Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıkları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkarmayı sağlayan basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve akut pankreatit kaynaklı diyabet PPDMA'nın patogenezinde hücre içi iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı. Birincil adacıkları farelerden izole etmek için mevcut yöntemler esas olarak safra kanalı kanülasyonuna dayanır. Bu teknik, safra kanalının hassas lokalizasyonu ve kanülasyonunu, ardından pankreas parenkim kollajenaz P çözeltinin in vivo perfüzyonu gerektirir.

Özel eğitim olmadan performans göstermek oldukça zordur, etkili ve verimli pankreas perfüzyonu elde etmek zordur. Bu video, perfüzyon deneyimi olmayan araştırmacılar için uygun birincil mount adaciklerini izole etmek için basit ve hızlı bir yöntemi önler. Yöntem ayrıca birincil pankreas asinar hücrelerinin eşzamanlı olarak alınmasını sağlar ve yeterli miktarda yüksek kaliteli adacık ve asinar hücre elde edilir.

Araştırmacıların aynı patolojik ve fizyolojik bağlamda deney yapmasına olanak tanır ve böylece adacıklar ile asinar hücreler arasındaki etkileşim mekanizmasının derinlemesine analizini kolaylaştırır. Pankreas adacıqlarının ve pankreas asinar hücre PAC'lerinin izolasyonu. Hank'in dengeli tuz çözeltisi ve kollagenaz P çözeltisini 12 kuyruklu tabakaya ekleyin ve sonraki sindirim için 50 mililitrelik santrifüj tüpüne üç mililitre kollagenaz P çözeltisi ekleyin.

Ameliyattan önce fareyi %1,25 tribromoetanol ile anestezi yapın ve ardından ötenazi yapın. Farenin karın boşluğunu açmak için V şeklinde bir karın kesisi yapın. Sol hipokondriyak bölgedeki koyu kırmızı lenfoid organ dalaktır, dalağa bağlı beyaz organ ise pankreastır.

Pankreasın alt kenarı ve pankreatikoduodenal birleşim boyunca dikkatlice kesik diseksiyon yapın. İzole pankreas dokusunu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde yıkayın ve kalıntı mezenterik tutucuları, dalağı ve peripankreas yağ dokusunu çıkarın. Önceden işlenmiş pankreası 12 delikli bir tabakaya taşıyın ve önceden iki mililitre kollagenaz P çözeltisi eklenmiştir.

Pankreası cımbızla sol elinizle yerinde tutun ve sağ elinizle bir mililitrelik şırınga kullanarak pankreas parenkimine kollajenaz P solüsyonunu enjekte ederek pankreas dokusu saydam ve ödemli hale gelin. Pankreası cerrahi makasla hızlıca bir ila iki milimetre küpküp parçalarına kesin. Bir mililitrelik pipet ucunun distal kısmını keserek açıklığı büyütün ve bu değiştirilmiş uçla pankreas dokusu parçalarını iki mililitre kollagenaz P çözeltisi ile birlikte üç mililitre kollajenaz P çözeltisi ile önceden yüklenmiş 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüj tüpünü 37 derece Santigras su banyosunda 12 dakika kuluçka edin, bu süre boyunca tüpü her beş ila altı dakikada bir nazikçe sallayın. Kollagenaz P çözeltisinin sindirim etkisini sonlandırmak için 10 mililitre RPMI 1640 tam ortam ekleyin. Pelleti beş mililitrelik bir Pasteur pipeti ile 15 ila 20 yukarı aşağı darbe ile tekrar tekrar pipet yapın, ta ki belirgin büyük doku kümeleri kalmayınca.

10 mililitre RPMI 1640 tam ortam ekleyin. Sonra 180 çarpı G ile iki dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Ve süpernatantı at. Pelleti 20 mililitre RPMI 1640 tam ortamla yeniden askıya alın.

Süspansiyonu 40 meshli bir elekten geçirin. Sonra 180 çarpı G ile iki dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Üst yüzeyi nazikçe at.

Pelleti yeniden süslemek için 20 mililitre Ficoll çözeltisi ekleyin. Sonra yavaş yavaş 15 mililitre RPMI 1640 tam ortam ekleyin. Bu noktada, şeffaf bir sıvı arayüzü gözlemlenebilir.

Santrifüj 640 kat G'de 20 dakika boyunca 25 derece Celsius'ta nazikçe santrifüj yapın. Santrifüj tüpünü dikkatlice çıkarın ve üst kırmızı orta tabakayı beş mililitrelik bir Pasteur pipeti ile aspire edin. Sonra, sıvı tabaka arayüzündeki sıvı içeren adacığı dikkatlice aspire edin ve yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

20 mililitre RPMI 1640 tam orta madde ekleyin. 180 çarpı G ile dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın. Pelleti 20 mililitre RPMI 1640 tam ortamla yeniden askıya alın.

