Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform
9 Ocak 2026
Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.
Trombozun biyomekanik özelliklerini yeterince yakalayabilen ve insanlarda protrombotik anormallikleri tespit edebilen yeni bir yöntem geliştirdik. Başlamak için, bir silikon levha kullanarak tasarıma dayalı standart fotolitografi ile SU8 fotorezist ana kalıbı üretin ve ana kalıbı 15 santimetrlik Petri kabının altına bantla sabitleyin. Polidimetilsiloksan (PDMS) karışımını, silikon elastomer setinden prepolimer baz ve kürleme maddesini 10'a 1 ağırlık oranında karıştırarak hazırlayın.
PDMS karışımını ana kalıbın üzerine dök. Daha sonra PDMS karışımını içeren plakayı vakum kurutucuya yerleştirerek gazdan çıkarabilirsiniz. PDMS karışımını iki saat boyunca 75 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirerek termal olarak kürleyin.
Numuneyi kuluçka makinesinden çıkardıktan sonra, ana kalıptan kürlenmiş PDMS'yi dikkatlice kesin ve kürlenmiş PDMS'yi ayrı çip birimlerine ayırın. Bir prob iğnesi kullanarak, belirlenen yerlerde delikler açarak giriş ve çıkış oluşturuldu. Kimyasal bir davlumbonda, cam sürgüleri temizlemek ve kurutmak için %75 etanollü ıslak bir iş mendiliyle temizleyin.
Sonrasında, yüksek frekanslı bir jeneratör kullanılarak, cam slaytları 30 saniye, PDMS çiplerini ise 20 saniye boyunca işleyin. Her çipi cam sürgüyle hizalayıp parçayı cam sürgü yüzeyine nazikçe bastırarak yapıştırın. Şimdi cihazları 150 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir fırına 15 dakika boyunca koyarak termal olarak bağlayın.
Birleştirdikten sonra cihazları oda sıcaklığında, tozsuz koşullarda saklayın. Sonra, bir pencer kullanarak, prob iğnelerinin plastik kısmını çıkarır ve metal tüpleri 90 dereceye doğru bükerek mikrofluidik cihazlar için konnektörler oluşturulur. Fibrinojen ve gerekli antikorları Alexa Fluor ile konjuge etmek için reaksiyonlar kurulduktan sonra, depolama tamponu çıkarılmak için arıtma kolonları 1,100 G ile iki dakika boyunca santrifüj edilir.
Akış atıldıktan sonra, reaksiyon çözeltisi uyumlu bir toplama şişesine monte edilmiş arıtma kolonuna yüklenir ve gerekli karışımı toplamak için 1.100 G boyunca beş dakika boyunca santrifüj yapar. Spektrofotometre kullanarak, protein ve boya sinyalinin emilimini ölçün. Protein konsantrasyonunu ve floresans-protein molar oranını hesaplayın.
Boyaları karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında sakla. Tyrode tamponuna heparin ekleyin, toplanacak her 10 mililitre kanda mililitre başına 0,32 birim nihai konsantrasyon elde edin ve şırıngayı pH 7,4'te 500 mikrolitre Tyrode tamponu aspirasyonuna hazırlayın. Kanı heparin içeren şırıngada venipunkturla topladıktan sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 37 derece Celsius'ta tutulur.
Von Willebrand faktör monomerini PBS içinde mililitrede iki mikrograma kadar seyreltirin. Mikrofluidik cihazları seyreltilmiş von Willebrand faktör monomeriyle önceden kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın. Şimdi kan örneğini floresan sensör seti 1 veya 2 setiyle oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
Sonra, giriş ve çıkış konnektörleri ile boru ile mikrofluidik bir cihaz bağlayın. Giriş konnektörünün diğer ucunu PBS içeren boruya bağlayın, ardından çıkış konnektörünün diğer ucunu bir şırıngaya bağlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına ve mikrofluidik cihazı ters bir mikroskopa takın.
Mikroskop aşamasını manuel olarak yönlendirerek stenoz bölgesini tespit edin. Mikrofluidik kanal ve boru PBS ile şırınga pompası ile dakikada 0,5 mililitre akış hızında doldurun. Stenoz bölgesinde hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için cihazı kontrol edin.
Giriş borusunu kan örneğine bağlayın ve kan örneğini mikrofluidik kanal üzerinden şırınga pompası ile dakikada 0,018 mililitre akış hızında perfüze edin. Ters bir mikroskopta, yazılımdaki her floresan kanalı için pozlama süresi ve kazancı ayarlanır. Dört kanal arasında dönüşümlü olarak gerçek zamanlı çok renkli floresan görüntüleme yapın ve her seferinde bir floro-4'ü heyecanlandırın.
Odak düzlemini trombusa ayarlayın ve stenoz bölgesinde floresan sinyalleri 15 ila 30 dakika kaydedin. Veri analizi için, veri dosyasını ImageJ sürüm 1.53 ile açın. Trombüsün konturunu belirlemek için SZ 22 fit C kanalını kullanın.
Sonra çokgen seçimleri kullanarak trombun bölgesini kabaca seçer. Her kanal için, arka plan sinyalini görüntü, Ayar ve ardından Eşik seçerek ortadan kaldırın. Son olarak, Analiz Et ve Ölçüt seçeneklerini seçerek trombus içindeki alanı ve ortalama sinyal yoğunluğunu ölçün.
