Name: Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve In vivo Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara Drosophila Embriyolar. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Öğrenin Drosophila embriyolarında mikroenjeksiyon yara deneyi ile epidermal yara yanıtını canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, doku onarımındaki gen ekspresyonunu gerçek zamanlı analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol McGinnis Lab, Kim A. Mace ve Joseph C. Pearson önceki üyeleri ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Biz değerli hisse senetleri düzenlemek ve dağıtmak çalışmaları için Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi tarafından devam çabalarını teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM077197 ve K12 GM68524) ve Herbert Stern aileden fon tarafından desteklenmiştir. MTJ anda Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların üzerinde Ulusal Enstitüsü Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Hibe Numarası 8G12MD7603-27 Hibe Numarası 5G12RR003060-26 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Azınlık Sağlık Ve Sağlık Farklılıkların veya Sağlık Ulusal Enstitüleri üzerinde Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Drosophila embriyonik yara protokol beş adımda özetlenebilir: (1) Embriyo Collection, (2) Embriyo Hazırlama (3) Embriyo Yaralama, (4) Embriyo Mikroenjeksiyon, ve (5) Embriyo Fiksasyon. 1.. Embriyo Koleksiyonu <ol><li> , Yetişkin sinekleri toplayın 2-3 gün eclosing sonra, bir embriyo toplama kafesine 50 kadın ve 25 erkek ekleyin. </li><li> 3 gün boyunca her sabah taze bir elma suyu agar artı mantar plaka koyun. Notlar: 25 ° C inkübatör, 12 saat gündüz tarifesi optimum embriyo toplama, çevrimi için sinekler (ve 17:00 ışıklar &quot;OFF&quot; &quot;ON&quot; 05:00 ışıkları); dişi sinekler ışık döngüsü değişikliklere yanıt ve ışıkları &quot;OFF&quot; 10,11 &quot;ON&quot; ışıkları bir geçiş sırasında yumurta büyük miktarlarda yatıracaktır. </li><li> Day-3 öğleden sonra, kafes üzerinde bir taze elma suyu artı maya agar plaka koyun ve 2 saat boyunca embriyolar toplamak. Kafese yeni bir maya tabak yerleştirin ve kaydedin2 saat toplama plakası. </li><li> Embriyoların yaş 25 ° C&#39;de ek bir 14 saat boyunca toplama plakası saklayın. Notlar: Yara iyileşmesi Drosophila gelişimi sırasında herhangi bir aşamada analiz edilebilir, bu yazıda bahsedilen yara ile indüklenen transkripsiyonel raportörler, 15-16 Aralık aşamaları arasında optimum aktiviteye sahiptir. Geç evre 17 tarafından, embriyo kolayca olgunlaşan manikür delmek ve verimli bir yara gazetecilere etkinleştirmek veya yara kaynaklı transkripsiyonunu tespit etmek çok eski. Toplama zamanı ve yaralama zaman yoğun laboratuvar saatlerinde meydana izin vermek için, biz, saat 18:00 &#39;de yeni bir plaka ile toplama plakası alışverişi, 2 saat (16:00-18.00) için embriyo toplama bir program takip yaş 14 saat (bir gece) 25 ° C&#39;de bir toplama plakası ve (bir sonraki gün) 08:00 &#39;da embriyolar yara. </li></ol> 2. Embriyo Hazırlık Notlar: Bu protokol, keskin veya g yapılmış birçok araç ve nesne kullanımını içerirkız. Yaralanmaları önlemek için itina ile tüm keskin ve cam nesneler tutun. <ol><li> Yavaşça plaka ve dönen 2-3 ml su eklenerek bir fırça ile toplama plakalardan embriyolar kaldırmak. Naylon örgü ve toplama tüpü için plaka su ve embriyolar transfer. </li><li> Bir plastik Petri tabağı plakasının kap ağartıcı 4-5 ml ekleyin ve 2 dakika için ağartıcı embriyoları içeren toplama borusunun kapalı ucu örgü emmek, embriyonun dış yumurtaların kaldırır. Elle toplama tüpü beyazlatıcıya kümeleyerek embriyolar önlemek için birkaç kez döndürün. Su 10x&#39;e ile embriyolar durulayın ve bir kağıt havlu üzerine dechorionated embriyoları içeren örgüyle kaplı toplama tüpü kurulayın. </li><li> Bir agar plaka örgü naylon ~ 50 embriyolar transfer etmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Biz embriyo hizada kontrast ve yardım eklemek için agar plaka yeşil gıda boyası ekleyin. Bir mikroskop altında, Embry&#39;yi hizalama, ~ 25 embriyo, iki paralel satır yapmakslayt üzerinde os da mikroenjeksiyon aparatı üzerinde delme iğnesine doğru açıda olacak şekilde. Gaz değişimi amaçlı embriyolar arasında küçük bir boşluk (yaklaşık 1 embriyo uzunluğu) bırakın. Iki paralel sıra birbirinden yaklaşık 5 mm olmalıdır. </li><li> Hizalanmış embriyoların üstüne çift kaset sopa ile bir slayt yerleştirin ve dikkatli bir slayt yeşil plaka embriyolar transfer slayt basın. Sonra hava embriyoların kuru ~ 25 dk embriyo üzerinde iç basıncı azaltmak ve yaralama zaman bir patlama önlemek için. </li><li> Daha fazla su kaybını önlemek için embriyolar üzerinde halokarbonlu yağ karışımı 2-3 damla yerleştirin. </li></ol> 3. Embriyo Yaralama <ol><li> Enjeksiyon mikroskop aşamada taslak slayt yerleştirin. Görüş alanında embriyolar bulmak ve ters mikroskop sahne hareket uygulama. Notlar: iğne ile çalışmaya