STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Bu prosedürün genel amacı, testislerde bulunan farklı hücre tiplerini ayırmaktır. İlk olarak, fareden karışık bir hücre popülasyonu toplayın. Testisler hücreleri ve BSA gradyanını stay put aparatına yükler.

Şimdi hücrelerin BSA gradyanı boyunca çökelmesine izin verin. Daha sonra fraksiyonları toplayın ve hücre bileşimine göre birleştirin. Sonuç olarak, kalış ile hız sedimantasyonu, boyut ve yoğunluktaki farklılıklara bağlı olarak farklı hücre tiplerini testislerden ayırmak için kullanılır.

Bu tekniğin gerçekler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, basit cam eşyalar ve yerçekimi kullanarak oldukça yüksek saflıkta büyük miktarlarda farklı hücre tiplerinin izole edilebilmesidir. İki, iki litrelik tüpleri ve hücre yükleme haznesini üst platforma sabitleyin ve hepsini tüp kelepçeli iki küçük boru parçasıyla bağlayın. Tüm tüpleri kapatın ve en sağdaki iki litrelik silindirdeki musluğu kapatın.

Hücre yükleme haznesine küçük bir karıştırma çubuğu ve en soldaki iki litrelik silindire daha büyük bir karıştırma çubuğu yerleştirin. Ardından iki litrelik çökeltme odasını platforma yerleştirin. Fraksiyon toplama sırasında sıvının girdaplanmasını ve hücre gradyanının bozulmasını önlemek için metal bölmeyi doğrudan çökeltme odasının altındaki açıklığın üzerine yerleştirin.

Şimdi kapağı çökeltme odasına koyun. Üç yollu durdurma musluğunun buzlu cam bağlantısına çok az miktarda vakum gresi uygulayın. Ardından, durdurma musluğunu çökeltme odasının dibine sıkıştırın, durdurma musluğunun buzlu cam bağlantılarını ve çökeltme odasını bağlayın.

Ardından, hücre yükleme odasını boru ile durdurma musluğunun sağ çıkışına bağlayın. Durdurma musluğunu kapatın, ardından hücre fraksiyonlama borusunu durdurma musluğunun sol çıkışına takın ve küçük boruyu en alttan sıkıştırın. % 2'lik BSA çözeltisini sol iki litrelik silindire dökün.

% 4 BSA çözeltisini sağ iki litrelik silindire dökün. Bu silindirleri birbirine bağlayan boruda büyük kabarcıklar olmadığından emin olun. Krebs tamponunu hücre yükleme odasına dökün ve bu odayı çökeltme odasına bağlayan boruyu doldurun.

Degradeyi bozabilecek büyük baloncuklar olmadığını doğrulayın. Gerekirse, kabarcıkları çıkarmak için hortumu hafifçe sıkın veya hafifçe vurun. Tüm kreplerin hücre odasında değil, tüpte olduğunu onaylayın.

Az miktarda Krebs tamponunun çökeltme odasına akmasına izin verin. Ardından neredeyse tüm tamponu hücre fraksiyonlama tüpüne boşaltın. Tüpü doldurmak ve büyük kabarcıkları gidermek için, fraksiyon toplayıcıyı doğrudan çökeltme odasının altına yerleştirin.

Tüm fraksiyon tüplerinin yerinde olduğunu kontrol edin ve kontaminasyonu önlemek için plastik sargı ile örtün. Testisleri sekiz mililitre Krebs içeren ayrı bir plakada kapsülleyin. Bir çift forseps ile seminifer tübülleri çevreleyen ince zarda bir kesi yapın.

Zarı şimdi başka bir forseps çifti ile tutun. Tübülleri zarın dışına ve zarından uzağa itin. Tübülleri içeren dört mililitre Krebs'i 25 mililitre kollajenaz çözeltisi içeren her bir konik tüpe aktarın.

Tübüller spagetti benzeri bir görünüm elde edene kadar 33 santigrat derecede 10 dakika çalkalayın. Ardından, tübüllerin tüpün dibine beş dakika oturmasına izin verin. Süpernatanı dökün ve oda sıcaklığında 25 mililitre Krebs ile iki kez yıkayın, böylece tübüllerin her seferinde tüpün dibine çökmesine izin verin.

