RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

Bu prosedürün genel amacı, transkriptomları profillemek için güçlü bir yeni nesil DNA dizileme teknolojisi olan RNA-Seq'i uygulamak için eksiksiz ve ayrıntılı bir süreç sunmaktır. Bu, ilk olarak trombin tedavisi olsun veya olmasın insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinden toplam RNA'nın izole edilmesi ve RNA kalitesinin kontrol edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bu RNA örneklerinden DNA kütüphaneleri oluşturmaktır.

Cbot cihazını kullanarak küme oluşturmayı kolaylaştırın ve HighSeq 1000'de DNA dizileme görevini gerçekleştirin. Daha sonra, diferansiyel olarak ifade edilen gen transkriptlerini nihai olarak tanımlamak ve görüntülemek için veri analizi yapılır. Son adım, RN aeq sonuçlarını RT TP CR ile doğrulamaktır. IC'nin transkriptom analizi için bir DNA mikro dizisi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, IC'nin tam bir transkriptomun profilini çıkarabilmesi, dijital türde veri sağlayabilmesi ve hücrelerde gen ekspresyonunun bilinen herhangi bir genomik izasyonuna dayanmamasıdır.

MRA seviyesinin ölçülmesi, hücrenin mekanizmasının transkripsiyonunun dış sinyallerden nasıl etkilendiğini veya hücrelerin bir sağlık durumu ile bir hastalık durumu arasında nasıl farklılık gösterdiğini belirlemede yararlı bir araçtır. Bu protokolde, trobin ile tedavi edilen transkriptomların IC analizini ve insan pulmoner mikrovasküler Indo syn hücrelerinin kontrolünü göstereceğiz. Bu protokol, popüler bir yeni nesil DNA dizileme platformu olan High SEQ 1000'de RNA-Seq kullanarak trombin ile tedavi edilen insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin ilk tam transkriptom analizini başarıyla gerçekleştirdiğimiz yakın zamanda yayınlanan çalışmamıza dayanmaktadır.Bayan

Suman Shaha, yüksek SEQ 1000 cihazında DNA diziliminin yanı sıra R-T-P-C-R doğrulama deneyini gösterecektir. VS yedi R-T-P-C-R sistemini kullanan Dr.Denova, insan pulmoner, mikrovasküler endotel hücrelerinin trombin tedavisini ve toplam hücre RNA izolasyonunu gösterecek.Bayan Margaret Gibson, RNA kalitesini ve DNA kütüphanesini kontrol etmenin yanı sıra cbot üzerinde küme oluşturmayı kontrol etmek için Experian sistemini gösterecek.

Ve Dr.Dimitri Gregor veri analizini gösterecek Bu protokol kültürünü başlatmak için. İnsan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri,% 90 ile% 100 arasında, EGM'de% 5 FBS büyüme faktörleri ve antibiyotikler içeren iki ortamda altı oyuklu plakalarda birleşir. Trombin tedavisinden 30 dakika önce besiyerini açlık besiyerine değiştirin.

30 dakika sonra, hücreleri mililitre, trombin başına 0.05 birim ile tedavi edin veya kontrol olarak tedavi edilmeden bırakın. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte altı saat inkübe edin. Altı saatlik bir tedavinin ardından.

Üreticinin talimatlarına göre Nirvana kitini kullanarak tedavi edilen ve kontrol edilen hücrelerden toplam RNA'yı izole edin. Experian otomatik elektroforez istasyonundaki standart protokole göre bir Experian standart anlamda ökaryotik, RNA çipi ile RNA'nın kalitesini değerlendirin. Son olarak, kütüphane yapımı için standart bir spektro fotometrik yöntem kullanarak RNA'yı ölçün.

Kütüphaneyi oluşturmak için başlangıç materyali olarak numune başına bir mikrogram yüksek kaliteli toplam RNA kullanın. Üreticinin standart protokolünü izleyin. Bu protokolde Mr.mRNA içeren iki tur poli seçimi yapılır.

RNA dizilimimizi en aza indirgemek için RNA'mızı çıkarmak için, bir Experian DNA bir K çipi kullanarak kitaplıkların kalitesini değerlendirin. Experian otomatik elektroforez istasyonundaki standart protokole göre. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak kitaplığı nicelleştirin.

Yazılı protokolde açıklandığı gibi kısaltılmış Q-R-T-P-C-R. Bu videoya eşlik eden Q-R-T-P-C-R'ı siber yeşil MM protokolüne göre çalıştırın ve her kitaplığın orijinal stok konsantrasyonunu hesaplayın. Kütüphane stoklarını 10 nanomolar'a seyreltin ve 20 santigrat derecede saklayın.

