflerin belirgin zenginleşme boyun eğmek zorundadır. GenellikleQRT-PCR ile değerlendirildiği zaman 50 kat -, RBP ve mRNA hedef (ler) bağlı olarak, biz yaklaşık 10 zenginleştirme bakın. RBPs Birçok hedefleri mikroarray analizi kullanılarak topluca tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem qRT-PCR ile karşılaştırıldığında bozulmaya karşı daha duyarlıdır. RBP bağlı olarak, hedefleri ve reaksiyon verimini sayısı, mikro yeni hedeflere yüzlerce ortaya çıkarabilir, ya da eğer varsa, sadece bir kaç ortaya çıkarabilir. Örneğin, iyi karakterize edilen RNA bağlayıcı proteinler Hur biri, post-transkripsiyonel olarak çok önemli fizyolojik genler 1, 2, ekspresyonu ve çeviri kontrol eder. Göğüs kanser hücre dizilerinde RIP-çip üzerinden Hur-ribonucleo-kompleksinin izole edilmesi, örneğin, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi qRT-PCR kullanılarak β-aktin dahil olmak üzere, pek çok önemli bilinen Hur hedefleri, zenginleştirilmesi saptandı. Kanseri hücre hatları hem de β-aktin 12 zenginleştirilmiş - 15 kat. Tipik olarak, uygun yapıldığı takdirde biz önemli bir enr bakınhücre hatlarının çeşitli β-aktin ichment. RIP β-aktin için önemli bir zenginlik ortaya değilse Ancak, bu RIP ile ilgili bir sorun olduğunu gösterir ve prosedürü tekrar edilmesi gerekebilir. Ayrıca, bu hücre hatları immunoprecipitated örnekleri mikroarray çeşitli östrojen reseptörü Hur hedeflerin farklı ifade alt (ER) olarak ER negatif MB-231 göğüs kanseri hücre çizgileri karşı pozitif kanser MCF-7 hücreleri Şekil 2, 1 de gösterilmiştir saptandı. Ya ilişkili veya kanser ile ilişkili değildi bilinen ve bilinmeyen Hur hedefleri: Bu hedefler birkaç kategoriye ayrılır. Örneğin, CALM2 CD9 ve hem de daha önce Hur hedefler olarak tespit edilmemiştir kanser genlerdir. 180-kat Hur protein ve hedef genler arasında belirgin bir etkileşim gösteren Hur pelet içinde zenginleştirilmiş - qRT-PCR, CALM2 ve CD9 ile mikroarray kullanılması ile teyit 5 olduğu bulunmuştur. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Şekil 1&quot; /&gt; Şekil 1. Immünopresipitasyon ve MB-231 içinde RIP (ER-) ve MCF-7 (ER +) meme kanseri hücreleri. Immunoprecipitations anti-Hur monoklonal antikor (3A2) ve IgG1 izotip kontrol kullanarak MB-231 veya MCF-7 hücre lizatları gerçekleştirildi. 3A2 tarafından tespit edilen Hur A. IP Batı beklenen boyutu bant saptandı. Sağdaki Panel yükleme kontrolü olarak β-tubulin ile, hem hücre hatları kullanılmaktadır lizatları giriş Hur miktarlarda ortaya koymaktadır. Kantitatif RT-PCR ile B. Kontrol sırasıyla MB-231 ve MCF-7, gelen 3A2 IP olarak, β-aktin-on beş, on kat zenginleşme, bilinen bir Hur hedef gösterdi. Tüm ΔΔCT değerler GAPDH normalize edildi. Deneyler, (n = 2), iki kopya halinde yapıldı. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Hur RIP CHIP ER + ve ER-meme kanseri hücrelerinde farklı genetik profilleri tanımlar.Hur immunoprecipitations MB-231 veya Hur antikor ve Illumina Sentrix diziler (47,000 genler) ile melezleştirilebilir IgG1 izotip kontrol kullanarak MCF-7 hücre lizatları gerçekleştirildi. Kontrol sinyalleri çıkartılmıştır. Sonuçlar 12 farklı diziler gelen kümülatif verileri temsil eder. Deneyler, uygun kontroller ile her bir hücre hattı için üç kopya (n = 3) olarak yapılmıştır. Scales log2 vardır.