Her tüpte yaklaşık beş mililitre Krebs bırakın. Tübülleri tripsin ile inkübe ettikten sonra. Tübülleri içeren çözeltiyi çalkalamak için geniş delikli bir pipet kullanın.

Bunları yaklaşık 10 kez içeri ve dışarı pipetleyin. Çözelti daha çok tek hücreli bir süspansiyon gibi görünmeye başlamalıdır. Şimdi her 30 mililitrelik tek hücreli süspansiyonu 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.

Hücre süspansiyonlarını birleştirdikten sonra, toplam hücre sayısını sayın. Durdurma musluğunun, akışı hücre odasından çökeltme odasına yönlendirecek şekilde konumlandırıldığından emin olun. Her iki karıştırma çubuğu plakasını da düşük bir ayara getirin.

Daha sonra hücre süspansiyonunu hücre odasına dökün. Hücrelerin dakikada 10 mililitre hızında yavaşça çökeltme odasına akması için durdurma musluğunu açın. Ardından, hücreleri hücre odasından yıkamak için durdurma musluğunu kapatın.

Beş mililitre% 0.5 BSA çözeltisi dökün ve dakikada 10 mililitre oranında çökeltme odasına boşaltın. Vanayı kapatın ve BSA yıkamasını dört kez daha tekrarlayın. Şimdi, sıvıyı dakikada 40 mililitre hızında çökeltme odasına hemen boşaltmak için hücre odası ile iki iki litrelik silindir arasındaki kelepçeleri açın, akış hızını BSA gradyanını çökeltme odasına yüklemek yaklaşık 20 ila 30 dakika sürecek şekilde ayarlayın.

BSA gradyanının üzerinde yatan ince, bozulmamış bir hücre tabakası olup olmadığını izleyin. BSA'nın çoğu yüklendikten sonra, durdurma musluğunu kapatın ve sıvının çökeltme odasından fraksiyonlama tüpüne akmasına izin verecek konuma çevirin. Şimdi karıştırma plakalarını kapatın ve hücrelerin bir saat 45 dakika boyunca çökelmesine izin verin.

Sedimantasyon tamamlandıktan sonra, fraksiyon tüpünü fraksiyon toplayıcıya takın. Akış hızını, her 45 saniyede bir toplama tüpü başına 10 mililitre toplanacak şekilde durdurma musluğu ile ayarlayın. Tüm fraksiyonlar toplandıktan sonra, farklı hücre popülasyonları için fraksiyonları mikroskobik olarak analiz edin.

Her bir fraksiyonun saflığını belirlemek için hücre boyutuna ve nükleer morfolojiye dayalı olarak farklı hücre tipleri ayırt edilebilir. 10 mikrolitre DPI lekeli hücreleri bir slayt üzerine aktarın. Bir kapak fişi yerleştirin ve bir floresan mikroskobu ile analiz edin.

Hücre popülasyonları oluşturmak için boyut ve nükleer morfoloji bakımından benzer fraksiyonları çekin. Yaklaşık 22 testisin tipik bir preparatı. Bu kalma prosedürü ile yaklaşık 10 ila sekizinci hücre verir.

Perper metagenik hücre tipi fraksiyonları, ışık ve floresan mikroskobunun bir kombinasyonu kullanılarak hızlı bir şekilde analiz edilebilir. Miyotik, spermatogonia ve somatik diploid hücreler testislerde bulunan en büyük hücrelerdir ve dpi ile nispeten homojen bir şekilde boyanan büyük çekirdekler içerecektir. Yuvarlak spermatidler, daha küçük yuvarlak çekirdekli daha küçük hücrelerdir, genellikle parlak bir şekilde boyanan bir kromoz merkezi yoğunlaşan uzayan spermatidler, orak şeklinde çekirdeğe sahip küçük hücrelerdir.

Hücre fraksiyonları birleştirildikten sonra, saflık, hücre lizatlarının batı kan analizi ile daha da belirlenebilir. Miyotik hücrelerin ortak belirteçleri, bir protein olan Synap Neal Kompleksidir. Yoğunlaşan spermatidlerin ortak belirteçleri geçiş proteinleri veya protamindir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik geliştirildikten sonra düzgün bir şekilde uygulanırsa yedi saat içinde yapılabilir. Bu teknik, spermatogenez alanındaki araştırmacıların testislerden farklı hücre tiplerindeki hücresel süreçleri keşfetmelerinin yolunu açtı.