Bir akış hücresini kümelemeye hazır olduğunuzda, cbot reaktif plakasını bir su banyosunda çözdürün. CBOT, küme oluşturma sürecini kolaylaştırmak için kullanılan bir araçtır. Cbot cihazını yıkadıktan sonra, önce 13 mikrolitre bir XTE ve altı mikrolitre 10 nanomolar'ı birleştirerek kitaplıkları denatüre edin.

Daha sonra her tüpün yan tarafına, bir normal sodyum hidroksitten bir mikrolitre ekleyin, tüpleri döndürün, aşağı doğru döndürün ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından denatüre edilmiş kütüphaneleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, 996 mikrolitre tampon ve 4.0 mikrolitre Denatüre kütüphaneyi 12 piko molar nihai konsantrasyon için birleştirerek Denatüre kütüphaneleri önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu ile seyreltin.

Denatüre edilmiş seyreltilmiş kitaplıkları üzerine yerleştirin. Ardından, tüm reaktiflerin çözüldüğünden emin olarak kbot plakasının her bir tüp sırasını ters çevirin. Plakayı aşağı döndürdükten sonra, folyo contayı sodyum hidroksit tüplerinin sırasından çıkarın ve cbot alikotuna yükleyin.

120 mikrolitre seyreltilmiş denatüre edilmiş kütüphaneler, birden sekize kadar etiketlenmiş bir şerit tüpe. Kontrolde bir artış olarak her tüpe 1.2 mikrolitre seyreltilmiş denatüre PHI X kontrol kütüphanesi ekleyin. Tüpleri girdapladıktan ve döndürdükten sonra, bir numaralı tüp sağa bakacak şekilde doğru yönde kbota yükleyin.

Cbot'a bir akış hücresi ve manifold yükleyin. Akış denetimini tamamlayın ve kümeleme çalıştırmasına başlayın. Çalışma tamamlandıktan sonra, tüm şeritlerde reaktif dağıtımını kontrol edin.

Herhangi bir anormalliği not edin. Ya sıralama çalışmasını hemen başlatın ya da akış hücresini sağlanan tüpte dört santigrat derecede saklayın. Sıralamaya başlamak için.

Sıralamayı sentez reaktifleri ile çözün. Reaktifleri, diğer reaktiflere dokunmadığınızdan emin olarak reaktif tepsilerindeki uygun noktalara yükleyin. Bölünme karışımına dokunduktan sonra, dizileme olmayan bir akış hücresi kullanarak, reaktif hatlarını iki kez iyice temizleyin, sıralama akış hücresini %70 etanol ve Kim mendilleri, ardından %70 etanol ve lens kağıdı ile temizleyin.

Akış hücresinde herhangi bir çizgi olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse yeniden temizleyin. Akış hücresini sıralayıcıya yükleyin ve manifoldlar ile akış hücresi arasındaki sızdırmazlığın sıkı olduğundan emin olmak için bir akış kontrolü yapın. Sıralama çalıştırmasını başlatın.

Koşu sırasında kullanılabilir hale gelen kalite ölçümlerini değerlendirin Çalışma boyunca yoğunluğu izleyin. 101 döngü tamamlandıktan sonra. İkinci okumayı tamamlamak için geri dönüş kimyası gerçekleştirin.

İlk baba eşleştirilmiş ve reaktifler ve ikinci okuma birleştirme tamponu. Ardından reaktifleri yükleyin, sıralamaya devam edin, değerlendirmeyi çalıştırın. İkinci olarak, çalışma ilerledikçe yoğunluk Q3'ü ve diğer kalite ölçümlerini okuyun.

Veri analizine başlamak için, temel çağrı dosyalarını FAST Q dosyalarına dönüştürmek için casyoksa'nın en son sürümünü kullanın. Tek bir hızlı Q dosyasının oluşturulmasını sağlamak için hızlı Q küme sayısını sıfıra ayarlama. Her örnek için, aşağı akış analizi için hızlı Q dosyalarının sıkıştırmasını açın.

SAM biçiminde işlem sonrası hizalamalar için çeşitli yardımcı programlar uygulayan ultra yüksek verimli kısa okuma ve SAM araçlarını kullanarak RNA-Seq okumalarını memeli boyutu genomlarına hizalayan üst şapkanın en son sürümünü kullanarak eşleştirme ve hizalama gerçekleştirin. Referans insan transkriptomu, kol düğmeleri yazılım paketinin program manşet diff parçası kullanılarak parça çözülmemiş olarak kitaplık türü seçeneği de dahil olmak üzere, tüm varsayılan parametre ayarlarının çalıştırılan üst şapkadaki I genomlarından indirilebilir. Trombin ile tedavi edilen hücreleri kontrol hücreleriyle karşılaştırın.

