Name: RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Öğrenin, RNA-seq ile insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde trombin tedavisinin transkriptom profilini nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, RNA izolasyonu, kütüphane oluşturma ve veri analizi adımlarını kapsar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar bizim veri analizi için kendi bilgisayar kümelerinin kullanımı için Çocuk Merhamet Hastaneler ve Klinikler Dr Stephen Kingsmore ve Pediatrik Genom Tıp Merkezi teşekkür etmek istiyorum, Illumina saha servis ekibi (Elizabeth Boyer, Scott Cook ve Mark Cook) ve teknik Onların hızlı tepkiler ve yeni nesil DNA dizileme enstrüman, HiScanSQ ve veri kalitesi analizi çalışmasını yararlı öneriler için danışman ekibi. Bu çalışma Sağlık Hibe HL080042 (SQY için) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen ve Çocuk Merhamet Hastaneler ve Klinikler start-up fon ve bağış, Kansas City Missouri Üniversitesi (SQY için). Edildi

<html> Bu protokol özetleyen bir akış şeması Şekil 1 &#39;de gösterilir. 1. Trombin, RNA İzolasyonu, RNA Kalitesi Değerlendirme ve Ölçülmesi ile Hücre Tedavisi <ol><li> % 5 FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik ile EGM-2 orta boy 6-kuyucuğu yılında% 90-100 izdiham Kültür İnsan Akciğer Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HMVEC-LBL) (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Açlık medya (0% FBS) öncesinde trombin ile tedaviye 30 dakika ortam değiştirin. </li><li> 0.05 U / ml trombin ile hücrelerin tedavi ya da ° C ve% 5 CO2 37, 6 saat süreyle, bir kontrol olarak tedavi bırakın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak Ambion mir Vana kiti kullanılarak tedavi edilen ve kontrol hücrelerinden toplam RNA izole edin. </li><li> Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion StdSense Ökaryotik RNA çip ile RNA kalitesini değerlendirmek= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Bir standart spektrofotometrik yöntem kullanılarak RNA ölçülmesine imkan verirler. </li></ol> 2. Kütüphane İnşaat ve Dizileme <ol><li> Başlangıç ​​maddesi olarak örnek için yüksek kalitede toplam RNA&#39;nın 1 mg kullanımı. </li><li> Kütüphane oluşturmak için, Illumina (protokol # 15008136 Rev A) &#39;dan standart prosedürü izleyin. Bu protokolde, poli iki tur (A) içeren mRNA seçimleri rRNA dizi minimize etmek rRNA kaldırmak için yapılır. </li><li> Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion DNA 1K çip kullanan kütüphanelerin kalitesini değerlendiriniz <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> QPCR kullanarak kütüphane sayısal: önce bir standart eğri ve bağlanan bağdaştırıcıları için spesifik primerler olarak dizisi edilmiş bir kütüphane kullanın. Bilinmeyen kütüphaneleri (yani 1:100, 1:500 ve 1:1,000) dilüsyonlarının bir dizi kullanın. QPCR ACCO çalıştırınSyberGreen MM protokol rding ve her kütüphanenin orijinal stok miktarını hesaplamak. </li><li> Küme bir akış hücresi hazır olana kadar -20 ° C&#39;de 10 nM ve saklamak için kütüphane stok sulandırınız. </li><li> Ne zaman küme bir akış hücresi hazır, bir su banyosunda CBOT reaktif plaka eritin. CBOT küme oluşturma sürecini hızlandırmak için kullanılan bir Illumina araçtır. </li><li> CBOT enstrüman yıkayın. </li><li> Kütüphaneleri denatüre:, tüpün yönünde 13 ul TE 1x ve 6 ul 10 uM ve kütüphane, Kombine 1 ul 1 N NaOH (Illumina tarafından sağlanan) ekleyin. Vorteks, aşağı dönüş 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve buz üzerinde denatüre kütüphaneleri