Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve In vivo Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara Drosophila Embriyolar.

Bu prosedürün genel amacı, drosophila embriyosunda epidermal yara yanıtı için in vivo raportörü görselleştirmektir. Bu, öncelikle raportör etkinliğinin tutarlı bir şekilde tespit edilebileceği gelişim aşamasının toplanmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, cam iğne ve mikroenjeksiyon aparatı kullanılarak embriyonun delinmesidir.

Üçüncü adım, raportörün görselleştirilmesi için embriyoyu uyuşturmaktır. Son adım, RNA problarının ekspresyon modelini tespit ederek raportör lokalizasyonunu doğrulamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, konfokal mikroskopi yoluyla sadece delinme yaralanması bölgesini çevreleyen hücrelerde epidermal yara yanıtı raportörünün spesifik aktivasyonunu gösterebilir.

Bu tekniğin, yara kapanmasına bakmayı içeren mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, canlı embriyolarda delinme yarası tarafından tetiklenen gen ekspresyonunu görebilmemizdir. Bu yöntem, bir yaralanmayı çevreleyen hücrelerin, Onarımı teşvik etmek için ani bir yara tepkisini nasıl düzenlediği gibi, doku onarımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, doku rejenerasyonunun tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü yara yanıtının düzenlenmesi ilk adımdır.

Yara iyileşmesi, gelişimin herhangi bir aşamasında test edilebilir. Bununla birlikte, 17. aşamada, kütikül çok olgunlaşır. Bilinen yara raportörleri etkinleştirilmeyecektir.

Bu nedenle, göstermek için, embriyoları toplamak için 15 ila 16. aşama yaralanacaktır. İki ila üç günlük yetişkin sinekleri, 50 dişi ve 25 erkek toplayın. Onları taze bir tabak elma suyu, agar ve bir parça maya ezmesi ile bir embriyo toplama kafesine aktarın.

Önümüzdeki üç gün boyunca kafesi her sabah 25 santigrat derecede tutun. Plakayı yenisiyle değiştirin. Üçüncü günün öğleden sonrasında, yumurtaların iki saat boyunca taze bir tabakta birikmesine izin verin.

Bu plakayı 25 santigrat derecede 14 saat saklayın. İki saatlik bir yumurtlama, ertesi gün yaklaşık 200 embriyo vermelidir. Tabağa birkaç mililitre su ekleyin ve hafifçe döndürün.

Daha sonra bir boya fırçası kullanarak, suyu ve embriyoları plakadan bir toplama tüpündeki naylon örgü sepete aktarın. Şimdi sığ bir ağartma banyosu yapın ve embriyoları iki dakika bekletin. Bu adım COR'ları, yumurtaları kaldırır.

Kabuk, embriyoların topaklanmasını önlemek için banyoyu birkaç kez döndürün. İki dakika sonra, embriyoları akan su ile durulayın ve petri kabı her biri beş saniye durulayın. Daha sonra embriyoları kurutmak için embriyo sepetini bir kağıt havluya aktarın.

Daha sonra, bir diseksiyon iğnesi kullanarak, ağdan yaklaşık 50 embriyoyu yeşil gıda boyası ile yapılan bir agar plakasına taşıyın. Boya, diz yumurtalarının görünürlüğünü artırmak içindir. Bir diseksiyon kapsamı altında, yaklaşık beş milimetre aralıklarla iki paralel embriyo sırası oluşturun.

Gaz değişimine izin vermek için sıraları bir embriyonun genişliğine göre yerleştirin. Daha sonra, sıralar slaydın uzunluğuna dik olacak şekilde embriyoların üzerine çift çubuklu bantlı bir slaytı dikkatlice bastırın. İç basınçlarını azaltmak için embriyoların kurumasına izin verin.

Bu şekilde yaralandıklarında patlamazlar. 25 dakika sonra hazırlanan ilk slayt kurumalıdır. Şimdi, daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoları iki ila üç damla halo karbon yağı ile örtün ve hemen kuru embriyoları yaralamaya devam edin.

Embriyo slaytını enjeksiyon mikroskobu aşamasına yerleştirin. Görüş alanındaki embriyoları bulun ve ters çevrilmiş mikroskobun sahnesini hareket ettirme alıştırması yapın. Şimdi dorsal ventral eksen boyunca embriyonun orta düzlemine odaklanın ve ilk hizalanmış sıranın üst embriyosunu görüş alanına getirin.

Ardından, çekilmiş bir iğneyi iğne tutucusuna dikkatlice yerleştirin ve sabitleyin. İğneyi kızağa doğru hareket ettirmek için mikro manipülatörü kullanın. İğneyi embriyo ile aynı odak düzleminde hizalayın.

Şimdi, mikrom manipülatörünü daha fazla ayarlamayın. Şimdi embriyoyu baştan sona delmek için sahneyi hareket ettirin. Sonra sıradaki bir sonraki embriyoya geçin.