başlamadan önce, dorsoventral ekseni boyunca embriyonun orta düzlemine odaklanmak. Verimli yaraladığı için izin vermek içinhizalanmış embriyolar, yakın iğne aparatı satır yaralama başlar. Görüş alanı içine hizalanmış embriyoların satırın üst getirmek için sahne hareket ettirin. </li><li> Dikkatlice yerleştirin ve iğne tutucu bir çekti-iğne sabitleyin. Slayt aşağı doğru iğne taşımak için mikromanipülatör kullanın. Aynı odak düzlemi, embriyo ile iğne hizalayın. Iğne embriyo ile odak sonra, mikromanipülatör ile iğne taşımak yok. </li><li> Sonra üst üste sonraki embriyo taşımak, ve aracılığıyla embriyo delinme sahne taşıyın. İlk satırı yaralama Bittiğinde, slayt taşımadan önce aşamasından yukarı ve uzağa tamamen iğne taşımak için micromanipulator kullanmak, manuel slayt 180 ° döndürmek ve ikinci satır yara. </li><li> Oda sıcaklığında halokarbonlu yağ altında embriyoların Mağaza ve embriyo sabitleme ile devam situ hibridizasyon veya antikor boyama yapıyor if (Prosedür adım 5). Seçenek olarak ise, 4-6 saat için embriyolar depolamakhalokarbonlu yağ altında ve yara transkripsiyon floresan muhabiri görselleştirme (Temsilcisi Sonuçlar) ile devam. Notlar: floresan haberci görselleştirilmesi için,% 50 1-fenoksi-2-propanol ile 13 embriyolar anestezi. Embriyolar halokarbon yağdan çıkarıldı ve yeni bir lam üzerine yerleştirilir. Biz, embriyoların etrafında cam boncuklar yer anestezik birkaç damla ekleyin ve embriyolar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. </li></ol> 4. Embriyo Mikroenjeksiyon Notlar: Biz protokol kullanmak mikroenjeksiyon aparatı tahlil sırasında belirli bir ses sunmak için otomatik değildir. Biz mikroenjeksiyon görselleştirmek ve teslim ses normalleştirmek için denemek için çözüm bir boya ekleyin. Çok fazla çözelti embriyonun içine enjekte edilir, vitellin zar patlar. <ol><li> Kimyasal çözeltinin ayrıca boya 1 ul arkadan yük iğne (örn. 0,6 MH 2 O 2). Kılcal iziniğnenin ucuna kimyasal çözüm çizmek için eylemi. </li><li> Bir iğne kırmak için, bir slayt ve ceket halokarbonlu yağ karışımı ile kenar üzerinde bir açıyla bir kapak kayma yerleştirin. Açılı kapak kayma kenarı ile odak haline monte iğne getirin ve hafifçe kırık kadar iğne ucu genelinde kapak kayma kenarına taşıyın. Mikroenjeksiyon cihazları üzerinde baskı uygulayın ve kimyasal çözüm artı boya iğne dışarı aktığını kontrol edin. </li><li> Mikroskop sahnede hizada embriyoları içeren slayt yerleştirin. Aynı düzlemde embriyo ve iğne odak geçin. Aynı anda delinme ve Microinject kimyasal çözelti artı her embriyo içine boya. Notlar: Tıkalı iğneler sık ​​sık meydana gelen; eksik mikroenjeksiyon önlemek için yeni bir iğne kırmak. Bir künt bir iğne ucu kadar temiz açılı bir iğne ucu kadar yara almaz. Kırılması sırasında olmayan 90 ° açı ile lamel ayarlanması açılı bir iğne ucu üretmek için en uygunudur. </li></ol> 5. Formaldehit Fixation Notlar: Bu Drosophila tespitte kullanılan kimyasallar zararlıdır. Kimyasalları kullanırken kişisel koruyucu ekipman (örn. eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük) kullanın. Düzenlenir kimyasalların atılması için bireysel, kurumsal yönergeleri izleyin. <ol><li> Yaralanma sonrasında ortaya yara-teşvik edilmiş genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için 15, 30, 60, ya da daha fazla dakika bekleyin. Enjeksiyon slaytlar embriyolar kaldırmak için, dikkatli, slaytlardan halokarbonlu yağ karışımı boşaltın rafa karşı slayt yalın ve bir Kimwipe ucunu kurulayın. </li><li> Slayt üzerinde heptan durulama ve bir cam Petri kabı içine sıvı durulama yıkamak için bir cam pipet kullanın. Heptane bandı çözülür ve embriyolar yayınlayacak. Tüm embriyolar slayt kaldırılana kadar çalkalamaya devam edin. Tüm embriyolar slaytlar kaldırılana kadar, bir sonraki slayta geçin. </li><li> 20 ml&#39;lik bir bilim içine cam çanak heptan çözeltisi artı embriyo transferntillation flakon. 2-3 dakika boyunca çalkalayınız, heptan kaldırmak ve taze heptan 5 ml ekleyin. </li><li> Taze, fiksasyon solüsyonu 5 ml ekleyin (tarifi için reaktifler listesine bakınız). Kapatılır ve orbital çalkalama platformunda ekleyin. 220-230 rpm&#39;de 25 dakika boyunca embriyoları içeren şişe çalkalayın. </li><li> Çalkalanmış, arayüz pop da kabarcıklar sağlar. Tamamen embriyolar çekerek kaçınarak, bir pipet ile alt, sulu faz kaldırın. Alt tabaka, sabitleme çözeltisi oluşmaktadır ve uygun şekilde atılmalıdır. </li><li> , Metanol 5 ml ekleyin, şişeyi kap ve 20-30 sn, girdap için elle kuvvetlice çalkalanır ve tezgah üzerine yerleştirin. Yaralı embriyolar interfaz kalacak ve dibe batar olmayacaktır. Notlar: Tespit edildikten sonra bir yaralı olmayan embriyo vitellin zar normal olarak metanol ile dehidrasyon aşaması esnasında patlar. Ancak, yaralı embriyo vitellin zar zaten kırılmış ve dehidratasyon adım vitellin memb kaldırmazrane. El devitellinzation tespit protokolü tamamlamak için gereklidir. </li><li> Dikkatli bir şekilde üst heptan tabakayı kaldırmak ve sonra taze metanol 5 ml ekleyin. Şişeyi çalkalayın ve embriyolar lavabo olmalıdır. </li><li> Bir cam aktarım pipet ile metanol artı embriyo çözüm çıkarın ve bir cam tabak içinde, naylon örgü toplama tüpü içinde toplar. </li><li> Metanol çıkarın ve 1x PBS çözeltisi ile embriyolar yıkayın. </li><li> Bir elma suyu plaka için naylon mesh embriyolar transfer. Levhanın yüzeyi boyunca embriyolar yayıldı. </li><li> Bir çift sopa bant cam slayt embriyolar transfer. 