<ol><li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li>
<li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomics%3A+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RIP-Chip+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR%3A+post-transcriptional+paths+to+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li>
<li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li>
<li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li>
<li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Bu deneyde, optimizasyon ve deneyim doğası nedeniyle başarıyla amaçlanan sonuçları elde etmek için sadece garantili yolu olacaktır. Bu işlem birçok adım olarak, sıcaklık ve reaktifler ve ürünlerin etkin kullanım kritik önem taşır. Uygun planlama ve tekniğin uygulanması deney önerilen optimum sıcaklıkta uygun bir süre içinde yapıldı sigorta yardımcı olacak. RNA izolasyonu deneyler ile önemli bir sorunu RNaz azalmayla RNA&#39;ların hassasiyetidir. Tüm reaktifler RNaz ücretsiz ve saklanan veya RNaz ücretsiz kaplarda kullanılan olması gerekir. Bu mRNA örnek bütünlüğünü sağlamak için önemli bir adımdır. Deney, doğru uygulanmak bile, bununla birlikte, arzu edilen sonuç RBP ve hedef mRNA arasındaki etkileşimin doğasını dolayı elde edilemez. Bir potansiyel sorun düşük veya RIP-Chip izole RNA hatta hiçbir sinyal yaşıyor.Total RNA sinyali olabilir rağmen, bu boncuklar tarafından aşağı çekilerek yetersiz bağlayıcı protein sonucu olabilir. İlk sorun giderme adımı kullanılan hücresel lizat belirli RBP yeterli ifadesi olduğunu teyit etmektir. Teyit sonra, protein nihai NT2 yıkamadan sonra izole edilebilir ve 5 dk için Laemmli tampon ya da başka bir uygun denatüre edici tampon içinde yeniden asıldı ve 95 ° C&#39;ye ısıtılmış. Western blot analizi yeterli ilişkili protein aşağı çekme sağlamak için giriş lisatı hem de negatif kontroller ile koordineli olarak bu örnekler üzerinde kullanılabilir. Bundan başka, hücre parçalama bu bileşenlerin ulaşmak için gerekli olduğu için, normal olarak ayrılan proteinler ve mRNA arasında anormal ve istenmeyen etkileşimler için potansiyel sokulabilir. Bu etkileşimler potansiyel bağlamak ve nonspesifik etkileşimler aracılığıyla hedef mRNA veya bağlayıcı proteinler &quot;içinize çekin&quot; olabilir. Bu değişen co Ayrıca, proteinlerşulları çoklu varyasyonlarda katlayabilirsiniz ve bağlayıcı motifleri bunların etkileşimi engelleyerek, kendi hedef mRNA için erişilemez hale gelebilir. Bunların her ikisi de verimli çalışma yanı sıra bu istenmeyen etkileşimler sınırlamak için listelenen en uygun sıcaklıklar kullanmanın önemini güçlendirmektedir. Ayrıca, belli bir hedef protein için yıkama koşulları optimize etkileşim saflığı en üst düzeye çıkarmak için önemli olacaktır. Daha sıkı yıkama koşullarına tabi olabilir. Örneğin, yıkama tamponu SDS ya da sinyal çıkışı da spesifik olmayan etkileşimleri ve arka planı azaltmak için ürenin uygun bir miktarda ilave edilebilir. Bu deneycinin hedef RBP yanı sıra bunların tek fizyolojik koşullar altında hedef mRNA üzerinde tamamen bağlı olacaktır. Bazı koşullar örneklerinin hazırlanması belirtilmelidir belirli mRNA analizi araçları için uygun olmayacaktır. Sonunda, olsa RIP RNA zenginleşmesine başarılı-RBP etkileşimleri, RIP (CHIP) yöntemi ile bilinen bir sorunu geçici mRNA hedeflere RBP belirli bağlayıcı etki tespit etmek yetersizliğidir. Çeşitli çapraz bağlama teknikleri benzersiz dizi hedef izole etmek için RIP takiben de kullanılabilir, ancak kısa dalga boyunda UV kullanımı nükleik asit hasara yol açma eğilimindedir. PAR-CLIP veya photoactivatable Ribonükleozit çapraz ve immuoprecipitation olarak bilinen yeni bir yöntem istikrarlı ve geçicidir hem RNA etkileşimi benzersiz bağlanma yerlerinin tanımlanmasına izin veren yeni doğmakta olan RNA&#39;ya thiouridine dahil uzun dalga UV kullanır. Genel olarak, RIP-Chip grubumuzun yanı sıra diğer birçok araştırma grubu tarafından RNA bağlayıcı proteinler ve mRNA hedefleri arasındaki etkileşimleri yalıtmak ve incelemek için kullanılan mükemmel bir araç olarak kurulmuştur. Doğa ve uygulamada hassas olsa da, bu işlemin uygun yürütülmesi son zamanlara kadar, inacc olmuştur bu RNP komplekslerin izolasyonu, verecektirkeşif ve analiz için essible.