RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA'lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu videonun amacı, immünopresipitasyon yöntemleri kullanılarak hücre ekstraktlarından ribonükleoprotein komplekslerinin RNA'larının ve protein bileşenlerinin izolasyonu ve tanımlanması için yöntemi göstermektir. Merhaba, benim adım Garrett Dom ve Missouri Üniversitesi'nde Moleküler ve Mikrobiyoloji ve immünoloji bölümünde Dr.Eli sso'nun yanında okuyan bir yüksek lisans öğrencisiyim. Yüksek verimli dizileme ve verimli mikrodizi analizindeki ilerlemeden, küresel gen ekspresyonu ve analizi, birçok araştırma ve hastalık modelinde kolay ve hazır bir veri toplama biçimi haline gelmiştir.

Bununla birlikte, hedef gen mRNA'nın çalışma durumu seviyeleri her zaman kararlı durum protein seviyeleri ile doğrudan ilişkili değildir. Transkripsiyon sonrası gen regülasyonu, ikisi arasındaki farklılığın muhtemel bir açıklamasıdır. RNA bağlayıcı proteinlerin etkileşimleri tarafından yönlendirilir.

Transkripsiyon sonrası regülasyon, hedef mRNA'lar ile bir kaburga nükleo protein kompleksi oluşturarak mRNA lokalizasyonunu, stabilitesini ve translasyonunu etkiler. Bu kompleksteki hücresel ekstraktlardan bu bilinmeyen Denovo mRNA hedeflerinin belirlenmesi, RNA bağlayıcı proteinin mekanizmalarını ve işlevlerini ve bunların protein çıktısı üzerindeki etkilerini anlamak için çok önemlidir. Bu protokol, ribonükleoprotein kompleksinde ilişkili spesifik mRNA'ların tanımlanmasına izin veren ribo proteini, immünopresipitasyon veya rip olarak adlandırılan bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir.

Deneye başlamadan önce, tüm reaktiflere, kaplara ve mutfak eşyalarına sahip olmak çok önemlidir. RNA'lar içermeyen cam eşyaları, ambiondan RNA ZAP gibi Rna zay inhibitörü ile işlemden geçirin ve ardından dpci ile arıtılmış su ile durulayın, tüm reaktiflerin RNA içermediğinin onaylandığından emin olun. Prosedürün ilk adımı, kullanılan her numune için iki ila beş miligram toplam protein üretmek üzere katlanarak büyüyen doku hücrelerini hasat eden hücresel lizattan kaburga çekirdeği protein kompleksini hasat etmektir, genellikle iki P bir 50 kültür kabı yeterlidir.

Burada MB 2, 31 ve MC yedi insan meme kanseri hücre hattını hasat ediyoruz ve RNA bağlayıcı proteinin ribon nükleo etkileşimlerini araştırıyoruz. Kimdir Araştırılan her RNA bağlayıcı protein için, uygun hedef mRNA ve RNA bağlayıcı protein etkileşimlerini en üst düzeye çıkarmak için toplam hücre sayısı ve protein miktarlarının optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Dört santigrat derecede yaklaşık sekiz ila 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleme yoluyla pelet hücreleri, daha sonra buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın Son yıkamadan sonra, tüpün altını hafifçe vurun ve hücre peletini eşit hacimlerde hazırlanmış poli zomal lizis tamponunda yeniden süspanse edin RNA'lar ve proteaz inhibitörleri.

Hücre peletinin tam hacmini ölçmeniz, hücre kümelerini parçalamak için karışımı nazikçe pipetlemeniz ve lizatı buz üzerinde beş dakika inkübe etmeniz önerilir. Kalıntı lizatını temizlemek için dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleyin, temizlenmiş süpernatanı hemen önceden soğutulmuş RNA'lara aktarın. Serbest mikro santrifüj tüpleri buz üzerinde kalır ve eksi 80 santigrat derecede saklanır.

Bu lizat, eksi 80 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir. Protein ve/veya mRNA bozulmasına yol açabileceğinden, tekrarlanan donma çözülme döngülerinden kaçının. IP'yi hemen yapmak en iyisidir.