1x PBS ile embriyolar örtün. Notlar: Embriyolar nedeniyle vitellin membran gelme eğilimindedir. Bir elma suyu kullanarak yer topaklaşmış embriyoların hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. Kuvvet embriyo kaldırmak için uygulandığı zaman embriyolar agar plakası gömülmek için embriyolar, levhadan kaldırılır ve bir çift çubuk bant cam slayt aktarılmalıdırvitellin membran. </li><li> Dikkatle vitellin membran &quot;pop&quot; bir diseksiyon iğne ile embriyolar itin. Embriyo PBS içinde lavabo olmalıdır. </li><li> Bir 1.5 ml tüp 1x PBS ve embriyo transferi için bir cam pipet kullanın. 4 ° C&#39;de 1x PBS ve mağaza ile embriyolar durulayın PBS serisi ve in situ hibridizasyon veya bağışık protokolü 14 devam: Bir Etanol kullanılarak embriyolar kurutmak geçin. </li></ol>

<ol><li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li>
<li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li>
<li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li>
<li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li>
<li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li>
<li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duox%2C+Flotillin-2%2C+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424(2011).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12%3A12+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li>
<li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li>
<li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846(2004).</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Drosophila+transgenic+reporters%3A+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li>
<li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773(2013).</li>
<li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696(2010).</li>
<li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347(2012).</li>
<li>Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li>
<li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dış işaretlere acil transkripsiyonel düzenleyici tepki hücreleri stres, hasar veya enfeksiyonu içerebilir dışı uyaranlara lokalize bir yanıtı koordine sağlar. Yerelleştirilmiş bir yanıtın uygun olmayan kontrol hasarı onarmak için zarar komşu hücreler üzerindeki etkilerinin yanı sıra, ziyan edilmiş bir kaynak olabilir. Drosophila embriyo, ucuz ve kolay muhafaza model organizma temel yara iyileştirici deneyler için mükemmel bir sistem sağlar. Diğer model organizmalar araştırma ve Drosophila işbirlikleri için potansiyel pek çok biyolojik soruları keşfetmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Yara muhabir ek bir teknik epidermal yara tepki yolunun aktivasyonuna, yeni genlerin katkısı test etmek için etkili bir yöntem sağlamaktadır, mutant arka genetik kombinasyonudur. Biz, epidermal yara kaynaklı transkripsiyonel raportörler, av var2 nci ve 3 üncü kromozom 5 hem AILABLE. Bu çalışmada biz UAS ve aşırı ekspresyonunun 16 GAL4 sistemlerini kullanabilirsiniz. Ölümcül mutant allelleri ile çalışmalar için biz bir floresan dengeleyici kromozomu, örneğin Kruppel-GFP 17 kullanılarak genetik arka plan belirler. Biz birkaç genetik geçmişleri (Tablo 1) de yara muhabir yerelleştirme analiz ettik. Tekniğin muhtemel modifikasyon mikroenjeksiyon ve yaralama birleştirmektir. Mikroenjeksiyon embriyo bir kimyasal solüsyon tanıtmak için kullanılabilir. Birçok kimyasal bileşikler test edilmiş ve epidermal yara muhabir 9 aktivitesini düzenleyen bulunmuştur. Eş zamanlı yaralanmalar ve mikroenjeksiyon Bu yöntem, bir yara sinyal yanıt ve doğrudan 18 yaralama sonra gen ekspresyonu değişiklikleri izlemek için kullanılabilir Drosophila embriyo hücrelerinin sayısını arttırmak için yararlı olabilir. Mikroenjeksiyon tekniğin bir yönelik uygulama epidermal yara cevabının düzenlenmesi için yeni bir kimyasal test etmek olacaktır. Genetik çalışmalar için bir model sistemi olarak Drosophila verimli bir şekilde karmaşık soruları için basit protokoller geniş bir yelpazede sunuyor. Drosophila tekniklerinin fizibilitesi ile ilgili son raporlar daha Drosophila araştırma topluluğunun etkisini genişletmek için bir araç olarak hemocyte göç 19 ve parazitik yabanarısı enfeksiyon 20 kullanımını vurgulamaktadır. Yara onarım çalışmalarına ek olarak, Drosophila hayali disk sistemi 21,22 ile yenilenme için bir klasik model sağlar. Hayali disk rejenerasyon çalışmaları ve delinme / mikroenjeksiyon yaralanmasıyla kombine gelişmeler doku onarımının iyi korunmuş bileşenleri keşfetmek için mükemmel bir sistem sağlar.

