Name: Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Öğrenin Gram-negatif bakterilerden sıcak sulu-fenol ekstraksiyonu ile lipopolisakkarit arındırma yöntemini. Bu teknik SDS-PAGE ve Western blot ile LPS analizi için yüksek saflıkta örnek sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık ve Kistik Fibrozis Vakfı&#39;nın National Institutes of hibe ile desteklenmiştir.

1. LPS Ekstraksiyon için Bakteri hazırlanması <ol><li> Gerekirse antibiyotikler ile desteklenmiş Luria Broth (LB), 5 mL, bir gece kültüre başlar. Bir 37 kuvöz sallayarak ° C ve 200 rpm (12-18 saat) gece kültürü büyütün. </li><li> LB ile kültür 01:10 seyreltilir ve bir spektrofotometre bir OD 600 okuma alır. OD 600 okuma dayanarak, 0.5 OD 600 için bir bakteri 1.5 ml süspansiyon olun. </li><li> Pelet 10 dakika boyunca 10.600 x g hızında bir mikrosantrifüj bakteri. Süpernatantı alın ve atın. LPS hemen ayıklanır olacak değilse pelet, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. LPS çıkarımı <ol><li> Birincisi, 2x SDS tamponu hazırlamak. 0,1 bir 50 mL% 4 β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS solüsyonu ve% 20 gliserol hale M Tris-HCl, pH 6.8. Çözüm boyamak için Bromophenol Mavi bir tutam ekleyin. 2X s seyreltilmesi ile 1x SDS-tampon stok olunsteril distile H 2 O da tak 01:01 Bu oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Steril damıtılmış H 2 O. in DNase I, RNaz ve Proteinaz K üç ayrı 10 mg / mL çözümler hale </li><li> 1x SDS-tampon 200 ul adım 1.3 pelet bakteri süspanse edin. Pelet tamamen yavaş yavaş aşağı çözümü pipetleme tarafından süspanse emin olun. Vorteks yapmayın. </li><li> 15 dakika su banyosunda asılı bakteri kaynatın. 15 dakika için oda sıcaklığında soğumasına izin çözeltisi. </li><li> 2,2 hazırlanan DNase I ve RNaz çözümler hem 5 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe örnekleri. * Bu adım isteğe bağlıdır; nükleaz arıtılmış ve arıtılmamış örnekleri arasında LPS kalitesinde az fark vardır. </li><li> 2,2 hazırlanan Proteinaz K solüsyonu 10 ul ekleyin. 3 saat boyunca 59 ° C&#39;de inkübe örnekleri. Zaman kısıtlamaları vardır, bu adım, bir gece boyunca gerçekleştirilebilir. </li><li> Her örnek, reklam içind 200 ul buz Tris-doymuş fenol (Tris-doymuş fenol yoksa suya doymuş fenol bir alternatif olarak kullanılabilir). Tüpler sıkıca kapalı üzerinde kapakları ve yaklaşık 5 ila 10 saniye vorteks her bir örnek olun. </li><li> Ara sıra vorteks, 15 dakika boyunca 65 ° C&#39;de inkübe örnekleri. Oda sıcaklığına kadar soğutulur kuluçkaya sonra, daha sonra 1 Her numune için oda sıcaklığında ml dietil eter ve 5-10 saniye vorteks ekleyebilir. Volatil olduğu gibi, bir çeker ocak içinde kolu eter gerçekleştirmek için emin olun. </li><li> 10 dakika için 20,600 x g&#39;de santrifüje örnekleri. Dikkatlice santrifüj gelen örnekleri kaldırmak ve alt mavi katmanı ayıklayın. Üst, açık tabaka önlemek emin olun. Mavi tabakası küçük bir miktar geride kalacak üst tabaka ile kirlenme tercih edilir. </li><li> 2.9 - 2.7 adımları tekrarlayarak örnekleri yeniden ayıklayın. İki ekstraksiyonu genellikle