Standart Bradford protein tahlilini kullanarak protein ve lizat konsantrasyonunu hızlı bir şekilde ölçün. Daha sonra, ilgilendiğimiz spesifik proteinin izolasyonu için materyalleri hazırlamamız gerekecek. İlk şişme öncesi protein.

Bir Sphero, N NT'de gece boyunca boncuklanır, iki tampon %5 BSA ile desteklenir, dört santigrat derecede saklanır. PAS boncukları ile dörde bir oranında NT iki tampon kullanın. Dört santigrat derecede birkaç aya kadar uzun süreli depolama mümkündür.

Kullanmadan önce% 0.1 sodyum azi ile takviye edildiğinde, son boncuk / tampon oranı bire bir olacak şekilde fazla NT iki tamponunu çıkarın. 1.5 mililitre RNA içermeyen mikro santrifüj tüpleri kullanarak, 100 mikrolitre SRO hız bulamacını çıkarın ve her bir IP reaksiyonu için 30 mikrogram antikor ekleyin. Örneğin, deneyimizde, bir fare IgG bir antikoru olan bir kim antikoru kullanıyoruz.

Bu nedenle kontrol antikorumuz da IgG antikorudur. Daha sonra, antikor boncuk karışımına 100 ila 200 mikrolitre NT iki tampon ekleyin. Ek olarak, arka plan RNA'sına karşı bir antikor kontrolü olarak aynı türden izotip uyumlu bir antikor veya tam normal serum paralel olarak kullanılmalıdır.

Boncuk karışımına uygun antikor ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede yuvarlanarak inkübe edin. Antikor kaplı boncukları kullanmadan hemen önce bir mililitre buz gibi soğuk NT ile iki tampon ile yıkayarak hazırlayın, boncukları 13.000 G'de santrifüjleyerek dört derecede bir ila iki dakika boyunca beş kez yıkayın. Süpernatanı el pipetleyicisi veya aspiratörü ile dikkatlice çıkarın.

Bu yıkama, bağlanmamış antikorun yanı sıra RNA kirleticilerinin antikor karışımından uzaklaştırılmasına yardımcı olur. Son yıkama tamamlandıktan sonra, boncukları ve 700 mikrolitre buz gibi soğuk T iki tamponu tekrar askıya alın, ardından 10 mikrolitre RNA, 10 mikrolitre 100 milimolar DTT ve 15 mikrolitre EDTA dahil olmak üzere hedef mRNA'ları korumak için çeşitli RNA inhibitörleri ile muamele edilir. NT iki tampon ile hacmi 900 mikrolitreye getirin.

Daha sonra, hedef kompleksi immüno-çökelteceğiz. Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 15 mikrogram izotip kontrolü ile ön temizleme işleminden sonra RNA analizinizde arka plan sinyalini azaltmak için bir ön temizleme adımı kullanmanızı şiddetle tavsiye ederiz. Antikorla kaplanmamış 50 mikrolitre pres şişmiş PAS boncukları ekleyin.

Dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve dört santigrat derecede 10.000 G'de santrifüjde tekrar tekrar inkübe edin. İki pelet. Süper natin'i ip için kaydedin.

Daha sonra, hazırlanan antikor karışımına yaklaşık iki ila beş miligram protein içeren 100 mikrolitre izole temizlenmiş lizat ekleyin. Lizatın seyreltilmesi, sıkı tavan sağlamak için arka plan sarma tüpünü ve paraformu azaltmaya yardımcı olacak ve dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edecek, sonraki pelet boncuklarında 5, 000 G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede yuvarlanacak ve daha önce tarif edildiği gibi eksi 80 santigrat derecede depolayarak potansiyel analiz için süpernatı koruyacaktır. Boncukları bir mililitre buz gibi soğuk ve T iki tampon ve santrifüjleme ile beş kez yıkayın.

Daha sonra süper natini el pipetleyicisi veya aspiratörü ile çıkarın. NT iki tamponunu sodyum deoksi kaplama, bir üri veya SDS ile takviye ederek arka planı azaltmak için daha katı yöntemler kullanılabilir. Numuneleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun ve hedef mRNA'nın bozulmasını en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın.