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1 M ditiotreitol </td><td> Balıkçı </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNaz 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNaz ücretsiz </td></tr><tr><td> Tetraccetic Asit ethylendiamin </td><td> Balıkçı </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glikojen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7.0 &#39; </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl2 </td><td> Balıkçı </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Tampon </td><td> * Aşağıda bak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysome Lizis Tampon </td><td> * Aşağıda bak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl tabletler </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A Sepharose boncuk </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Balıkçı </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü Out RNaz </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Balıkçı </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCI </td><td> Balıkçı </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7.4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl Ribonükleozit Kompleksi </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif İncelemeler </td></tr><tr><td> RNaz / DNaz ücretsiz, DEPC işlenmiş cam reaktifler hazırlayın </td></tr><tr><td> Polysome lizis Tampon </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7.0) </td></tr><tr><td> % 0.5 NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 ünite / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 mcM VRC </td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl tableti </td></tr><tr><td> Polysome lizis tamponu 5 mL </td></tr><tr><td> 1 M HEPES 50 ul (pH 7.0) ekleyin </td></tr><tr><td> 1 M KCL 500 ul </td></tr><tr><td> 1 M MgCl2 ve 25 ul </td></tr><tr><td> NP40 ve 25 ul </td></tr><tr><td> 4.7 ml RNase-DNaz-serbest H 2 O </td></tr><tr><td> 1 M DTT ve 50 ul </td></tr><tr><td> 100 U / ml RNaz 12.5 ul Out </td></tr><tr><td> 200 ul Proteaz inhibitörü kokteyl (üreticiye göre çözünmüş) </td></tr><tr><td> 10 ul 200 mM VRC (kullanım sırasında) </td></tr><tr><td> NT2 Tampon </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> % 0.05 NP40 </td></tr><tr><td> NT2 Tampon 1 L </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7.4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCI </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-DNaz-serbest H 2 O </td></tr></tbody></table>

rip-chip kullanarak hücre ekstraktlarının gelen mrna mikrorna&#39;lar ve ribonükleoprotein kompleksi protein bileşenlerinin İzolasyonu ve tanımlama için yöntemi

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Yüksek işlem dizileme ve verimli mikroarray gelişiminin bir sonucu olarak, küresel gen ekspresyon analizi veri toplama ve kolay bir kullanıma hazır formu haline gelmiştir. Ancak pek çok araştırma ve hastalık modellerinde, hedef genin mRNA kararlı durum seviyeleri her zaman doğrudan kararlı durum protein düzeyleri ile ilişkili değildir. Post-transkripsiyonel gen regülasyonu ikisi arasındaki farklılığın olası bir açıklamadır. RNA Bağlayıcı Proteinler (RBP) bağlama tarafından Driven, post-transkripsiyonel regülasyonu hedef mRNA ile ribonükleoprotein (RNP) kompleks oluşturarak mRNA lokalizasyonu, istikrar ve çeviri etkiler. RNP karmaşık hücresel özlerinden bu bilinmeyen de novo mRNA hedeflerin belirlenmesi anlayışı mekanizmaları ve RBP ve protein miktarı üzerine oluşabilecek etkisi fonksiyonları için kilit önem taşımaktadır. Bu protokol, s tanınabilir RNP immünopresipitasyon-mikrodizi (RIP-Çip) olarak adlandırılan bir yöntem önerilmektedirdaha bireysel araştırmacı için bir deney optimize etmek için seçenekleri ile birlikte pecific mRNA&#39;ların, değişen deneysel koşullar altında, ribonükleoprotein kompleksi ilişkilidir. Bu önemli deneysel aracı sayesinde araştırmacılar, post-transkripsiyonel gen regülasyonu yanı sıra diğer ribonükleoprotein etkileşimleri ile ilişkili karmaşık mekanizmalar keşfedebilirsiniz.

