Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Bu prosedürün genel amacı, Gram-negatif bakterilerden LPS ekstrakte etmektir. Bu işlem, öncelikle bakterilerin uygun ortamda beş mililitrelik gece boyu kültürü yapılarak ve kültürün 600 nanometredeki optik yoğunluğu 0.5'e ayarlanarak gerçekleştirilir. Ardından, bakteriler mikro santrifüj ile çöktürülür ve hücreler, SDS ile beam veya capto etanol içeren bir tris tamponunda yeniden süspande edilir.

Ardından hücre lizatları kaynatılır ve proteaz ile nükleaz ile işleme tabi tutulur. Son olarak, sıcak sulu fenol ve dietil eter ile iki ardışık ekstraksiyon gerçekleştirilir; sulu mavi tabaka dikkatlice uzaklaştırılır ve saklanır. Nihayetinde, SDS-PAGE ile ayırma ve LPS'ye özgü antikorlarla western blot analizleri veya jeldeki polisakkaritlerin doğrudan boyanması yoluyla, LPS'nin mevcudiyeti veya yokluğunun yanı sıra miktarı, bakteri suşları ve O antijen zincir uzunluğu modalitesi gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin Hitchcock ve Brown'ın proteaz tedavisine kıyasla avantajı, SDS page ve western blotting ile daha iyi çözümlenebilen saf LPS örnekleri sağlamasıdır. Bu yöntem; E. coli ve Salmonella dahil olmak üzere hemen hemen her gram-negatif bakterinin yanı sıra, sırasıyla Ella ve Acetobacter gibi biyosavunma ve yeni ortaya çıkan patojenlerdeki lipopolisakkarit sentezi ve düzenlemesi hakkında bilgi sağlayabilir. Bakterileri büyütmek ve LPS ekstraksiyonu yapmak için, antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB içerisinde gram-negatif bakterilerin gece boyunca kültürünü hazırlayın.

Gerekirse, kültürü 200 RPM ve 37 °C'de çalkalamalı inkübatörde gece boyunca büyütün. Kültürü 1/10 oranında seyreltmek için LB kullanın ve ardından sonuca göre 600 nanometredeki optik yoğunluğu ölçün. 600 nanometrede 0,5 nihai optik yoğunluğa sahip 1,5 mililitrelik bir bakteri süspansiyonu hazırlayın.

Bakterileri bir mikrosantrifüjde 10 dakika boyunca 10.600 ×g'de çöktürün. Ardından süpernatanı uzaklaştırıp atın. LPS ekstraksiyonu için şu çözeltileri hazırlayın: bir adet SDS tamponu, %4 beta-merkaptoetanol veya %4 BME SDS ve bir tutam bromofenol mavisi içeren 0.1 molar Tris-HCl pH 6.8 içinde %20 gliserol; ayrıca steril distile su içinde 10 mg/mL'lik DNAse I, RNAse ve proteinaz K çözeltileri hazırlayarak yeniden süspande edin.

200 µL bir XSDS tamponu içindeki peletlenmiş bakterilerin, çözelti pipetle yukarı-aşağı çekilerek tamamen resüspande edildiğinden emin olun. Süspande edilen bakterileri bir su banyosunda 15 dakika boyunca yavaşça kaynatın. Ardından çözeltinin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca soğumasını bekleyin.

İsteğe bağlı bir adım olarak, DNA 1 ve RNA çözeltilerinin her birinden beş µL ekleyin ve örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 10 µL proteaz K çözeltisi ekleyin ve örnekleri 59 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Her bir örneğin yanına 200 µL buz gibi soğuk tris, doygun fenol ekleyin.

Kapakları sıkıca kapatın ve her tüpü beş ila 10 saniye boyunca vortekslayın. Örnekleri 65 °C'de 15 dakika inkübe edin. Arada bir vorteksleyerek oda sıcaklığına soğutun.

Ardından bir çeker ocak altında, her örneğe oda sıcaklığında bir mililitre etil eter ekleyin ve beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyin. Örnekleri 20.600 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve dikkatlice santrifüjden çıkarın. Üstteki berrak tabakaya dokunmadan, her örnekteki alttaki mavi tabakayı ekstrakte edin.

Her tüpe ek olarak 200 µL buz soğukluğunda tris ve satüre fenol ekleyin ve ekstraksiyon işlemini tekrarlayın. 200 µL iki XSDS tamponu ekleyin. Her bir LPS örneğinden 5 ila 15 µL'yi %8 ila %15'lik SDS poliakrilamid jellerde ayırın.

Burada, kistik fibrozis hastalarının balgam örneklerinden izole edilen farklı bur cold area de losa suşlarından hazırlanan LPS örneklerinin %12 SDS page jeli gösterilmektedir. Farklı bant paternleri, çekirdek oligosakkaritlere bağlı O antijen tekrarlayan birimlerinin farklı sayılarını yansıtmaktadır. Birinci ve altıncı örneklerde benzer sayıda tekrarlayan birim görülebilmektedir.

Fenol datil eter ile çalışmanın tehlikeli olabileceği unutulmamalıdır; bu nedenle laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük gibi kişisel koruyucu ekipmanların kullanımı gibi önlemler alınmalı ve bu deneyler işlem sırasında bir çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmelidir. İşleme sırasında örnek kaybı yaşanmaması için ekstraksiyonların hızlı bir şekilde yapılması önemlidir. Bu prosedürün ardından, suşlar arasındaki akrabalığı görüntülemek için Western immün blotting veya lipopolisakkariti görüntülemek amacıyla gümüş boyama veya diğer yöntemler uygulanmalıdır.