Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Bu prosedürün genel amacı, Gram-negatif bakterilerden LPS'yi çıkarmaktır. Bu, önce uygun ortamda beş mililitrelik bir gece boyunca bakteri kültürünün büyütülmesi ve kültürün 600 nanometre 0.5'lik bir optik yoğunluğa ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, bakteriler mikro santrifüjleme ile peletlenir ve hücreler, SDS ve ışın veya kapto etanol içeren bir tris tamponunda yeniden süspanse edilir.

Daha sonra hücre lizatları kaynatılır ve proteaz ve nükleaz ile muamele edilir. Son olarak, sıcak sulu fenol ve dyl eter ile iki ardışık ekstraksiyon gerçekleştirilir, sulu mavi tabakayı dikkatlice çıkarın ve tutun. Sonuç olarak, LPS ve bakteri suşlarının varlığının veya yokluğunun yanı sıra SDS sayfası ile ayırma ve LPS'ye özgü antikorlarla batı kan analizleri veya jel içindeki polisakkaritlerin doğrudan boyanması yoluyla O antijen zincir uzunluğu modalitesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin Hitchcock ve Brown'ın proteaz tedavisine kıyasla avantajı, bu tekniğin SDS sayfası ve batı lekeleme ile daha iyi çözülebilen saf LPS örneklerine yol açmasıdır. Bu yöntem, VIR'deki lipopolisakkaritin sentezi ve düzenlenmesi hakkında bilgi sağlayabilir ve e coli ve salmonella dahil olmak üzere hemen hemen tüm gram negatif bakterilerin yanı sıra biyolojik savunma ve sırasıyla Ella ve Acetobacter gibi ortaya çıkan patojenler Bakteri yetiştirmek için. LPS ekstraksiyonu için, antibiyotiklerle takviye edilmiş beş mililitre LB içinde bir gece boyunca gram negatif bakteri kültürü oluşturun.

Gerekirse, kültürü gece boyunca 200 RPM ve 37 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatörde büyütün. Kültürü bir ila 10 seyreltmek için LB kullanın ve ardından sonuca göre optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. 600 nanometre 0.5'te nihai optik yoğunluğa sahip bakterilerin 1.5 mililitrelik bir süspansiyonunu hazırlayın.

Bakterileri bir mikro santrifüjde 10, 600 kez G'de 10 dakika boyunca peletleyin. Ardından süpernatanı çıkarın ve atın. LPS'yi çıkarmak için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın, bir XSDS tamponu, %4 betta me kapto etanol veya BME %4 SDS ve 0.1 molar tris HCL pH 6.8'de %20 gliserol ile bir tutam bromo fenol mavisi ve mililitre başına 10 miligram DNA bir RNA ve proteinaz K çözeltileri steril damıtılmış suda yeniden süspansiyon halinde.

Bir XSDS tamponunun 200 mikrolitresindeki peletlenmiş bakteriler, çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek peletin tamamen yeniden süspanse edilmesini sağlar. Asılı bakterileri bir su banyosunda 15 dakika yavaşça kaynatın. Ardından çözeltinin oda sıcaklığında 15 dakika soğumasına izin verin.

İsteğe bağlı bir adım olarak, DNA bir ve RNA çözeltilerinin her birinden beş mikrolitre ekleyin ve örnekleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 10 mikrolitre proteaz K çözeltisi ekleyin ve numuneleri 59 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Her numunenin yanına 200 mikrolitre buz gibi tris, doymuş fenol ekleyin.

Kapakları sıkıca kapatın ve her tüpü beş ila 10 saniye boyunca girdaplayın. Numuneleri 65 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Girdap, ara sıra onları oda sıcaklığına soğutun.

Daha sonra bir davlumbaz altında, her numuneye bir mililitre oda sıcaklığı, etil eter ekleyin ve beş ila 10 saniye boyunca girdap yapın. Numuneleri 10 dakika boyunca 20, 600 kez G'de santrifüjleyin ve santrifüjden dikkatlice çıkarın. Üst şeffaf katmandan kaçınarak her numuneden alttaki mavi katmanı çıkarın.

Ek olarak 200 mikrolitre buz gibi tris, doymuş fenol ekleyin ve ekstraksiyonu her tüpe tekrarlayın. 200 mikrolitre iki XSDS tamponu ekleyin. Her LPS örneğinden beş ila 15 mikrolitreyi %sekiz ila 15 SDS poli akrilamid jel üzerinde ayırın.

Burada, kistik fibroz hastalarının balgam örneklerinden izole edilen, bur soğuk alan de losa'nın farklı suşlarından hazırlanan LPS örneklerinin% 12'lik bir SDS sayfası jeli gösterilmektedir. Farklı bantlama modelleri, çekirdek oligosakkaritlere bağlı tekrar eden birimler olan O antijeninin farklı sayılarını yansıtır. Benzer sayıda tekrar eden birim, birinci ve altıncı örneklerde görülebilir.

Koruyucu giyme gibi önlemlerde fenol dathyl eter ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük gibi kişisel koruyucu ekipmanlar alınmalı ve bu işlem denenirken çeker ocakta bu deneyler yapılmalıdır. İşleme sırasında numuneleri kaybetmemek için ekstraksiyonları hızlı bir şekilde gerçekleştirmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, suşlar arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için Western immünoblotlama veya lipo polisakkariti gümüş STR ile görselleştirme yöntemleri veya diğer yöntemlerin alınması gerekir.