Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Trombozun biyomekanik özelliklerini yeterince yakalayabilen ve insanlarda protrombotik anormallikleri tespit edebilen yeni bir yöntem geliştirdik. Başlamak için, bir silikon levha kullanarak tasarıma dayalı standart fotolitografi ile SU8 fotorezist ana kalıbı üretin ve ana kalıbı 15 santimetrlik Petri kabının altına bantla sabitleyin. Polidimetilsiloksan (PDMS) karışımını, silikon elastomer setinden prepolimer baz ve kürleme maddesini 10'a 1 ağırlık oranında karıştırarak hazırlayın.

PDMS karışımını ana kalıbın üzerine dök. Daha sonra PDMS karışımını içeren plakayı vakum kurutucuya yerleştirerek gazdan çıkarabilirsiniz. PDMS karışımını iki saat boyunca 75 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirerek termal olarak kürleyin.

Numuneyi kuluçka makinesinden çıkardıktan sonra, ana kalıptan kürlenmiş PDMS'yi dikkatlice kesin ve kürlenmiş PDMS'yi ayrı çip birimlerine ayırın. Bir prob iğnesi kullanarak, belirlenen yerlerde delikler açarak giriş ve çıkış oluşturuldu. Kimyasal bir davlumbonda, cam sürgüleri temizlemek ve kurutmak için %75 etanollü ıslak bir iş mendiliyle temizleyin.

Sonrasında, yüksek frekanslı bir jeneratör kullanılarak, cam slaytları 30 saniye, PDMS çiplerini ise 20 saniye boyunca işleyin. Her çipi cam sürgüyle hizalayıp parçayı cam sürgü yüzeyine nazikçe bastırarak yapıştırın. Şimdi cihazları 150 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir fırına 15 dakika boyunca koyarak termal olarak bağlayın.

Birleştirdikten sonra cihazları oda sıcaklığında, tozsuz koşullarda saklayın. Sonra, bir pencer kullanarak, prob iğnelerinin plastik kısmını çıkarır ve metal tüpleri 90 dereceye doğru bükerek mikrofluidik cihazlar için konnektörler oluşturulur. Fibrinojen ve gerekli antikorları Alexa Fluor ile konjuge etmek için reaksiyonlar kurulduktan sonra, depolama tamponu çıkarılmak için arıtma kolonları 1,100 G ile iki dakika boyunca santrifüj edilir.

Akış atıldıktan sonra, reaksiyon çözeltisi uyumlu bir toplama şişesine monte edilmiş arıtma kolonuna yüklenir ve gerekli karışımı toplamak için 1.100 G boyunca beş dakika boyunca santrifüj yapar. Spektrofotometre kullanarak, protein ve boya sinyalinin emilimini ölçün. Protein konsantrasyonunu ve floresans-protein molar oranını hesaplayın.

Boyaları karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında sakla. Tyrode tamponuna heparin ekleyin, toplanacak her 10 mililitre kanda mililitre başına 0,32 birim nihai konsantrasyon elde edin ve şırıngayı pH 7,4'te 500 mikrolitre Tyrode tamponu aspirasyonuna hazırlayın. Kanı heparin içeren şırıngada venipunkturla topladıktan sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 37 derece Celsius'ta tutulur.

Von Willebrand faktör monomerini PBS içinde mililitrede iki mikrograma kadar seyreltirin. Mikrofluidik cihazları seyreltilmiş von Willebrand faktör monomeriyle önceden kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın. Şimdi kan örneğini floresan sensör seti 1 veya 2 setiyle oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.

Sonra, giriş ve çıkış konnektörleri ile boru ile mikrofluidik bir cihaz bağlayın. Giriş konnektörünün diğer ucunu PBS içeren boruya bağlayın, ardından çıkış konnektörünün diğer ucunu bir şırıngaya bağlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına ve mikrofluidik cihazı ters bir mikroskopa takın.

Mikroskop aşamasını manuel olarak yönlendirerek stenoz bölgesini tespit edin. Mikrofluidik kanal ve boru PBS ile şırınga pompası ile dakikada 0,5 mililitre akış hızında doldurun. Stenoz bölgesinde hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için cihazı kontrol edin.

Giriş borusunu kan örneğine bağlayın ve kan örneğini mikrofluidik kanal üzerinden şırınga pompası ile dakikada 0,018 mililitre akış hızında perfüze edin. Ters bir mikroskopta, yazılımdaki her floresan kanalı için pozlama süresi ve kazancı ayarlanır. Dört kanal arasında dönüşümlü olarak gerçek zamanlı çok renkli floresan görüntüleme yapın ve her seferinde bir floro-4'ü heyecanlandırın.

Odak düzlemini trombusa ayarlayın ve stenoz bölgesinde floresan sinyalleri 15 ila 30 dakika kaydedin. Veri analizi için, veri dosyasını ImageJ sürüm 1.53 ile açın. Trombüsün konturunu belirlemek için SZ 22 fit C kanalını kullanın.

Sonra çokgen seçimleri kullanarak trombun bölgesini kabaca seçer. Her kanal için, arka plan sinyalini görüntü, Ayar ve ardından Eşik seçerek ortadan kaldırın. Son olarak, Analiz Et ve Ölçüt seçeneklerini seçerek trombus içindeki alanı ve ortalama sinyal yoğunluğunu ölçün.

Temsilci anlık görüntülerde, trombositler, fibrinojen, von Willebrand faktörü ve P-selektin ile stenotik kanalda trombositler, fibrinojen, von Willebrand faktörü ve P-selektin sensör seti 1 ile görselleştirilmiş, trombositler, fosfatidilserin, E-pozitif integrin alfa IIb beta 3, sensör seti 2 kullanılarak görselleştirilmiş trombositler, fibrinojen, von Willebrand faktörü ve P-selektin ile görselleştirilmiştir. Tek bir floresans kanalı görüntüsü, tromb alanı seçilerek, arka plan sinyali çıkarılarak ve sinyal alanı ile ortalama parlaklık ölçülerek nicel analiz yapıldı. Zaman içinde floresan sinyal yoğunluğunun sürekli analizi, trombus oluşumu sırasında trombosit birikimi için sinyal ile zaman eğrisi oluşturdu.

Her zaman noktası için, sensör seti birindeki dört biyobelirteci ve sensör seti iki'deki dört biyobelirteç için toplam sinyal yoğunlukları elde edildi. Tromb boyutu hesaplandı ve yedi boyutlu bir tromb profili oluşturuldu. Şu anda insan hastaların protrombotik eğilimini değerlendirmek için bir biyoanaliz mevcut değildir ve çalışmalarımız bu boşluğu doldurmaya çalışıyor.

Kan örneklerinin biyomekanik aktivitesini tespit ederek, testimiz deneklerin protrombotik özelliklerini kapsamlı şekilde değerlendirebilir. Testimiz, hastalarda protrombotik eğilimi tespit etmek için klinik bir teste dönüştürülebilir ve ayrıca yeni nesil antitrombotik ilaçların taramasında da kullanılabilir.