Trombin ile tedavi edilen hücrelerde diferansiyel olarak ifade edilen gen transkriptlerini insan referans transkriptomuna dayalı olarak tarayın. Ardından, sonucu tablo biçiminde görselleştirmek için bir elektronik tablo kullanın. Bu durumda, tüm varsayılan parametre ayarları kullanıldı ve FPKM'si 0.05'ten küçük ve p 0.05'ten büyük olan gen transkriptleri, yeni izoformların referans olmadan çalışan kol bağlantılarını tespit etmek için filtrelendi.

Transkriptom: manşet karşılaştırma kullanarak örnek transkript dosyalarını referans genomla karşılaştırın. Bir analiz için referans genom olarak kombine trombin transkript dosyalarını ve ikinci bir analiz için referans genom olarak kombine kontrol transkript dosyalarını kullanarak diferansiyel ifadeyi manşet diferansiyel farkıyla test edin, yine sonucu tablo formatında görselleştirmek için bir elektronik tablo kullanın. Daha önce olduğu gibi, FPKM'si 0.05'ten küçük ve p 0.05'ten büyük olan gen transkriptleri filtrelendi.

Bu adımdan sonra, araştırmacılar, manuel bir inceleme ile geçerliliklerini doğrulamak için yeni bildirilen transkriptlerin bir listesini uc SC genom tarayıcı web sitesine yüklemeyi seçebilirler. Diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin listeleri, trombin tedavisinden etkilenen genlerin ve yolakların karakterizasyonu için yaratıcılık yolu analizine de sunulabilir. Bu adımda, araştırmacılar, bir manşet fark analizi tarafından üretilen tüm verileri yönetmeye, görselleştirmeye ve entegre etmeye yardımcı olmak için kol düğmeleri RN aeq çıktısını analiz etme görevine yardımcı olmak ve basitleştirmek için tasarlanmış bir R paketi olan cummerbund'u kullanmayı tercih edebilirler.

RN aeq sonuçlarının doğrulanması daha sonra önce Q-R-T-P-C-R ile gerçekleştirilir, kontrol ve trombin ile tedavi edilen insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinden toplam RNA izolasyonu, RNA kalite değerlendirmesi ve RNA kantifikasyonu gerçekleştirilir. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek üst simge üç birinci iplikli sentez sistemi rt ile her numunenin bir mikrogramı toplam RNA'sından ücretsiz DNA oluşturun. Son olarak, bu videoya eşlik eden yazılı protokolde listelenen isteğe bağlı TAC MAN testini kullanarak yedi gerçek zamanlı PCR sistemi üzerinde Q-R-T-P-C-R analizi yapın ve burada açıklandığı gibi kantitasyonu ölçün.

28 s ila 18 S oranı geleneksel olarak RNA bozunmasının bir göstergesi olarak kullanılır Bozunmayı daha doğru bir şekilde ölçmek için deneyim sistemi bir RNA kalite göstergesi veya RQI numarası hesaplar. RQI algoritması, RNA örneklerinin elektroferogramını bir dizi standartlaştırılmış bozulmuş RNA örneğinden alınan verilerle karşılaştırır ve otomatik olarak 10 ile bir arasında bir sayı döndürür. RNA örneğinin RQI'si en az yedi ve ideal olarak sekizden büyük olmalıdır.

Bu Experian sonuçları, RQI'si 8.4 olan yüksek kaliteli bir RNA örneğini gösterir. Kitaplıklar, yüksek kaliteli bir kitaplık için Experian sonuçlarının bu şekilde gösterildiği gibi yaklaşık 250 ila 300 temel çiftte bir geniş banda sahip olmalıdır. Burada, standart eğri örneklerinin ve bir bilinmeyen örneğin Q-R-T-P-C-R sonuçları gösterilmektedir.

Sıralama çalışmasının ilerleyişi ve kalitesi, çalışma boyunca sürekli olarak gözlemlenmelidir. Bu şekil, ilk döngü görüntüleme adımı sırasında uygun küme yoğunluğunu göstermektedir. Bu, koşunun ilk göstergesidir.

Kaliteli kümeler parlak ve odaklanmış olmalıdır. İlk döngünün tamamlanmasından sonra oluşturulan ilk temel raporun bir örneği gösterilmektedir. Bu noktada tahmini küme yoğunluk yoğunluk seviyelerini ve odak kalitesini değerlendirmek önemlidir.