Mikroenjeksiyon tekniği kullanarak Drosophila embriyolar Manipülasyon köklü bir tahlil 1&#39;dir. Epidermal yara yanıt raportör yöntemin önemi floresan muhabir delinmeye / mikroenjeksiyon için protokol birleştirmek ve Drosophila embriyolarda epidermal yaralanma için bir in vivo yanıt görselleştirmek için. Bu yöntemin amacı, epidermal lastik yaralanmaya transkripsiyon yanıtı düzenleyen işlemleri incelemek üzere bir araç olarak kullanmak için Drosophila bilim adamları, daha geniş bir dizi sağlamaktır. Drosophila tek katmanlı epidermis bir delinme yaralanma 2 sonra epidermal yara tepkisini incelemek için basit bir sistem sağlar. Drosophila embriyo genetik yara tepki, enflamasyon ve reepithelialization 3 de dahil olmak üzere, yara iyileşmesi aşamalarını incelemek için sağlam bir model sistem. Çok ya da çoğu zigotik mutantlar embryogenes sonuna kadar hayatta kalmak için bu kısmında bulunanve gelişimsel desenlendirme derinden ters gittiği zaman bile epidermal engelleri gelişir. GRH-hedef genler dopa dekarboksilaz (DDC) ve tirozin hidroksilaz (ple) transkripsiyonel yaralanma 4&#39;ün siteleri etrafında aktif olduğu. Tanımlanan, iyi korunmuş bir transkripsiyon faktörü Grenli kafası (GRH) Önceki karakterizasyonu Drosophila yara tepki için bir model organizma olarak memeli yara iyileşmesinde 5 çalışmalarını ilerletmek için soruşturma tamamlayıcı bir çizgi sunuyor. Daha sonraki çalışmalar, ek Drosophila yara kaynaklı gen belirlendi ve 6 yaralama temizlemek için in vivo epidermal yara yanıtını izlemek için birçok floresan yara gazetecilere bir &quot;araç kiti&quot; geliştirdik. Drosophila yara iyileşmesi düzenleme üzerinde son raporlar, hücre göçü 7,8 düzenleyen birçok yolların keşfini sağlayan, yara kapama fenotip odaklanmıştır. Analizi ilefloresan yara haberciler, çalışmalarımız epidermal yara uyarımlı gen 9&#39;un lokalize ekspresyonu için gerekli olan genlerin yeni bir dizi belirledik. Yara yanıt raportör yönteminin esası bir sonuçları sinyalleri, komşu hücrelere yaralanma sitesinden transduse nasıl bir mekanizma daha fazla bilgi sağlar olmasıdır. Ancak, yara yanıt raportör yöntemin dezavantajları biri sonuçları doğrudan yara iyileşmesi veya tamir fenotiplere bağlantı kalmamasıdır. Genetik ve kimyasal ekranlarında temiz yara delinme protokolünün daha geniş kullanımı transkripsiyonel yanıt yeni düzenleyiciler tespit edilmesi yaralama epidermal ve yaralanma tedavileri memeli modelleri içine yara iyileştirici keşifler çeviri ilerletmek için izin verecektir.