yerleştirin. </li><li> Kütüphaneleri inceltilir 12:00 arasında bir nihai konsantrasyon için 996 ul HT1 ve 4 ul denatüre kütüphane birleştirilmesi ile önceden soğutulmuş bir hibridizasyon tampon ile denatüre kütüphaneleri (HT1, Illumina tarafından sağlanmaktadır) seyreltilir. Buz üzerinde denatüre ve seyreltilmiş kütüphaneler yerleştirin. </li><li> , CBOT levha tüplerin her sıra InvertTüm reaktifler çözülmüş olmasının sağlanması. Plaka aşağı Spin, / delinmeye folyo mühürler kaldırmak ve CBOT üzerine yerleştirin. </li><li> Bir şerit tüp seyreltilmiş, denatüre kütüphanelerin kısım 120 ul, 1-8 etiketli. Bir kontrol başak-gibi her tüpe 1,2 ul seyreltilmiş, denatüre phix kontrol kitaplığı (Illumina dan itibaren) ekleyin. Vortex ve tüpler aşağı spin ve doğru yönde CBOT (sağ tüp # 1) yükleyin. </li><li> CBOT üzerine bir akış hücresi ve manifoldu yükleyin. </li><li> Akışını kontrol ve kümelenme çalışma başlar tamamlayın. </li><li> Çalışma tamamlandıktan sonra, tüm kulvarları arasında reaktif teslim edin. Herhangi bir anormallik not edin. Ya 4 ° C&#39;de hemen dizi çalışma başlatmak veya sağlanan tüp içinde akış hücresi depolamak </li><li> Sıralama-by-sentez (SBS, Illumina) reaktifler çözülme. </li><li> Dilinim karışımı dokunduktan sonra diğer reaktifler dokunmamaya dikkat ederek, reaktif tepsileri uygun noktalar reaktifleri yerleştirin. </li><li> Bir hayır kullanman-sıralama akış hücresi (yani önceden sıralandı biri), asal reaktif çizgiler iki kez. </li><li> İyice% 70 EtOH ve lens kağıt ardından% 70 EtOH ve Kimwipes ile sıralama akış hücresi, temizleyin. Herhangi çizgiler akış hücresi inceleyin. Gerekirse yeniden temizleyin. </li><li> Sequencer üzerine akış hücresi yükleyin ve manifoldlar ve akış hücresi arasındaki mühür sıkı olduğundan emin olmak için kontrol akışı gerçekleştirin. </li><li> Sıralama çalışma başlatın. </li><li> Onlar çalıştırması sırasında kullanılabilir hale kalite ölçütleri (küme yoğunluğu, örneğin filtre geçen kümeleri, S30, yoğunluk) değerlendirin. </li><li> Çalışma süresince yoğunluğunu izleyin. </li><li> 101 döngüleri tamamlandıktan sonra, ikinci okumak tamamlamak için dönüş kimya gerçekleştirin: Eşleştirilmiş sonuna reaktifler ve ikinci okuma Ortaklığımız Buffer (ICB, SBS reaktiflerin bir bileşeni, Illumina) çözülme ve reaktifler yükleyin. </li><li> 2. yoğunluğu, S30 bir okuma değerlendirirken, sıralama çalışma devamçalışma ilerledikçe nd diğer kalite ölçütleri. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Her numune için tek fastq dosyasının oluşturulmasını sağlamak için 0 fastq-küme sayısı ayarı. Fastq dosyaları tabanı çağrı dosyaları (. Bcl) dosyalarını dönüştürmek için casava (Illumina, şu anda 1.8.2) en son sürümünü kullanın . Aşağı analiz için fastq dosyaları açın. </li><li> RNA-seq ultra high-throughput kısa okuma hizalama (Papyon, 0.12.7) 6 ve SAMtools (0.1 kullanarak memeli ölçekli genom okur hizalar Tophat (1.4.1) 5, en son sürümlerini kullanarak eşleştirilmiş sonuna hizalama gerçekleştirin. 17) 7. SAMtools SAM biçiminde sonrası işleme hizalanmalar için çeşitli araçlar uygular. Referans insan transcriptome iGenomes (indirilebilir <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). Tophat çalıştıran, biz fr-unstranded (varsayılan) olarak kütüphane türü seçeneği dahil olmak üzere tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır. </li><li> Bize8. yazılım paketi programı CuffDiff, kol düğmesi parçası (1.3.0) &#39;a ing insan referans transcriptome esas olarak önceki farklı olarak ifade edilen gen transkript