Son olarak, DNA'ları ve proteinaz K işlemlerini kullanacağız, ardından ribon nükleer protein RNA'larını izole etmek için RNA çökeltme uygulayacağız, boncukları yıkadıktan sonra 100 mikrolitre N NT ile yeniden süspanse edeceğiz, iki tampon, beş mikrolitre RNA içermeyen DNA ile desteklenmiş, bir. Numuneleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika tutun. Bir mililitre N NT iki tampon ekleyin ve beş dakika boyunca 5.000 G'de döndürün.

SUPERNAT: Reese spin proteinini, bir SRO peletini ve 100 mikrolitre NT'yi, mililitre başına 10 miligramda beş mikrolitre proteinaz K içeren iki tamponu ve bir mikrolitre% 10 SDS'yi atın, yeniden askıya alınmış boncuk karışımını 55 derece Santigrat su banyosunda 30 dakika inkübe edin, her 10 dakikada bir hafifçe vurun. Proteinaz K, kaburga nükleo protein bileşenlerinin salınmasına yardımcı olacaktır. Pelet boncukları.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 5.000 G ekleyin, hacimce kabaca 100 mikrolitre olması gereken süper adı toplayın. Sonraki iki boncuk, iki dakika boyunca 5.000 G'de 200 mikrolitre NT iki tamponlu santrifüj ekleyin. Yaklaşık 200 mikrolitre süper natin toplayın ve boncukları atın.

Süper natini birleştirin ve 300 mikrolitre alt tabaka asit fenol girdabı ekleyin. Oda sıcaklığında bir dakika ve oda sıcaklığında maksimum hızda bir dakika santrifüjleyin. 250 mikrolitre üst tabaka toplayın.

Arayüzü rahatsız etmemeye çok dikkat edin, çünkü bu kirletecektir. RNA örneği, 5.2 625 mikrolitre soğutulmuş,% 100 etanol ve beş mikrolitre gliko mavisi karışımı pH'ta 25 mikrolitre sodyum asetat ekleyin. Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Ek olarak, RNA'nın uygun şekilde geri kazanılmasını sağlamak için. Gliko mavisi ilavesi, ertesi gün bir taşıyıcı molekül olarak hareket ederek RNA peletinin görünürlüğünü artıracak, tüpleri üç ila beş kez ters çevirerek karıştıracak, daha sonra 30 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 G'de döndürecek ve süper natini atacaktır. Mavi pelete bir mililitre soğutulmuş,% 70 etanol ekleyin ve ters çevirme veya vorteksleme santrifüjü ile karıştırın.

İki dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 G'de örnekleyin. Supernat'ı atın ve dört santigrat derecede bir dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Kalıntı, %70 etanolü bir pipet ve havayla kuruyan pelet ile çıkarın.

Beş dakika boyunca oda sıcaklığını ekleyin. 20 ila 40 mikrolitre RNA, DNA içermeyen su harcayın. Numune artık NanoDrop spektrometresi ile kantitasyon için hazırdır ve RNA bağlayıcı proteinin mRNA hedeflerini ortaya çıkarmak için RNA izolasyonu, mikrodizi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR sonrası kantitatif gerçek zamanlı PCR veya mikrodizi analizi gibi daha sonraki aşağı akış uygulamaları gerçekleştirildi ve bunların immünopresipitasyondan elde edilen zenginleşmesi.

Western blot ile yapılan doğrulama, kimin protein olduğunun temiz bir şekilde izole edildiğini ortaya koymaktadır. Kantitatif PCR, IgG bir kontrol ile karşılaştırıldığında mRNA hedef beta aktinin kat zenginleştirmesini gösterir. Mikroarray analizi, MC yedi ve MB 2 31 arasında benzersiz genetik profiller ortaya çıkarırken, meme kanseri hücre hatları genel olarak kaburga nükleo protein immünopresipitasyonu, RNA bağlayıcı proteinler ve MR'leri arasındaki etkileşimleri izole etmek ve incelemek için kullanılan mükemmel bir araç olarak kurulmuştur. Grubumuzun ve diğer birçok araştırma grubunun hedefleri, doğası ve uygulaması açısından hassas olsa da, bu prosedürün uygun şekilde uygulanması, yakın zamana kadar keşif ve analiz için erişilemeyen bu kaburga nükleo protein komplekslerinin izolasyonunu sağlayacaktır.