Temsilci anlık görüntülerde, trombositler, fibrinojen, von Willebrand faktörü ve P-selektin ile stenotik kanalda trombositler, fibrinojen, von Willebrand faktörü ve P-selektin sensör seti 1 ile görselleştirilmiş, trombositler, fosfatidilserin, E-pozitif integrin alfa IIb beta 3, sensör seti 2 kullanılarak görselleştirilmiş trombositler, fibrinojen, von Willebrand faktörü ve P-selektin ile görselleştirilmiştir. Tek bir floresans kanalı görüntüsü, tromb alanı seçilerek, arka plan sinyali çıkarılarak ve sinyal alanı ile ortalama parlaklık ölçülerek nicel analiz yapıldı. Zaman içinde floresan sinyal yoğunluğunun sürekli analizi, trombus oluşumu sırasında trombosit birikimi için sinyal ile zaman eğrisi oluşturdu.
Her zaman noktası için, sensör seti birindeki dört biyobelirteci ve sensör seti iki'deki dört biyobelirteç için toplam sinyal yoğunlukları elde edildi. Tromb boyutu hesaplandı ve yedi boyutlu bir tromb profili oluşturuldu. Şu anda insan hastaların protrombotik eğilimini değerlendirmek için bir biyoanaliz mevcut değildir ve çalışmalarımız bu boşluğu doldurmaya çalışıyor.
Kan örneklerinin biyomekanik aktivitesini tespit ederek, testimiz deneklerin protrombotik özelliklerini kapsamlı şekilde değerlendirebilir. Testimiz, hastalarda protrombotik eğilimi tespit etmek için klinik bir teste dönüştürülebilir ve ayrıca yeni nesil antitrombotik ilaçların taramasında da kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
This article presents a novel thrombus profiling assay that integrates microfluidics with multi-color fluorescence imaging to comprehensively characterize biomechanical thrombogenesis. The method enables detailed analysis of thrombus formation under arterial shear conditions, providing seven distinct readouts related to thrombus size, composition, and platelet activation. This assay addresses the need for a robust bioassay to evaluate prothrombotic tendencies in humans and assess the efficacy of anti-thrombotic agents.
Key Study Components
Area of Science
- Hematology
- Bioengineering
- Microfluidics
- Thrombosis research
Background
- Thrombosis involves abnormal accumulation of platelets and clotting factors in blood vessels.
- Arterial thrombosis is often linked to elevated shear stress due to arterial stenosis.
- Biomechanical factors, such as blood flow, play a critical role in thrombus formation.
- Existing assays have not fully captured the biomechanical aspects of thrombogenesis.
Purpose of Study
- To develop an assay that profiles biomechanical thrombogenesis in detail.
- To enable comprehensive evaluation of prothrombotic tendencies in human blood samples.
- To provide a platform for testing anti-thrombotic agents and understanding arterial thrombosis mechanisms.
Methods Used
- Fabrication of microfluidic devices using PDMS and photolithography.
- Surface coating of microchannels with von Willebrand factor.
- Perfusion of heparinized human blood labeled with fluorescent biomarkers through stenotic microchannels.
- Real-time multi-color fluorescence imaging to monitor thrombus formation at the site of stenosis.
- Quantitative image analysis using ImageJ to measure thrombus area, biomarker signal intensity, and generate seven-dimensional thrombus profiles.
Main Results
- The assay successfully visualized and quantified thrombus formation under biomechanical (shear) conditions.
- Seven key parameters, including thrombus size and multiple biomarker signals, were measured simultaneously.
- Distinct profiles were generated for platelet accumulation, fibrinogen, von Willebrand factor, P-selectin, phosphatidylserine, and integrin activation.
- The method enabled continuous monitoring and quantitative analysis of thrombus development over time.
Conclusions
- This thrombus profiling assay fills a critical gap in evaluating biomechanical thrombogenesis.
- It offers a comprehensive tool for assessing prothrombotic risk and screening anti-thrombotic drugs.
- The approach can be further developed for clinical diagnostics and mechanistic studies of arterial thrombosis.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Biomechanical thrombogenesis presents a critical challenge in cardiovascular drug discovery, as traditional assays often fail to capture the complexity of thrombus formation under arterial shear conditions. The microfluidics-based thrombus profiling assay enables comprehensive, quantitative characterization of thrombus size, composition, and platelet activation, directly supporting predictive confidence in early-stage anti-thrombotic agent evaluation. This platform advances portfolio decision-making by providing mechanistic insights and robust risk assessment for candidate therapies targeting arterial thrombosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biomechanical pathways driving arterial thrombosis.
- Supports functional validation of targets involved in platelet activation and aggregation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying multiple thrombus biomarkers simultaneously.
- Improves predictive confidence for triaging anti-thrombotic candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for high-content screening of anti-thrombotic compounds.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative multi-parametric readouts.
- Enables scalable, platform-based evaluation of compound efficacy under physiologically relevant shear conditions.
- Supports reliable comparison of compound effects on thrombus formation and biomarker expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro thrombus formation with disease-relevant arterial shear profiles.
- Provides translational biomarker data for continuity from discovery to preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive thrombus profiling.
- Supports mechanistic studies of arterial thrombosis relevant to human pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker validation for anti-thrombotic drug development.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical triggers and pathways of thrombogenesis for hypothesis testing and biological de-risking.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a physiologically relevant context.
- Analytics: Generates seven-dimensional thrombus profiles, enabling robust statistical comparison across conditions and compounds.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant arterial thrombosis mechanisms for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic and imaging platform adaptable to diverse anti-thrombotic R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-thrombotic target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales multi-parametric thrombus analysis for cross-program comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-thrombotic candidates based on comprehensive mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized instrumentation, including microfabrication and multi-channel fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different blood sources or disease models to ensure translational relevance.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret multi-dimensional thrombus profiles.