dışarıda bırakmak için, kontrol hücreleri ile trombin ile tedavi edilen hücreler karşılaştırın. Bu karşılaştırma bilinen transkript diferansiyel ifadesi algılar. Tablo şeklinde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Kol Düğmeleri program çalışırken, biz tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır. FPKM &lt;0.05 ve p&gt; olanlar gen transkript 0.05 filtrelenir. </li><li> Roman izoformları algılamak için, bir referans transcriptome olmadan Kol Düğmeleri çalıştırın. Cuffcompare kullanılarak referans genomuna örnek transkript dosyaları karşılaştırın ve bir analiz için referans genomu ve bir ikinci analiz için referans genom olarak birleştirilmiş kontrol transkript dosyaları olarak birleştirilmiş trombin transkript dosyaları kullanılarak Cuffdiff ile diferansiyel ifade test edin. Tablo biçiminde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Yine, ThosFPKM &lt;0.05 ve p&gt; E gen transkript 0.05 filtrelenir. Bu adımdan sonra, araştırmacılar UCSC Genom Tarayıcı web sitesi (için yeni rapor transkript bir listesini yüklemeyi tercih edebilirler <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> bir elle muayene ederek geçerliliğini doğrulamak için). </li><li> Yaratıcılık Pathway Analizi (IPA, değişik şekillerde ifade genlerin listeleri gönderin <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> trombin tedavi etkilenen genlerin ve yolların karakterizasyonu için). Bu adımda, müfettişler kuşak (kullanmayı tercih edebilir <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> görselleştirmek, yönetmenize yardımcı olmak için), Kol Düğmeleri RNA-seq çıkış irdeleme görevini yardım ve kolaylaştırmak için tasarlanmış bir R paketi, ve bir analiz Cuffdiff tarafından üretilen verinin her entegre. </li></ol> 4. Kantitatif Gerçek-zamanlı-Po tarafından RNA-seq Sonuçlar Validasyonulymerase Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) <ol><li> Kontrol ve trombin-işlenmiş HMVEC-LBL hücreleri, RNA kalite değerlendirmesi ve 1.6 Adımlar 1,4 açıklanan RNA miktarının toplam RNA izolasyonu gerçekleştirin. </li><li> Üreticinin talimatlarına (Invitrogen, 18080-051) takip Üst Simge III Üretim-Strand Sentez Sistemi RT Kitleri ile her bir örnek 1 mg total RNA, gelen tamamlayıcı DNA oluşturun. </li><li> CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor tespiti için Taqman Assay-on-Demand tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak Uygulamalı Biyosistem VIIa 7 Real-Time PCR Sistemi qRT-PCR analizi gerçekleştirin ilişkili faktör 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) ve β-aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Her numune toplam RNA 5 ng eşdeğer bir şablon vardı. DDCt yöntemiyle kantitatif ölçün ve β-aktin normalleştirmeniz. Her bir tahlil çoğaltır, en az üç biyolojik karşısında gerçekleştirildi. </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+pathway+analysis%3A+current+approaches+and+outstanding+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).</li>
<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Anahtar adımlar RNA Elleçleme: RNaz, hatta en yüksek kalitede RNA düşer dolayısıyla bakım RNA 10 izolasyonu, depolanması ve kullanılması sırasında alınmalıdır. Eldiven her zaman insan elinde bulunan RNaz tarafından kirlenmesini önlemek için giyilir. Eldiven, özellikle dokunma deri, kapı kolu ya da başka ortak yüzeyleri sonra, sık sık değiştirilmesi gerekir. Pipetler bir dizi çalışma RNA sadece adanmıştır edilmeli ve tüm ipuçları ve tüpler RNaz arındırılmış olmalıdır....