<table><tbody><tr><td>maya</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>elma suyu</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>çamaşır suyu</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>halokarbon yağı, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>halokarbon yağı, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- fenoksi-2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>hidrojen peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>metil-&beta;-siklodekstrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>toluidin mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>formaldehit, %16</td> <td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>toksik kimyasal</td></tr><tr><td>heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>toksik kimyasal</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>toksik kimyasal</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila kuluçka makinesi</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>sinek kafesi</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>embriyo toplama tüpü</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>plastik Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>çift yapışkanlı bant</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>boya fırçası</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon iğnesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>cam kapak kayma</td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>mikroskobu slayt</td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>diseksiyon mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>kılcal iğne</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>iğne çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>mikroenjeksiyon iğne tutucu</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>ters mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>cam Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>cam Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>transfer ampulü</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>sintilasyon şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td>keskin nesne</td></tr><tr><td>orbital çalkalayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>lazer taramalı konfokal</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>fiksasyon solüsyonu</td> <td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 16 formaldehit</td><td>2.5 ml</td><td></td><td>toksik kimyasal</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>0.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen H 2O</td><td>1.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halokarbon yağ karışımı</td><td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>halokarbon yağı, 700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>halokarbon yağı, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroenjeksiyon yara deneyi ve<em&gt; in vivo</em&gt; epidermal lokalizasyonu tepki gazeteciler yara<em&gt; drosophila</em&gt; embriyolar.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Drosophila embriyo her iki sert bir dış ortamdan iç hücreleri korumak için hem de hücre homeostazının muhafaza edilmesi işlevini güçlü bir epidermal tabaka geliştirir. Cam iğne ile delinmesi yaralanma canlı embriyolar veya larva lokalize bir raportör sinyali ile görselleştirilebilir yara transkripsiyonel raportörler, aktive hızlı bir epidermal yara yanıt tetiklemek için doğrudan bir yöntem sağlar. Delinme veya lazer zedelenmesi aynı zamanda yara bölgesine hemocytes alımı teşvik sinyalleri sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, geç dönem embriyo ağır (baştan sona) ponksiyon hasarı, sadece nadiren bu yaralı embriyoların% 90 daha embriyolar delinme sitelerinden hemolimf hemen sızıntısını en aza indiren, bir yağ ortamı içinde enjekte edildiği zaman yetişkinliğe hayatta olduğu gibi, normal embriyonik gelişme bozar . Yara prosedür ag üzerinde embriyo manuel ayarlama dahil olmak üzere Drosophila embriyoların Mikromanipülasyondan, gerektirirar plakaları ve slaytları mikroskop hizalanmış embriyoların transferi. Drosophila epidermal yara tepki deney yara iyileşmesini yanı sıra, yara iyileşmesini teşvik potansiyel kimyasal bileşiklerin taranması için bir yöntem geliştirmek biyolojik fonksiyonları çeşitli genetik gereksinimlerini test etmek için hızlı bir sistem sağlar. Kısa yaşam döngüsü ve kolay bir kültür rutin Drosophila güçlü bir model organizma olun. Drosophila temiz yara iyileşmesi düzenleyici korunmuş bulmak için mükemmel bir sistem sağlar soruşturma kapsamında halen şekillerde, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ile, epidermal rejeneratif yanıtı koordine görünüyor Drosophila ve memeli epidermal yaralama ortak mekanizmaları.