yeterlidir. Örnekleri bulanık görünür, daha fazla çekimi performe olabilird. SDS-PAGE ile ayırarak önce ekstre örneklerin her birine 2x SDS-tamponun 200 ul ekleyin. Örnekler 8% -15% SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırılabilir. Bu yöntemi kullanarak hazırlanan LPS beş ile on beş ul görünüm için genellikle yeterlidir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Yukarıdaki gibi hazırlanan LPS örnekleri standart bir gümüş boyaması protokol veya piyasada bulunan LPS boyama kiti kullanılarak SDS-PAGE üzerinde ayrılığı takiben direkt boyama ile görülebilmesi. Alternatif olarak, bir poliakrilamid jel üzerinde ayrılır LPS bir nitroselüloz zarına aktarılır ve LPS spesifik anti-serumu kullanılarak immunoblotting Western tabi tutulabilir. Bu protokol için, Pro-Q zümrüt 300 Lipopolisakkaritlerinin Jel Stain Kit (Molecular Probes) kullanılır ve üreticinin talimatlarına izledi. Bir Pro-Q Emerald 300 lekeli% 12 SDS-poliakrilamid jel Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Her kulvar dif hazırlanan LPS 15 ul içerenBurkholderia dolosa özelliklerine ait farklı suşları kistik fibrozis hastaların balgam örneklerinden izole. Merdiven kalıplarını bantlama Farklı LPS, farklı sayıda oligosakkarit çekirdek bağlı birimleri tekrarlayarak O-antijeni yansıtıcı, bu yöntemi kullanarak belirgindir, örneğin şerit 1 ve 6 örnekleri birbirine benzer bant desenleri var (kırmızı kutulu). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> Burkholderia dolosa klinik izole edilen Şekil 1. Pro-S Zümrüt 300 lekeli LPS. Yedi B. LPS Bu protokol açıklandığı gibi kistik fibroz hastalarında salgını gelen dolosa suşu izole edildi. Onbeş ul üreticinin talimatlarına göre, Pro-Q zümrüt 300 ile% 12 SDS-poliakrilamid jel ve vitray üzerine ayrıldı. LPS çekirdekli bir ok gösterilir, ve O-antijen tekrarlarının benzer bant desenleri gösteren LPS kırmızı kutu içinde edilir. M = Moleküler ağırlık işaretleyici.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz, nükleik asitlerin ve proteinler de dahil olmak üzere diğer hücre bileşenleri, LPS ile saflaştırma uzak bir yöntemi de tarif etmiştik. Bu yöntem, Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, SDS-PAGE jeli karbonhidrat boyama dahil olmak üzere çeşitli görsel yöntem, bir dizi kullanılabilir yüksek kalitede LPS sağlar. Bu yöntem, belirli bir anti-serumu kullanılarak, suşları çeşitli LPS serotip için, ya doğrudan görselleştirme tarafından izole arasındaki akrabalıkları göstermek üzere kullanılabilir. Örneğin, LPS karakterizasyonu ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DNase I rekombinant, RNaz-free </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNaz A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Balıkçı </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Fenol Tris-Doymuş </td><td> Balıkçı </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Dietil eter </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q zümrüt 300 Lipopolisakkaritlerinin Jel Stain Kit </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