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reaktifler ve Ekipmanları </td><td width="85"> Şirket </td><td width="185"> Katalog numarası </td><td width="359"> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan Akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinde </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Bullet Takımı </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2, FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik içerir </td></tr><tr><td> Trombin </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kiti </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz-Zap </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA HazırlıkTakımı </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Boncuk </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Üstsimge Ters transkriptaz II </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Küme Nesil Takımı </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Phix Kontrol Kiti </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Döngü SBS Takımı </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> * HiScanSQ </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR makinesi - Viia7 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> Model # VIIA7 / Ekipman # 10631261 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Experion Sistemi </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer alternatif bir sistemi </td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Mikroplaka Spektrofotometre </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Santrıfüj - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Manyetik standı </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 96- </td><td> Genel Lab Tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anahtar Reaktifler ve Binbaşı E Tablo 3. Listequipment. *, Video, yerine HiScanSQ arasında HiSeq1000 gösterilmiştir. </td></tr></tbody></table>

rna-seq trombin-tedavi içinde transcriptomes analizi ve kontrol İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

MRNA seviyelerinin ölçümü yoluyla hücrelerinde gen ekspresyonu karakterizasyonu hücrenin transkripsiyonel makine harici sinyaller (örneğin uyuşturucu tedavisi), veya nasıl hücreler sağlıklı bir devlet ve bir hastalıklı durum arasındaki farklılıklar nasıl etkilendiğini belirlemede yararlı bir araçtır. Nesil DNA dizileme teknolojinin gelişi ve sürekli arıtma ile, RNA-sıralama (RNA-seq), transkript bütün türlerin kataloğa tüm ifade genlerin transkripsiyonel yapısını belirlemek ve ölçmek için transcriptome analiz giderek daha popüler bir yöntem haline gelmiştir belirli bir hücre, doku veya organizma 1,2 transkript toplam grubu değişen ifade seviyeleri. RNA-seq kademeli olarak tam bir profil transcriptome avantajlara sahiptir çünkü, transcriptome analiz için tercih edilen bir yöntem olarak DNA mikroarrayleri yerine bir tür dijital veri (herhangi bir transkript kopya sayısı) sağlayan ve bilinen herhangi bir genomik istif güvenmek içince 3. Burada, biz veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq uygulamak için tam ve ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol başlıklı bizim son yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır başarılı insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin ilk tam transcriptome analizi icra ettiği 4 &quot;RNA-seq Trombin ile Tedavi İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde Genlerin ve Bunların İzoformlar, Romanı transcriptome ortaya çıkarır&quot; trombin RNA-seq kullanarak tedavi. Bu inflamatuvar koşulları, kanser, diyabet ve koroner kalp hastalığı patogenezinde trombin aracılı endotel disfonksiyonu moleküler mekanizmaları içgörüler kazanmak için daha sonraki denemeler için görülmemiş kaynaklar vermiştir ve bu hastalıklar için tedavi hedefleri için potansiyel yeni müşteriler sağlar. Bu protokolün açıklayıcı metindört bölüme ayrılmıştır. Birinci bölüm trombin ve RNA izolasyonu, kalite ve miktar ile analiz insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin tedavisi açıklanmaktadır. İkinci bölümde kütüphane oluşturma ve sıralama açıklar. Üçüncü kısım veri analizi açıklanmıştır. Dördüncü bölüm, bir RT-PCR testi doğrulama açıklanmaktadır. Birkaç kilit adımlar Temsilcisi sonuçları görüntülenir. Önemli adımlar başarı artırmak için Yararlı ipuçları veya önlem Tartışma bölümünde verilmiştir. Bu protokol trombin ile tedavi insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde kullanmasına rağmen, memeli ve non-memeli hücrelerinde hem de farklı uyaranlara veya inhibitörleri, ya da sağlıklı bir devlet arasındaki hücre veya dokularda transcriptomes karşılaştırmak ile tedavi dokularda profili transcriptomes jeneralize olabilir ve bir hastalık durumu.