İlk sırayı yaraladıktan sonra iğneyi tamamen yukarı ve sahneden uzaklaştırın. Ardından slaytı döndürün ve ikinci sıradaki embriyoları delmeye devam edin. Hepsi yaralandıktan sonra, embriyolar içinizde hibridizasyon veya antikor boyaması için hemen sabitlenebilir.

Floresan muhabirleri incelemek için dört ila altı saat bekleyin ve embriyoyu yeni slaytta yenisine aktarın, embriyoların etrafına cam boncuklar yerleştirin. Daha sonra birkaç damla% 50 bir fenoksi, bir anestezik olan iki propanol ekleyin ve mikro enjeksiyonlar için embriyoların üzerine bir örtü fişi yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini arkadan bir mikrolitre kimyasal çözelti artı 0.6 molar hidrojen peroksit gibi boya ile yükleyin.

Kimyasal çözeltiyi iğnenin ucuna çekmek için kılcal harekete izin verin. Ardından, iğnenin ucunu halo karbon yağı karışımındaki bir kapak kaymasının kenarına karşı kırın. İlk olarak, monte edilen iğneyi, açılı kapak kaymasının kenarı tam olarak 90 derece olmayacak şekilde odak noktasına getirin.

Ardından, kapak kayma kenarını iğnenin ucu boyunca kırılana kadar yavaşça hareket ettirin. Daha sonra mikroenjeksiyon aparatına baskı uygulayın ve solüsyonun iğneden dışarı akıp akmadığını kontrol edin. Akmazsa iğneyi biraz daha kırın.

Şimdi, sadece embriyoları delmek için kullanılan prosedürün aynısını uygulayın. Bu kez, çözeltiyi delinme ile aynı anda mikro enjekte edin. İdeal olarak, 10 nanolitre enjekte edin.

Embriyo içine çok fazla solüsyon enjekte edilirse metin protokolündeki fiksasyon işlemi uygulanırken Vitale zarı patlayacaktır, aşağıdaki adımlara çok dikkat ediniz. Heptanı slayt üzerinde durulamak için plastik değil bir cam pipet kullanın ve embriyoları cam Petri kabının ortasına döndürmek için cam kullanın. Daha sonra, embriyoları 220 ila 230 RPM'de 25 dakika boyunca fiksatif olarak çalkalayın.

Çalkaladıktan sonra, alt sulu fazı tamamen çıkarmadan önce arayüzdeki kabarcıkların patlamasına izin verin. Ayrıca, embriyoları yukarı çekmemeye dikkat edin. Metanolü ekledikten sonra, yaralı embriyolar daha sonra arayüzde kümelenmeli, embriyoları plakanın yüzeyi boyunca bu şekilde yaymalı ve bu şekilde çift çubuklu bir bant cam slayta aktarmalıdır.

Daha sonra Vitale zarını patlatmak ve dehidrasyona devam etmek için embriyoları diseksiyon iğnesi ile dikkatlice itin. Yabani tip sinekler, DOPA dekarboksilaz veya tirozin hidroksilaz arttırıcılara kaynaştırılmış floresan raportörler ile dönüştürüldü ve tarif edilen teste tabi tutuldu. Brightfield altında, floresan aydınlatma altında yara bölgesini görmek mümkünken, DCD yara raportörü aktivitesini görmek mümkün oldu.

Tirozin hidroksilaz raportörü de benzer bir sonuç gösterdi. Her iki görüntü de 20 x objektifli bir Leica SP iki konfokal mikroskopta toplandı. İşlem, iki mutant fonksiyon akışı kaybında gerçekleştirildi.

Arka plan, DOPA dekarboksilaz raportör aktivitesi, tüm hücrelerde her yerde ekspresyon ile oluşturulan iki mutantın fonksiyon akışının kazanılmasında epidermal hücreler boyunca genişletildi. Raportörün inhibisyonu epidermal hücreler boyunca kaydedildi. Daha sonraki embriyolar aynı anda yaralandı ve epidermal hücrelerde çözündürülmüş bir bileşik ve udin mavisi boya hidrojen peroksit ve suyla genişletilmiş DOPA dekarboksilaz raportör aktivitesi ile enjekte edildi, tıpkı U hibridizasyonunun içinde U hibridizasyonu kullanılarak sodyum hidroksit içinde bir metil B siklodekstrin enjeksiyonu yapıldı.

Yara yanıt genlerinin transkripsiyonel aktivasyonu endojen DOPA dekarboksilaz testi idi. RNA ekspresyonunun yara yeri çevresinde lokalize olduğu görüldü ve tabii ki tirozin hidroksilaz, RNA transkriptlerinin de yara bölgesinde biriktiği bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 60 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, embriyoları hizalamak için çok fazla zaman harcamamak ve prosedürdeki sonraki adımlara geçmek önemlidir.