Dördüncü döngüden sonraki bir sonraki kalite kontrol noktası burada gösterilmiştir. Bu, her şerit için mutlak küme yoğunluğunu gösterir. Küme yoğunluğu, döngü 13'ten sonra milimetre kare başına 850 K'nin üzerinde olmamalıdır.

Aşama ve aşama öncesi istatistikler hesaplanır. Tipik sayılar 0,1 ile 0,25 arasındadır. Ana kalite değerlendirmesi, çeşitli kalite ölçütlerinin hesaplandığı 24. döngüden sonra mümkündür.

3. çeyreğin üzerindeki okumaların yüzdesi, tabana olan güvenin bir ölçüsüdür. Q puanı üç olan bir okuma çağırmak, temel çağrının yanlış olma ihtimalinin 1000'de bir olduğu anlamına gelir. Çalışma ilerledikçe Q puanları azalır, ancak okumaların %95'inden daha büyük bir oranla veya Q3'ü aşarak başlamalıdır. Filtre veya pf'den geçen kümeler, gerçek dizi verilerinin alınacağı kümelerdir.

İdeal olarak, bu %85'in üzerinde olmalıdır Küme pf, fazlandırma, ön faz yoğunluğu gibi birçok faktöre dayanır ve çalışma ilerledikçe Q3.It değişmeyecektir. Hizalanmış yüzde, gerçek zamanlı olarak FI x genomuna hizalanan okumaların bir ölçüsüdür. Örnek kitaplıklara yaklaşık %1 FI x kitaplığı eklendiğinden, hizalanan yüzde 0,5 ile bir arasında olmalıdır.

Bu istatistik, kütüphane içeriğinin kümeler tarafından iyi temsil edildiğini ve burada listelenen küme oluşturma yanlılığının olmadığını, hem kontrol hem de trombin ile tedavi edilen insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde eksprese edilen genler ve izoformlar olduğunu göstermektedir. Özellikle, RN aeq'nun gücünü gösteren yaklaşık 26.000 yeni izoform tespit edilmiştir. Bilinmeyen RNA'ları tanımlayabilir.

Alternatif olarak, mikroarray teknikleriyle tespit edilemeyen eklenmiş transkriptler ve alternatif promotör kullanımı. RNA-Seq ayrıca, alternatif bir yaklaşım kullanarak RNA-Seq sonuçlarını doğrulamak için yanlış, niceliksel olarak ölçülmüş veya mikrodiziler tarafından tespit edilmemiş daha az miktarda bulunan transkriptleri de ölçebilir. A-Q-R-T-P-C-R deneyi, RNA-Seq verilerinde üç farklı geni test etmek için yapıldı: TR, biri 7.96 kat kendi kendine yukarı regüle edildi.

Q-R-T-P-C-R verilerinde biri 1.16 kat aşağı regüle edildi ve teşekkür edilen iki tanesi 1.70 kat aşağı regüle edildi, bu karşılık gelen sayılar sırasıyla artı 7.25 kat eksi 1.15 kat ve eksi 2.07 kat. RNA-Seq ve Q-R-T-P-C-R ile test edilen bu üç genin sonuçları, RNA-Seq sonuçlarını doğrulayan iyi bir uyum içindedir. Bu protokol, üst düzey hücrelerde trobin ile tedavi edilen insan pulmoner mikrovasküler bir zaman noktasında IC'ye özgüdür, ancak çok zamanlı bir çalışmaya veya farklı uyaranlar veya inhibitörlerle tedavi edilen diğer hücre dokularında yapılan çalışmalara veya hücre veya dokulardaki transkriptomların sağlıklı bir durum ile hastalık durumu arasında karşılaştırılmasına kolayca uyarlanabilir.

Yüksek SQ 1000'e özgü olsa da, bu protokol HighSeq ailesinden herhangi birine veya genom analizörüne uygulanabilir. Küme oluşturma adımlarında ve sıralama reaktiflerinde küçük değişiklikler yapan iki cihaz. Katı seriler gibi diğer yeni nesil DNA dizileme platformları.

GS sistemleri ve ortaya çıkan bazı yeni sistemler de RNA-Seq amacıyla kullanılmaktadır. Kütüphane oluşturma ve dizileme prosedürleri biraz farklı olsa da, bu protokolde sunulan RNA işleme ipuçları, veri analizi bölümleri ve R-T-P-C-R ile doğrulama, RNA-Seq uygulamaları için referans değeri olabilir.