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Yüksek kapasiteli dizilemenin ve verimli mikroarray analizinin geliştirilmesinin bir sonucu olarak, küresel gen ekspresyon analizi kolay ve ... hale gelmiştir.

Bu videonun amacı, immünopresipitasyon yöntemleri kullanılarak hücre ekstraktlarından ribonükleoprotein komplekslerinin RNA ve protein bileşenlerinin izolasyonu ve tanımlanması yöntemini göstermektir. Merhaba, adım Garrett Dom; Missouri Üniversitesi'nde, Dr. Eli sso yönetiminde Moleküler Mikrobiyoloji ve İmmünoloji bölümünde yüksek lisans öğrencisiyim. Yüksek kapasiteli dizilemedeki ilerlemeler ve verimli mikroarray analizleri sayesinde, küresel gen ekspresyonu ve analizi, birçok araştırma ve hastalık modelinde kolay ve hazır bir veri toplama biçimi haline gelmiştir.Ancak, hedef gen mRNA'sının kararlı durum seviyeleri, her zaman kararlı durum protein seviyeleriyle doğrudan korelasyon göstermez. İkisi arasındaki bu farklılığın muhtemel açıklaması, RNA bağlayan proteinlerin etkileşimleriyle yönlendirilen transkripsiyon sonrası gen düzenlemesidir.Transkripsiyon sonrası düzenleme, hedef mRNA'lar ile bir ribonükleoprotein kompleksi oluşturarak mRNA lokalizasyonunu, stabilitesini ve translasyonunu etkiler. Bu kompleks içindeki bilinmeyen Denovo mRNA hedeflerinin hücresel ekstraktlardan tanımlanması, RNA bağlanma proteinlerinin mekanizmalarını ve işlevlerini ve bunların protein çıktısı üzerindeki sonuçlarını anlamak açısından kritik öneme sahiptir. Bu protokol, ribonükleoprotein kompleksinde ilişkili spesifik mRNA'ların tanımlanmasına olanak tanıyan, ribo protein immünopresipitasyon veya RIP olarak adlandırılan bir yöntemi özetlemektedir.Deneye başlamadan önce tüm reaktiflerin, kapların ve gereçlerin hazır olması kritik önem taşır. Cam malzemeleri Ambion'dan RNA ZAP gibi bir RNaz inhibitörü ile işleyip ardından DEPC işlem görmüş su ile durulayarak RNaz'dan arındırın; tüm reaktiflerin RNaz içermediğinden emin olun. Prosedürün ilk adımı, hücresel lizattan ribonükleoprotein kompleksini hasat etmektir; kullanılan her bir örnek için iki ila beş miligram arasında toplam protein üretmek amacıyla eksponansiyel olarak büyüyen doku hücrelerini hasat edin, genellikle iki adet P150 kültür kabı yeterlidir.Burada MB 2 31 ve MC seven insan meme kanseri hücre hatlarını hasat ediyor ve RNA bağlayıcı proteinin ribonükleik etkileşimlerini inceliyoruz. İncelenen her bir RNA bağlayıcı protein için, uygun hedef mRNA ve RNA bağlayıcı protein etkileşimlerini maksimize etmek amacıyla toplam hücre sayısı ve protein miktarlarının optimize edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Hücreleri 4 °C'de yaklaşık sekiz ila 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüj ederek çöktürün, ardından buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüpün altına hafifçe vurarak hücre peletini, RNase ve proteaz inhibitörleri içeren hazırlanmış polisomal lizis tamponu ile eşit hacimlerde yeniden süspande edin.Hücre peletinin tam hacminin ölçülmesi, hücre kümelerini dağıtmak için karışımın pipetle nazikçe karıştırılması ve lizatın beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilmesi önerilir. Lizatı kalıntılardan arındırmak için 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleyin; ardından berraklaşan süpernatanı hemen önceden soğutulmuş RNase-free mikro santrifüj tüplerine aktarın, buz üzerinde tutun ve -80 °C'de saklayın.Bu lizat, -80 °C'de altı aya kadar saklanabilir. Protein ve/veya mRNA degradasyonuna yol açabileceği için tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının. IP işleminin hemen yapılması en iyisidir.Standart Bradford protein analizi kullanarak protein konsantrasyonunu ve lizatı hızlıca nicel olarak belirleyin. Ardından, ilgilendiğimiz spesifik proteinin izolasyonu için gerekli materyalleri hazırlamamız gerekecektir. İlk olarak proteini ön şişirme işlemine tabi tutun.Spherosphere boncuklarını, %5 BSA ile desteklenmiş NT2 tamponunda gece boyunca 4 °C'de saklayın. NT2 tamponunu PAS boncukları ile 4:1 oranında kullanın. 