Adım 1 için: 28s: 18s oranı geleneksel RNA bozulmanın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. İdeal olarak, 28s tepe 18s bant (2 oranında) yaklaşık iki katı alan olmalıdır, ancak bu ideal oran genellikle uygulamada görülmemektedir. Ayrıca, 28s: spektrofotometrik yöntem ile elde edilen 18s oranları RNA bozulma miktarı göz ardı edebilir. Daha doğru bir şekilde parçalanması ve bu nedenle RNA örnek kalitesini ölçmek için, Experion sistem, bir RNA kalite göstergesi (RQI) sayısını hesaplar. RQI algoritması st...

Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Bu prosedürün genel amacı, transkriptomları profillemek için güçlü bir yeni nesil DNA dizileme teknolojisi olan RNA-Seq'i uygulamak için eksiksiz ve ayrıntılı bir süreç sunmaktır. Bu, ilk olarak trombin tedavisi olsun veya olmasın insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinden toplam RNA'nın izole edilmesi ve RNA kalitesinin kontrol edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bu RNA örneklerinden DNA kütüphaneleri oluşturmaktır.Cbot cihazını kullanarak küme oluşturmayı kolaylaştırın ve HighSeq 1000'de DNA dizileme görevini gerçekleştirin. Daha sonra, diferansiyel olarak ifade edilen gen transkriptlerini nihai olarak tanımlamak ve görüntülemek için veri analizi yapılır. Son adım, RN aeq sonuçlarını RT TP CR ile doğrulamaktır. IC'nin transkriptom analizi için bir DNA mikro dizisi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, IC'nin tam bir transkriptomun profilini çıkarabilmesi, dijital türde veri sağlayabilmesi ve hücrelerde gen ekspresyonunun bilinen herhangi bir genomik izasyonuna dayanmamasıdır.MRA seviyesinin ölçülmesi, hücrenin mekanizmasının transkripsiyonunun dış sinyallerden nasıl etkilendiğini veya hücrelerin bir sağlık durumu ile bir hastalık durumu arasında nasıl farklılık

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Eğer RNA arıtma ile birlikte ribozomlarda içinde gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) EC özgü genetik etiketi ile doğrudan fare beyin, akciğer ve kalp dokularda vasküler endotel hücrelerden (ECS) ribosome bağlı mRNA arındırmak için bir yaklaşım sunuyoruz .

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Protokol, endotel hücrelerinin insan mezenterik arterinden izolasyonunu, kültürünü ve profillemesini tanımlar. Ek olarak, insan arterini mekansal transkriptomik için hazırlamak için bir yöntem sağlanmıştır. İzole hücreler üzerinde proteomik, transkriptomik ve fonksiyonel testler yapılabilir. Bu protokol, herhangi bir orta veya büyük boyutlu arter için yeniden kullanılabilir.

Transkriptom Düzeyinde İnsan Primer Mezenterik Arteriyel Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Profillenmesi

Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması

Bu protokol, kalsifikasyon olmuş damar örnekleri için adım adım bir iş akışı içerir: doku işleme, kalsifikasyon giderilmesi, RNA doğrulama, kalsifikasyon seviyesi tespiti ve Nanostring GeoMx Dijital Mekansal Profiler (DSP) üzerinde ilgi alanı seçim stratejileri. Amaç, güvenilir mekansal transkriptomik analiz için damar dokusu morfolojisi ve RNA'nın korunmasına yönelik kapsamlı bir yöntem sunmaktır.

Dijital Mekansal Profilleme için Korunmuş Morfoloji ve RNA ile Kalsifikasyon Arter Hazırlanması ve İşleme

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Öğrenin, RNA-seq ile insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde trombin tedavisinin transkriptom profilini nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, RNA izolasyonu, kütüphane oluşturma ve veri analizi adımlarını kapsar.

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

Daha fazla video keşfet