Bu yöntemde de gösterilen sonuçlar elde etmek için, yeşil floresan proteini (GFP) ve açık okuma çerçevesi dopa dekarboksilaz (DDC) ve DsRed (tirosin hidroksilaz Bir yara arttırıcı sekansına kaynaştırıldığı bir yükseltici / arttırıcı yara kaynaklı sekansına kaynaştırılır ple) 4,6. Canlı bir Drosophila embriyo olarak, floresan yara raportör proteininin uygun olgunlaşma 4-6 yeterli protein birikimi görselleştirmek için zaman sağlar: yaralama sonra saat, hem de floresan durumuna 15 oksitlemek için flüoresan protein için zamanı. Muhabir yerelleştirme gözlemlemek için, bir bileşik floresan mikroskop yeterlidir. Raportör lokalizasyonu daha yüksek bir büyütme gözlemlemek için, konfokal mikroskop birden fazla optik bölme maksimum çıkıntı (Şekil 1) oluşturmak için en uygunudur. Drosophila embriyoların in vivo görüntüleme konfokal ra karmaşıklaşırEmbriyonun pid düzensizlikleri. . Embriyonun tam bir görüş 20X objektif ile elde edilebilir ve yara yerinin bir close-up görünümü 40X amacı ile elde edilebilir. Epidermal yara muhabiri lokalizasyonu bir üst-bakış 10 ardışık 1 Pm&#39;lik optik bölümleri ile görüntülü olabilir. Epidermal yara muhabiri lokalizasyonu lateral-view 40 ardışık 1 mikron optik bölümleri ile görüntülü olabilir. Standart genetik geçiş yöntemleri kullanılarak, genetik mutasyonlar ile yara gazetecilere birleştirmek mümkündür. Bu çalışmada sunulan bir örnek flotillin-2 (Flo-2), çünkü (P-element ekleme ile oluşturulan boş alel) zarar işleve ve kazanç fonksiyon-(tüm hücrelerde her yerde ifade ile üretilir fazla ifade) mutanları flo-2 Flo-2 gen ürünü gazetecilere 9 yara DDC-GFP lokalizasyonunu inhibe etmek için gerekli ve yeterli olduğunu göstermektedir (Şekil 2A ve 2B). MI kullanmacroinjection protokol, kimyasal çözeltiler superactivates tanıtımı veya yara gazetecilere lokalizasyonu inhibe olmadığını test etmek mümkündür. Kimyasal-yaralanmış embriyolar, aynı zamanda yaralı ve% 1 toluidin mavisi ve çözündürülmüş bileşiklerin bir 1:4 oranında enjekte edilmiştir. Toluidin mavisi boya vücut boşluğu içine enjekte edilen çözündürülmüş bileşiklerin görsel doğrulanması için izin verdi. Kontrol embriyolar kimyasal olmadan% 1 toluidin mavi boya ve çözünen 1:4 oranını içeren bir kırık iğne ile yaralandı. Bu çalışmada sunulan iki örnek hidrojen peroksit (H 2 O 2) ve metil-β-siklodekstrin (MβCD), hem de kimyasal çözümler küresel Ddc-GFP lokalizasyonu gazetecilere yara aktifleştirmek için yeterli çünkü 9 (Şekil 2C ve 2D) . Hidrojen peroksit (H 2 O 2) H içerisinde seyreltildi 2 O M. metil-β-siklodekstrin (MβCD) 0.6 1 m içinde solubilize edildiM NaOH 3 mm. Embriyo tespit protokolü kullanılarak, bir yara alanını çevreleyen, bir lokalize etki yara tepki genlerinin transkripsiyon aktivasyonunu tespit etmek mümkündür. Bu çalışmada sunulan bir örnek, ddC ve ple transkript 4,6,9 (Şekiller 3A ve 3B) tespit etmek için RNA sondalarının in situ hibridizasyon bulunmaktadır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. DDC-GFP ve ple-DsRed (B). (A) Ddc-GFP yara muhabiri Top-görünümü. Yaralı vahşi tip embriyolar muhabiri yerelleştirme. Aydınlık ve floresan görüntüleri yara ple-DsRed Top-görünümü muhabiri yara. Tüm görüntüler 20X amacı ile, bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde toplanmıştır. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panelinde Kesik çizgilers embriyoların ana hatlarını işaretlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2. Genetik mutant geçmişleri ve kimyasal mikroenjeke embriyoları. Aydınlık ve yaralı flotillin-2 (Flo-2) mutant embriyo floresan görüntüler de Ddc-GFP muhabiri yara lokalizasyonu. (A) Kayıp fonksiyon-Flo-2 {} KG00210 mutantlar, Tüm epidermal hücreleri boyunca raportör etkinliğinin genişlemesi. (B) Kazanç fonksiyon-Flo-2-(armadillo-GAL4, UAS-Flo2) mutantları, her epidermal hücreleri boyunca raportör etkinliğinin engellenmesi. (C) hidrojen peroksit (2 H O 2 ) çözeltisi mikroenjeksiyon, rep genişlemesiÖrter aktivitesi tüm epidermal hücreleri boyunca. (D) Metil-β-siklodekstrin (MβCD) çözeltisi mikro enjeksiyon, epidermal hücreleri boyunca her raportör etkinliğinin genişlemesi. Tüm görüntüler 20X amacı ile, bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde toplanmıştır. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panellerde kesik çizgiler embriyoların ana hatlarını işaretlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Şekil 3,. Yara tepki gen RNA transkriptlerinin saptanması. Yaralı vahşi tip embriyoların in situ hibridizasyon ve RNA tespiti floresan ve görüntüler. Ddc (A) ve ple (B) RNA transkriptleri yara etrafında birikir. Tüm görüntüler toplama vardı20X amacı ile bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde ted. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panellerde kesik çizgiler embriyoların ana hatlarını işaretlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Tablo 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tablo 1. Epidermal yara tepki gazetecilere özeti. Dört yara tepki gazetecilere (Ddc, ple, msn, KKV) ve Eklemeler hem ikinci ve üçüncü kromozom mevcuttur. Yara tepki habercilerin tüm yabani tip arka (örneğin, &quot;lokal&quot; fenotip) in lastik yaralanma alanını çevreleyen epidermal hücrelerin sınırlı sayıda floresan gen (GFP veya DsRed) aktive eder. Ddc msn ve yara tepki muhabir için gerekli GRH FLORESAN aktivasyonudelinme yaralanma (örneğin, &quot;none&quot; fenotip) sonra ce gen. Yara gazetecilere tüm delinme yaralanma (örneğin &quot;küresel&quot; fenotip) sonra floresan genin lokalizasyonu için Flo-2 gerektirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila embriyosundaki epidermal yara yanıtı için in vivo raporlayıcıyı görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle raporlayıcı aktivitesinin tutarlı bir şekilde tespit edilebildiği gelişimsel evrenin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bir cam iğne ve mikroenjeksiyon cihazı kullanarak embriyoyu delmektir.