4 °C'de birkaç aya kadar uzun süreli saklama mümkündür.Kullanımdan önce %0,1 sodyum azid ile takviye edildiğinde, nihai boncuk-tampon oranı bire bir olacak şekilde fazla NT iki tamponunu uzaklaştırın. 1,5 mililitrelik RNA içermeyen mikro santrifüj tüpleri kullanarak, her bir bireysel IP reaksiyonu için 100 mikrolitre SRO hızlandırılmış bulamaç çıkarın ve 30 mikrogram antikor ekleyin. Örneğin, deneyimizde fare IgG1 antikoru olan who are antikoru kullanıyoruz.Bu nedenle kontrol antikorumuz da IgG 1'dir. Ardından, antikor boncuk karışımına 100 ila 200 µL NT 2 tamponu ekleyin. Ek olarak, arka plan RNA'sına karşı bir antikor kontrolü olarak, paralel şekilde izotip eşleşmeli bir antikor veya aynı türe ait normal tam serum kullanılmalıdır.Uygun antikoru boncuk karışımına ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta, uçtan uca döndürülerek gece boyunca inkübe edin. Kullanımdan hemen önce, antikoru kaplı boncukları bir mililitre buz gibi soğuk NT iki tamponu ile beş kez yıkayarak hazırlayın; boncukları dört derecede, 13.000 G'de bir ila iki dakika boyunca santrifüj ederek yıkayın. Süpernatantı el pipeti veya aspiratör ile dikkatlice uzaklaştırın.Bu yıkama işlemi, antikor karışımındaki bağlanmamış antikorların yanı sıra RNA kontaminantlarının da uzaklaştırılmasına yardımcı olur. Son yıkama tamamlandığında, boncukları 700 µL buz gibi soğuk NT2 tamponu ile yeniden süspanse edin ve ardından hedef mRNA'ları korumak için 10 µL RNase inhibitörü, 10 µL 100 mM DTT ve 15 µL EDTA dahil olmak üzere çeşitli RNA inhibitörleri ile işlem uygulayın. NT2 tamponu ile hacmi 900 µL'ye tamamlayın.Ardından, hedef kompleksi immünopresipite edeceğiz. RIP prosedürü sonrası RNA analizindeki arka plan sinyalini azaltmak için bir ön temizleme (pre-clear) adımı uygulanmasını şiddetle öneririz; 15 µg izotip kontrolü ile 4 °C'de 30 dakika boyunca ön temizleme yapın. Antikorla kaplanmamış 50 µL ön şişirilmiş PAS boncuğu ekleyin.4 °C'de, rotasyonla 30 dakika inkübe edin ve ardından 4 °C'de 10.000 G'de santrifüjleyin. Pelleti ayırın. Süpernatantı IP için saklayın.Ardından, yaklaşık iki ila beş miligram protein içeren 100 µL izole edilmiş berrak lizatı, hazırlanmış antikor karışımına ekleyin. Lizatı seyreltmek arka planı azaltmaya yardımcı olacaktır; tüpü kapatın ve sıkıca mühürlendiğinden emin olmak için parafilm kullanın ve 4 °C'de dört saat boyunca tumbling yöntemiyle inkübe edin. Ardından boncukları 4 °C'de 5.000 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün ve daha önceden açıklandığı üzere -80 °C'de saklayarak potansiyel analizler için süpernatantı kaydedin. Boncukları, 1 mL buz gibi soğuk TNT2 tamponu ile beş kez yıkayın ve santrifüjleyin.Ardından süpernatantı el pipeti veya bir aspiratör ile uzaklaştırın. Arka planı azaltmak için NT two tamponu sodyum deoksikolat, üre veya SDS ile desteklenerek daha katı yöntemler kullanılabilir. Hedef mRNA'nın bozunmasını en aza indirmek için numuneleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun ve hızlı çalışın.Son olarak, ribonükleoprotein RNA'larını izole etmek için DNAse ve proteinaz K işlemlerini takiben RNA çöktürmesi uygulayacağız; yıkadıktan sonra boncukları, beş mikrolitre RNA-free DNAse I ile desteklenmiş 100 mikrolitre N NT iki tamponu ile yeniden süspande edin. Örnekleri 37 °C'de 5 ila 10 dakika bekletin. Bir mililitre N NT iki tamponu ekleyin ve 5.000 ×g'de beş dakika santrifüj edin.SÜPERNATAN'ı atın; protein A SRO'lar peletini 100 µL NT iki tampon, 10 mg/mL konsantrasyonda 5 µL proteinaz K ve 1 µL %10 SDS ile yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen boncuk karışımını, her 10 dakikada bir hafifçe vurarak 55 °C'lik su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Proteinaz K, ribonükleoprotein bileşenlerinin salınımına yardımcı olacaktır. Boncukları peletleyin.