sıcak sulu-fenol ekstraksiyon tarafından gram-negatif bakteriler arınma ve lipopolisakkaritlerinin görselleştirmesi

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolisakkarid (LPS) Gram-negatif bakterilerin dış zarının önemli bir bileşenidir. Bu lipid oluşan üçlü bir moleküldür dış membran içine gömülü olan A, hücre 1, 2 yüzeyinden dışa doğru uzanan temel bir oligosakarit ve tekrar eden O-antijen birimi. LPS Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, ve Escherichia coli 3-5, ve LPS O-antijen kompozisyonu formunda suşunun serotipleme için temel farklılıkları dahil, birçok bakteri türleri, ölümcüllüğünü ve patogenezine için önemli olan bir bağışıklık ağırlıklı bir moleküldür. LPS enfeksiyon başlangıcında hücreler ev sahipliği ekinde yer alan ve kompleman aracılı öldürülmesine karşı koruma sağlayan; LPS yoksun suşları virulans 6-8 için zayıflatılmış olabilir. Bu sebeplerden dolayı, özellikle klinik olarak izole edilen, LPS canlandırmak için önemlidir. Belirli bir tarafından desenleri ve tanıma bantlama görselleştirme LPSntibodies gerginlik soy tespit etmek ve çeşitli mutantlar karakterize etmek için faydalı bir araç olabilir. Bu yazıda, Gram-negatif bakteri hücrelerinin LPS izolasyonu ve saflaştırılması için sıcak sulu-fenol yöntemi açıklar. Bu protokol uzaklıkta 9 daha kısa, daha az yoğun ekstraksiyon yöntemleri ile oluşur LPS görselleştirme engelleyebilir nükleik asitlerin ve proteinlerin gelen LPS çıkarılması için izin verir. LPS bu şekilde karbonhidrat / glikoprotein lekeler veya standart gümüş boyama yöntemleri kullanılarak sodyum dodesil sülfat (SDS)-poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ve doğrudan lekeli ayrılabilir hazırlanmıştır. LPS anti-sera Birçok sürebiliyor dış membran proteinleri veya diğer antijenik hedefleri ile çapraz reaksiyona reaktivite SDS-PAGE ile ayrılmış ham hücre lizatları Batı immunoblotting sonrası gözlenen bu antikorları içerir. Tek başına ham hücre lizatlarının Proteaz tedavi her zaman bu silmenin en etkili yolu değilBu veya diğer görüntüleme yöntemleri kullanılarak arka plan. Dahası, bu arka kaldırmak için bir girişim geniş proteaz tedavisinde de yukarıda belirtilen yöntemlerden herhangi çözülemezse düşük kaliteli LPS yol açabilir. Bu nedenlerle, biz Westpahl ve Jann 10 uyarlanan aşağıdaki protokol, LPS ekstraksiyon için ideal olduğuna inanıyorum.

Biz Gram-negatif bakterilerden lipopolisakkarid (LPS) arıtılması için modifiye edilmiş bir sıcak sulu-fenol ekstraksiyon yöntemi açıklar. Bir kez çıkarılan, LPS sonradan SDS-PAGE ile analiz ve direkt boyama ya da Batı immunoblotting tarafından görüntülenebilir.

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Lipopolisakkarit (LPS), Gram-negatif bakteri dış membranlarının ana bileşenidir. Lipid A'dan oluşan üç parçalı bir moleküldür...