Üçüncü adım, raporlayıcının görselleştirilmesi için embriyoyu anestezi etmektir. Son adım, RNA problarının ekspresyon paternini belirleyerek raporlayıcı lokalizasyonunu doğrulamaktır. Nihayetinde sonuçlar, konfokal mikroskopi aracılığıyla epidermal yara yanıtı raporlayıcısının yalnızca ponksiyon yaralanma bölgesini çevreleyen hücrelerde spesifik olarak aktive olduğunu gösterebilir.Bu tekniğin, yara kapanmasını inceleyen mevcut yöntemlere göre temel avantajı, delme şeklinde oluşan yaralanmalarla tetiklenen gen ekspresyonunu canlı embriyolarda görebilmemizdir. Bu yöntem, yaralanma çevresindeki hücrelerin onarımı desteklemek için anlık yara yanıtını nasıl düzenlediği gibi doku onarımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yara yanıtı düzenlemesi başlangıç adımı olduğu için, bu tekniğin etkileri doku rejenerasyonunun tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır.Yara iyileşmesi gelişiminin herhangi bir aşamasında analiz edilebilir. Ancak 17. aşamaya gelindiğinde kütikül çok fazla olgunlaşmış olur. Bilinen yara raporlayıcıları aktive olmayacaktır.Gösterim amacıyla, embriyoları toplamak için 15. ile 16. evre arası olanlar yaralanacaktır. İki ila üç günlük yetişkin sineklerden, 50 dişi ve 25 erkek toplayın. Bunları, taze elma suyu ve agar içeren bir plaka ile bir miktar maya pastası bulunan bir embriyo toplama kafesine aktarın.Kafesi önümüzdeki üç gün boyunca her sabah 25 °C'de tutun. Plakayı yenisiyle değiştirin. Üçüncü günün öğleden sonrasında, yumurtaların iki saat boyunca yeni bir plakta birikmesine izin verin.Bu plakayı 25 °C'de 14 saat boyunca saklayın. İki saatlik bir yumurtlama süreci, ertesi gün yaklaşık 200 embriyo sağlamalıdır. Plakaya birkaç mililitre su ekleyin ve nazikçe çalkalayın.Ardından bir resim fırçası kullanarak, suyu ve embriyoları plakadan bir toplama tüpü içindeki naylon ağ sepetine aktarın. Şimdi sığ bir çamaşır suyu banyosu hazırlayın ve embriyoları iki dakika boyunca içinde bekletin. Bu adım, COR'ları, yani yumurtaları uzaklaştırır.Embriyoların kümeleşmesini önlemek için banyoyu birkaç kez dairesel hareketlerle sallayın. İki dakika sonra, embriyoları akan suyla ve petri kabını beşer saniye boyunca durulayarak yıkayın. Ardından, embriyoları kurulamak için embriyo sepetini bir kağıt havluya aktarın.Ardından, bir diseksiyon iğnesi kullanarak yaklaşık 50 embriyoyu süzgeçten, yeşil gıda boyasıyla hazırlanmış bir agar plakasına aktarın. Boya, yumurtaların görünürlüğünü artırmak içindir. Bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoları aralarında yaklaşık beş milimetre mesafe olacak şekilde iki paralel sıra halinde dizin.Gaz değişimine izin vermek için sıraları bir embriyo genişliğinde aralıklarla yerleştirin. Ardından, sıralar lamın uzunluğuna dik olacak şekilde, çift taraflı bantlı bir lamı embriyoların üzerine dikkatlice bastırın. İç basınçlarını azaltmak için embriyoların havada kurumasına izin verin.Bu sayede yaralandıklarında patlamayacaklardır. 25 dakika sonra, hazırlanan ilk lam kurumuş olmalıdır. Şimdi, daha fazla su kaybını önlemek için embriyoların üzerini iki ila üç damla halokarbon yağı ile kaplayın ve hemen kuru embriyoları yaralama işlemine geçin.Embriyo lamını enjeksiyon mikroskobu tablasına yerleştirin. Görüş alanındaki embriyoları bulun ve ters mikroskobun tablasını hareket ettirme alıştırmaları yapın. Şimdi, dorsal ventral eksen boyunca embriyonun orta düzlemine odaklanın ve ilk hizalanmış sıranın en üstündeki embriyoyu görüş alanına getirin.Ardından, çekilmiş bir iğneyi iğne tutucuya dikkatlice yerleştirip sabitleyin. İğneyi lamın üzerine indirmek için mikro manipülatörü kullanın. İğneyi, aynı odak düzlemindeki embriyo ile hizalayın.Şimdi, mikro manipülatörü daha fazla ayarlamayın. Ardından, embriyoyu boydan boya delmek için sahneyi hareket ettirin. Sonrasında sıradaki bir sonraki embriyoya geçin.İlk sırayı yaraladıktan sonra, iğneyi tamamen yukarıya, sahneden uzağa hareket ettirin. Ardından lamı döndürün ve ikinci sıradaki embriyoları delmeye devam edin. Tüm embriyolar yaralandıktan sonra, in situ hibridizasyon veya antikor boyama işlemi için hemen fikse edilebilirler.Floresan raporları incelemek için dört ila altı saat bekleyin ve embriyoyu yeni bir lam üzerine aktarın, embriyoların etrafına cam boncuklar yerleştirin. Ardından, anestezik olan %50'lik bir fenoksi, iki propanol'den birkaç damla ekleyin ve mikroenjeksiyonlar için embriyoların üzerine bir lamelle kapatın. Enjeksiyon iğnesini arkadan, 0,6 molar hidrojen peroksit gibi boya eklenmiş bir mikrolitre kimyasal çözelti ile doldurun.Kimyasal çözeltinin kılcal hareketle iğnenin ucuna çekilmesini sağlayın. Ardından, iğnenin ucunu, halo karbon yağ karışımı içindeki lamel kenarına sürterek kırın. İlk olarak, monte edilmiş iğneyi, yaklaşık 90 derecelik açıyla duran lamelin kenarı ile birlikte odağa getirin.Ardından, kırılana kadar lamel kenarını iğne ucunda yavaşça hareket ettirin. Daha sonra mikroenjeksiyon cihazına basınç uygulayın ve solüsyonun iğneden aktığını kontrol edin. Eğer akış gerçekleşmezse, iğneyi biraz daha kırın.