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 5, 000 G'de santrifüjleyin, hacmi yaklaşık 100 µL olan süpernatantı toplayın. Ardından boncuklara 200 µL NT 2 tamponu ekleyip iki dakika boyunca 5, 000 G'de santrifüjleyin. Yaklaşık 200 µL süpernatant toplayın ve boncukları atın.Süpernatantı birleştirin ve 300 µL alt tabaka asit fenol ekleyip vorteksleyin. Oda sıcaklığında bir dakika bekletin ve oda sıcaklığında maksimum hızda bir dakika santrifüjleyin. Üst tabakadan 250 µL toplayın.Kontaminasyona neden olacağı için ara yüzeye dokunmamaya çok dikkat edin. RNA örneğine 5,2 pH'ında 25 µL sodyum asetat, 625 µL soğutulmuş %100 etanol ve 5 µL glyco blue karışımı ekleyin. İyice karıştırıp -20 °C'de gece boyunca saklayın.Ek olarak, RNA'nın düzgün bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için glyco blue eklemek, bir taşıyıcı molekül görevi görerek ertesi gün RNA peletinin görünürlüğünü artıracaktır; tüpleri üç ila beş kez ters çevirerek karıştırın, ardından 4 °C'de 12.000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Mavi pelete 1 mL soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve ters çevirme veya vorteksleme yoluyla karıştırıp santrifüjleyin.Numuneyi 4 °C'de 12, 000 G'de iki dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve 4 °C'de 12, 000 G'de bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Kalan %70 etanolü bir pipetle uzaklaştırın ve peleti havada kurutun.Beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. 20 ila 40 µL RNAz ve DNAz içermeyen su ile yeniden süspanse edin. Örnek artık NanoDrop spektrometrisi ile miktar tayini ve RNA izolasyonun ardından kantitatif gerçek zamanlı PCR veya mikro-dizi analizi gibi diğer alt uygulamalar için hazırdır; RNA bağlayan protein olan who'nun mRNA hedeflerini ve immünopresipitasyon sonucunda elde edilen zenginleşmeyi belirlemek için mikro-dizi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilmiştir.Western blot ile yapılan doğrulama, ribonükleoproteinlerin temiz bir şekilde izole edildiğini ortaya koymaktadır. Kantitatif PCR, IgG kontrolleri ile karşılaştırıldığında beta actin hedef mRNA'sının kat sayısı zenginleşmesini göstermektedir. Mikroarray analizi, meme kanseri hücre hatları olan MCF-7 ve MDA-MB-231 arasında benzersiz genetik profiller ortaya koysa da, ribonükleoprotein immünopresipitasyonu, grubumuzun yanı sıra birçok diğer araştırma grubu tarafından RNA bağlayan proteinler ile bunların mRNA hedefleri arasındaki etkileşimleri izole etmek ve incelemek için kullanılan mükemmel bir araç olarak kabul edilmiştir; doğası ve uygulaması gereği hassas olsa da, bu prosedürün doğru şekilde yürütülmesi, yakın zamana kadar keşif ve analiz için erişilemeyen bu ribonükleoprotein komplekslerinin izole edilmesini sağlayacaktır.

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Öğrenin, hücre ekstraktlarından ribonükleoprotein komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanması için RIP-Chip yöntemini. RNA bağlayıcı proteinlerin mRNA hedeflerini belirleyerek transkripsiyon sonrası gen regülasyonunu anlayın.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNAlar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi (Video) | JoVE Journal

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA'lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Daha fazla video keşfet