Bu prosedürün genel amacı, Gram-negatif bakterilerden LPS ekstrakte etmektir. Bu işlem, öncelikle bakterilerin uygun ortamda beş mililitrelik gece boyu kültürü yapılarak ve kültürün 600 nanometredeki optik yoğunluğu 0.5'e ayarlanarak gerçekleştirilir. Ardından, bakteriler mikro santrifüj ile çöktürülür ve hücreler, SDS ile beam veya capto etanol içeren bir tris tamponunda yeniden süspande edilir.Ardından hücre lizatları kaynatılır ve proteaz ile nükleaz ile işleme tabi tutulur. Son olarak, sıcak sulu fenol ve dietil eter ile iki ardışık ekstraksiyon gerçekleştirilir; sulu mavi tabaka dikkatlice uzaklaştırılır ve saklanır. Nihayetinde, SDS-PAGE ile ayırma ve LPS'ye özgü antikorlarla western blot analizleri veya jeldeki polisakkaritlerin doğrudan boyanması yoluyla, LPS'nin mevcudiyeti veya yokluğunun yanı sıra miktarı, bakteri suşları ve O antijen zincir uzunluğu modalitesi gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin Hitchcock ve Brown'ın proteaz tedavisine kıyasla avantajı, SDS page ve western blotting ile daha iyi çözümlenebilen saf LPS örnekleri sağlamasıdır. Bu yöntem; E. coli ve Salmonella dahil olmak üzere hemen hemen her gram-negatif bakterinin yanı sıra, sırasıyla Ella ve Acetobacter gibi biyosavunma ve yeni ortaya çıkan patojenlerdeki lipopolisakkarit sentezi ve düzenlemesi hakkında bilgi sağlayabilir. Bakterileri büyütmek ve LPS ekstraksiyonu yapmak için, antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB içerisinde gram-negatif bakterilerin gece boyunca kültürünü hazırlayın.Gerekirse, kültürü 200 RPM ve 37 °C'de çalkalamalı inkübatörde gece boyunca büyütün. Kültürü 1/10 oranında seyreltmek için LB kullanın ve ardından sonuca göre 600 nanometredeki optik yoğunluğu ölçün. 600 nanometrede 0,5 nihai optik yoğunluğa sahip 1,5 mililitrelik bir bakteri süspansiyonu hazırlayın.Bakterileri bir mikrosantrifüjde 10 dakika boyunca 10.600 ×g'de çöktürün. Ardından süpernatanı uzaklaştırıp atın. LPS ekstraksiyonu için şu çözeltileri hazırlayın: bir adet SDS tamponu, %4 beta-merkaptoetanol veya %4 BME SDS ve bir tutam bromofenol mavisi içeren 0.1 molar Tris-HCl pH 6.8 içinde %20 gliserol; ayrıca steril distile su içinde 10 mg/mL'lik DNAse I, RNAse ve proteinaz K çözeltileri hazırlayarak yeniden süspande edin.200 µL bir XSDS tamponu içindeki peletlenmiş bakterilerin, çözelti pipetle yukarı-aşağı çekilerek tamamen resüspande edildiğinden emin olun. Süspande edilen bakterileri bir su banyosunda 15 dakika boyunca yavaşça kaynatın. Ardından çözeltinin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca soğumasını bekleyin.İsteğe bağlı bir adım olarak, DNA 1 ve RNA çözeltilerinin her birinden beş µL ekleyin ve örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 10 µL proteaz K çözeltisi ekleyin ve örnekleri 59 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Her bir örneğin yanına 200 µL buz gibi soğuk tris, doygun fenol ekleyin.Kapakları sıkıca kapatın ve her tüpü beş ila 10 saniye boyunca vortekslayın. Örnekleri 65 °C'de 15 dakika inkübe edin. Arada bir vorteksleyerek oda sıcaklığına soğutun.Ardından bir çeker ocak altında, her örneğe oda sıcaklığında bir mililitre etil eter ekleyin ve beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyin. Örnekleri 20.600 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve dikkatlice santrifüjden çıkarın. Üstteki berrak tabakaya dokunmadan, her örnekteki alttaki mavi tabakayı ekstrakte edin.Her tüpe ek olarak 200 µL buz soğukluğunda tris ve satüre fenol ekleyin ve ekstraksiyon işlemini tekrarlayın. 200 µL iki XSDS tamponu ekleyin. Her bir LPS örneğinden 5 ila 15 µL'yi %8 ila %15'lik SDS poliakrilamid jellerde ayırın.Burada, kistik fibrozis hastalarının balgam örneklerinden izole edilen farklı bur cold area de losa suşlarından hazırlanan LPS örneklerinin %12 SDS page jeli gösterilmektedir. Farklı bant paternleri, çekirdek oligosakkaritlere bağlı O antijen tekrarlayan birimlerinin farklı sayılarını yansıtmaktadır. Birinci ve altıncı örneklerde benzer sayıda tekrarlayan birim görülebilmektedir.Fenol datil eter ile çalışmanın tehlikeli olabileceği unutulmamalıdır; bu nedenle laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük gibi kişisel koruyucu ekipmanların kullanımı gibi önlemler alınmalı ve bu deneyler işlem sırasında bir çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmelidir. İşleme sırasında örnek kaybı yaşanmaması için ekstraksiyonların hızlı bir şekilde yapılması önemlidir. Bu prosedürün ardından, suşlar arasındaki akrabalığı görüntülemek için Western immün blotting veya lipopolisakkariti görüntülemek amacıyla gümüş boyama veya diğer yöntemler uygulanmalıdır.

purification-visualization-lipopolysaccharide-from-gram-negative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Armbruster, K.M., Meredith, T.C. Bakteriyel Lipoproteinlerin Zenginleştirilmesi ve Kütle Spektrometresi ile Yapısal Belirleme için N-terminal Lipopeptitlerin Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, ısıtıldığında faz ayrımına uğrayan iyonik olmayan bir deterjan kullanılarak bakteriyel lipoproteinlerin zenginleştirilmesini göstermektedir. Sıralı sıcaklık değişimleri ve santrifüjleme adımları yoluyla, lipoproteinler seçici olarak deterjan fazına bölünürken, lipoprotein olmayan...