180 çarpı G ile dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın. Pelleti 10 mililitre RPMI 1640 tam ortamla yeniden askıya alın. Ve 60 milimetrelik bir hücre kültürü kabına aktarın.

Ters biyolojik mikroskop altında, 100 kat büyütme, 20 mikrolitrelik pipet kullanarak adacığı elle seçin. Seçilen adacıqları, her kuyu başına 500 mikrolitre RPMI 1640 tam ortamla önceden yüklenmiş 24 kuyruklu bir hücre kültür plakasına aktarın. Ficoll çözelti katmanını at.

Pelleti 10 mililitre DMEM tam ortamla yeniden askıya alın. 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden filtreleyin. Santrifüj 180 çarpı G ile dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca kalın.

Ve üst yüzeyi at. Pelleti 10 mililitre DMEM tam ortamla yeniden askıya alın. 180 çarpı G ile iki dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın ve süpernatantı atın.

Sonra, sonraki deneyler için beş mililitre DMEM tam ortamı ile peleti yeniden askıya alın. Ficoll çözeltisi yoğunluk gradyanı santrifüjasyonundan sonra, şeffaf renksiz sıvı tabakası ile ortam arasındaki arayüze yakın adacıqlar, tüpün tabanında tortu olarak bulunan paketler bulunmuştur. Adacıklar genellikle yuvarlak oval, altın kahverengi, fare başına 120 artı veya eksi beş sabit verimliydi, Şekil A ve Şekil B. Taze izole edilmiş PAC'lar küresel ve kümelenmiş şeklindeydi.

Asinar hücrelerin koyu apikal uçları ve görünür zimojen granülleri bulunuyordu ve verim fare başına 1,6 ila 1,95 çarpı yedinci güç hücresi 1,6 ile 1,95 çarpıştı, Şekil C ve Şekil D. Adacığı ve asinar hücre klacein PI boyamaları, çoğu hücrenin yeşil kalsein, canlı ve az sayıda kırmızı PI boyanmış, ölü olduğunu gösteriyor. Şekil A. Fotoğraf J tabanlı nicel analiz, izole adacıkların ve asinar hücrelerin 97,52 artı eksi% 0,16 ve 96,55 artı veya yaşam oranlarına sahip olduğunu ortaya koymaktadır Sırasıyla %0,95'e düşülür, Şekil B. İzole edilmiş pankreas asinar hücreleri, mililitrede 0,79 artı veya eksi 0,01 birim bazal amilaza aktivite. 10 nano molar, 20 nano azı dişleri ve 50 nano molar seirelin ile uyarıldıktan sonra, amilazın aktiviteleri sırasıyla mililitrede 1,45 artı veya eksi 0,03 birim, mililitrede 1,65 artı veya eksi 0,05 birim ve mililitrede 1,39 artı veya eksi 0,02 birim idi. Tek yönlü ANOVA, tüm serelein gruplarının kontrol grubuna kıyasla belirgin şekilde farklı amilaza aktivite gösterdiğini, tüm P değerlerinin 0.001'den düşük olduğunu gösterdi.

Ayrıca, 20 nano molar grup, 10 nano molar gruptan anlamlı şekilde farklıydı; P değeri 0.001'den küçükse, şekil A. İzole adacıklar, 5.6 milimolar glikoz ile uyarıldığında mililitre başına 0.04 nanogram/saat insülin salgısı ile 0.27 artı veya eksi 0.04 nanogram, 22 milimolar glikoz ile uyarıldı. GSI 3.44'e eşittir, Şekil B. Bu çalışma, primer fare adacığı ile pankreas asinar hücrelerinin karmaşık in vivo perfüzyon olmadan eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem geliştirmiştir. Uzun teknik engelle yöntem kullanımı kolaydır; fare başına 120 artı veya eksik 5 adacık ve 1,6 ila 1,95 çarpı yedinci güç asinar hücresi elde eder; her iki hücre tipi de %96'nın üzerinde canlılık oranı gösterir. İzole adacıklar normal glikoz uyarılı insülin salgısı gösterir ve asinar hücreler sezulen uyarısına duyarlıdır. Bu, bu yöntemle elde edilen hücrelerin sağlam işlevlere sahip olduğunu doğrular ve pankreas ekzokrin ve endokrin etkileşimleri üzerine çalışmalar için uygun hale gelir.

Ancak, yöntem temel fare anatomisi bilgisi, reaktif doz ayarlamalarının gerekliliği, aynı anda işlenen fare sayısının kısıtlanması ve doğrulanmamış uygulama riski nedeniyle sınırlıdır. Perfüzyon deneyimi olmayan araştırmacılar için hâlâ güvenilir bir hücre izolasyon protokolü sunmaktadır.