Şimdi, yalnızca embriyoları delmek için kullanılan işlemin aynısını gerçekleştirin. Bu kez, delme işlemiyle eş zamanlı olarak solüsyonu mikroenjekte edin. İdeal olarak 10 nanolitre enjekte edin.Embriyoya çok fazla solüsyon enjekte edilirse, metin protokolündeki fiksasyon prosedürü izlenirken Vitale membranı yırtılacaktır; aşağıdaki adımlara dikkatle uyunuz. Lam üzerindeki heptanı durulamak için plastik değil, cam bir pipet kullanın ve embriyoları cam Petri kabının merkezine toplamak için cam bir araçla döndürün. Daha sonra, embriyoları fiksatif içerisinde 220 ila 230 RPM hızında 25 dakika boyunca çalkalayın.Çalkalama işleminden sonra, alttaki sulu fazı tamamen uzaklaştırmadan önce ara yüzeydeki kabarcıkların sönmesini bekleyin. Ayrıca, embriyoları yukarı çekmemeye dikkat edin. Metanol eklendikten sonra, yaralı embriyolar daha sonra ara yüzeyde kümelenmelidir; embriyoları plakanın yüzeyi boyunca şu şekilde yayın ve şu şekilde çift taraflı bantlı bir cam lama aktarın.Ardından, Vitale membranını patlatmak için embriyoları disseksiyon iğnesiyle dikkatlice itin vedehidratasyon işlemine geçin. Yaban tipi sinekler, DOPA dekarboksilaz veya tirozin hidroksilaz güçlendiricilerine füzyonlanmış floresan raporlayıcılarla transforme edildi ve açıklanan analize tabi tutuldu. Aydınlık alan altında yara bölgesi görülürken, floresan aydınlatma altında DCD yara raporlayıcı aktivitesi görülebildi.Tirozin hidroksilaz raporlayıcısı benzer bir sonuç gösterdi. Her iki görüntü de 20 x objektife sahip bir Leica SP two konfokal mikroskop ile elde edildi. Prosedür, bir fonksiyon kaybı flow two mutantında gerçekleştirildi.Arka plan olarak, tüm hücrelerde yaygın ekspresyonla oluşturulan fonksiyon kazanım akış iki mutantlarında, DOPA dekarboksilaz raporlayıcı aktivitesi epidermal hücreler boyunca genişlemiştir. Raporlayıcının inhibisyonu epidermal hücreler genelinde gözlemlenmiştir. Ardından, embriyolar eş zamanlı olarak yaralanmış ve çözünür bir bileşik ile udine mavi boya enjekte edilmiştir; hidrojen peroksit ve su, epidermal hücrelerde DOPA dekarboksilaz raporlayıcı aktivitesini genişletmiştir; aynı durum, in situ hibridizasyon kullanılarak sodyum hidroksit içinde metil B siklodekstrin enjeksiyonu ile de gerçekleşmiştir.Yara yanıt genlerinin transkripsiyonel aktivasyonu, endojen DOPA dekarboksilaz ile analiz edilmiştir. RNA ekspresyonunun yara bölgesi çevresinde lokalize olduğu görülmüş ve doğal olarak tirozin hidroksilaz RNA transkriptlerinin de yara bölgesinde biriktiği tespit edilmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldıktan sonra, işlem düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse 60 dakikada tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, embriyoları hizalamak için çok fazla zaman harcamamak ve prosedürün sonraki adımlarına geçmek önemlidir.

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı...

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bu videoda, canlı Drosophila embriyolarına reaktifler veren mikroenjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Araştırmacılar bu yöntemi, embriyo gelişiminin erken aşamalarında nükleik asitler ve proteinler gibi eksojen bileşikleri tanıtmak için kullanabilirler. Öne çıkan protokol, herhangi bir çözünür reaktifin enjeksiyonu için prosedürün nasıl kurulacağını ve gerçekleştirileceğini gösterir - burada, canlı görüntüleme deneyleri için bir floresan protein.

Canlı Drosophila Embriyolarının Mikroenjeksiyonu: Reaktiflerin Gelişmekte Olan Embriyoya Erken Verilmesi

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Yetişkin C. elegans derisi, yara kapanması, yara oluşumu ve doğuştan gelen bağışıklık dahil olmak üzere epitelyal yara tepkileri çalışmaları için izlenebilir bir modeldir.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

Yara kaynaklı poliploidizasyon, hücrelerin hücre kaybını telafi etmek için bölmek yerine boyut olarak büyüdüğü korunmuş bir doku onarım stratejisidir. Burada epitel yara onarım ploidy ve genetik düzenleme ölçmek için bir model olarak meyve sinek nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı bir protokoldür.

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin Drosophila embriyolarında mikroenjeksiyon yara deneyi ile epidermal yara yanıtını canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, doku onarımındaki gen ekspresyonunu gerçek zamanlı analiz eder.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve

Daha fazla video keşfet