İyonik Olmayan Deterjan Faz Ayrımı Kullanılarak Bakteriyel Lipoproteinlerin Zenginleştirilmesi

Kaynak: Hu, Y. ve diğerleri. Endobiyotikler ile İnsan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimlerin In vitro banyo fermantasyon sistemleri kullanılarak analizi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, insan dışkı mikrobiyotası tarafından ekzopolisakkaridlerin (EPS) parçalanmasını değerlendirmek için ince katmanlı kromatografi (TLC) kullanımını göstermektedir. Fermantasyon süpernatantlarındaki EPS parçaları, TLC kullanılarak boyut ve polariteye göre ayrılır, ardından karbonhidrat-spesifik boyama sonrası...

Bakteriyel ekzopolisakkarit bozunmasını değerlendirmek için ince katmanlı kromatografi yapılması

Bu video, mikolik asitlerin ince tabaka kromatografisi tabanlı ayrımını göstermektedir. Bu teknik, mikobakterilerin hücre duvarında bulunan farklı mikolik asitleri (mikobakterilerin hücre duvarında bulunan uzun zincirli lipitler) polaritelerine göre ayırır.

Mikolik Asit Varyantlarının İnce Tabaka Kromatografisi Tabanlı Ayrımı: Mikobakteriyel Hücre Duvarı Lipidlerini Polariteye Göre Ayırmak İçin Bir Yöntem

Gram-negatif bakterilerin lipopolisakarit (LPS) lipid A alanı izolasyonu ve karakterize edilmesi, hücre yüzeyi antibiyotik direnç mekanizmaları göre, bakterinin yaşamda kalması ve spor ve nasıl kimyasal olarak çeşitli lipit A moleküler türün farklı olarak ana doğal immün yanıtları modüle fikir verir.

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

Fosfolipid yağ asitleri toprak mikrobiyal toplulukların yapısı hakkında bilgi vermek. Bu tek fazlı kloroform karışımı, bir katı faz ekstraksiyon kolonları kullanılarak ekstre lipidlerin fraksiyonasyonu ve kılcal gaz kromatografisi ile analiz edilir yağlı asit metil esterlerinin üretilmesi için metanoliz toprak örneklerinden çıkarılması için yöntemler sunmak.

Ekstraksiyon ve Topraklarda Mikrobiyal Fosfolipid Yağ Asitleri Analizi

Bakteriyel lipoproteinler yöntemi bölümleme bir iyonik olmayan yüzey aktif faz kullanarak zenginleştirme doğrudan TLR deneyleri kullanımda veya diğer uygulamalar için tanımlanır. Daha fazla adımlar için yapısal karakterizasyon N-terminal tryptic lipopeptides hazırlamak için kütle spektrometresi tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Zenginleştirme bakteriyel lipoproteinler ve kütle spektrometresi tarafından yapısal kararlılık için N-terminal Lipopeptides hazırlanması

Gram-negatif bakteriler iki mekansal olarak ayrılmış membran üretirler. Dış zar bir periplazm ve peptidoglikan tabakası ile iç zardan bölümlenir. Bu mikropların çift iki katmanlı izole yeteneği fizyolojisi ve patogenezini anlamak için kritik olmuştur.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Çok çeşitli mikobakterilerin hücre duvarının toplam lipit içeriğini çıkarmak için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, farklı mikolik asit türlerinin ekstraksiyon ve analitik protokolleri gösterilmiştir. Bu mikobakteriyel bileşikleri izlemek için ince katmanlı bir kromatografik protokol de sağlanmaktadır.

İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Gangliosidler, beyinde özellikle bol miktarda bulunan sialik asit taşıyan glikozfingolipidlerdir. Amfipatik doğaları, optimum geri kazanım ve doğru analizler sağlamak için organik / sulu ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerektirir. Bu makalede, analitik ve hazırlayıcı ölçekli ganglioside ekstraksiyonu, saflaştırma ve ince tabaka kromatografisi analizine genel bakış sunulmaktadır.

Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Öğrenin Gram-negatif bakterilerden sıcak sulu-fenol ekstraksiyonu ile lipopolisakkarit arındırma yöntemini. Bu teknik SDS-PAGE ve Western blot ile LPS analizi için yüksek saflıkta örnek sağlar.

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Daha fazla video keşfet