Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve Ex vivo Fibroblastlar

Bu prosedürün genel amacı, invaziv tümör cephesindeki malign epitel hücreleri ile kanserle ilişkili stromal hücreler arasındaki arayüzdeki ayırt edici biyolojiyi karakterize etmektir. Bu, ilk olarak kolon implantlarından primer fibroblast kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, primer kolon fibroblastları ve kültürlenmiş kolorektal kanser hücrelerini kullanarak organotipik ko-kültür modelleri oluşturmaktır.

Daha sonra, organotipik modeller formin içinde sabitlenir, membrana monte slaytlar üzerine kesitlenir ve krestal menekşe ile boyanır. Son adım, invaziv tümör hücrelerini invaziv olmayan tümör hücrelerinden ve kanserle ilişkili stromal hücrelerden ayırmak için lazer mikrodiseksiyondur. Sonuç olarak, moleküler profilleme teknikleri, çevredeki tümör mikroçevresindeki istilacı ve invaziv olmayan tümör hücrelerinin ve stromal hücrelerin biyolojisini karakterize etmek için kullanılabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, kolorektal kanserin üç boyutlu organotipik ko-kültür modellerinde istilacı hücrelerin istilacı olmayan hücrelerden ne kadar net bir şekilde ayırt edilebilir olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi. Başlamak için, normal insan kolon mukoza dokusu örneklerini doğrudan laboratuvardaki cerrahi ameliyathaneden alın. Bir örneği 10 santimetrelik bir doku kültürü kabının ortasına yerleştirin, ardından kültürü üç kez fosfat tamponlu salin veya penisilin, streptomisin ve mantar bölgesi ile desteklenmiş PBS ile yıkayın.

Steril forseps ve neşter ile son yıkamadan sonra aspire etmeyin, dokuyu küçük parçalar halinde kesin. Ardından her bir parçayı neşter bıçağıyla çizilen bir haçın ortasına yerleştirin. 12 oyuklu bir plakada, kültüre yapışmasını sağlamak için neşteri doku üzerinde nazikçe sallayın.

750 mikrolitre primer fibroblast büyüme ortamındaki örnekler, dokuyu yüzmesine izin vermeden batırmalıdır. Daha sonra numuneleri önümüzdeki beş gün içinde 37 santigrat derece, %5 ila %10 CO2 inkübatöre yerleştirin. Fibroblastlar yaklaşık yedi gün sonra dokunun kenarından yavaş yavaş büyümeye başlayacaktır.

Bu, yaklaşık üç ila dört hafta sonra daha görünür olacaktır. Ve eğer yeterli fibroblast büyüyorsa, hücreler ayrıldıktan sonra her bir oyuğa 750 mikrolitre tripsin ekleyin ve bunları fibroblast emdirilmiş organotipik jel için bir T 25 doku kültürü şişesine aktarın. İlk olarak, takviye edilmiş dmm'de jel başına 500.000 hücre içeren bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın.

Organotipik jelleri, jel başına bir mililitrede dokuz jel için metin protokolünde bulunan oranlarda buz üzerinde oluşturun. 10 mililitre hazırlayın ve kabarcıkları önlemek için hafifçe karıştırın. Daha sonra 24 Kuyulu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre ekleyin ve nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Jellerin bir saat sonra sertleşmesine izin vermek için, jellerin üzerine bir mililitre takviye edilmiş DM EM ekleyin ve gece boyunca inkübatöre geri dönün. Ertesi gün. Jellerin üst kısmından ortamı aspire edin ve jel kaplı naylon tabakalar için 500.000 kolorektal kanser epitel hücresi içeren bir mililitre ortam plakalayın.

Steril forseps kullanarak önceden 1,5 santimetre x 1,5 santimetre ölçülerinde steril otoklavlar naylon levhalar hazırlayın. Gerekli sayıda naylon tabakayı 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Jel karışımını metin protokolünde tarif edildiği gibi buz üzerinde hazırlayın ve jel karışımına pembeye dönene kadar 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin, bu da çözeltinin nötralize olduğunu gösterir.

Daha sonra her bir naylon tabakaya bu çözeltiden 250 mikrolitre ekleyin. Daha sonra jelin sertleşmesini sağlamak için 37 santigrat derecede% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, her 10 santimetrelik kültür kabına PBS'de 10 mililitre% 1'lik bir glutaraldehit çözeltisi ekleyin.

Jel sertleştikten sonra dört santigrat derecede bir saat inkübe edilmeden önce, naylon tabakaları PBS'de üç kez ve bir kez takviye edilmiş dme'de yıkayın. Organotipik jelleri, paslanmaz çelik levhaların bir tripod şeklinde katlanmasıyla hazırlanan istila sterilize edilmiş iskele ızgaraları için çelik ızgaralara yükseltmek için levhaları gece boyunca aynı tamponda dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, altı kuyulu bir plakanın her bir oyuğuna çelik bir ızgara yerleştirmek için sterilize edilmiş forseps ve etanol kullanın.

Her bir ızgaraya kollajen tarafı yukarı bakacak şekilde jel kaplı bir naylon tabaka yerleştirin. Organotipik jelleri 24 oyuklu plakadan bir spatula, sterilize edilmiş ve etanol kullanarak yükseltilmiş naylon tabakaya dikkatlice aktarın. Naylon tabaka ortamla temas edene kadar ancak suya batırılmayana kadar kuyuyu takviye edilmiş D mem ile doldurun.

Ortamın organotipik jele temas etmediğinden emin olun. % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede 14 gün inkübe edin. Ortamı iki günde bir değiştirmek.

Naylon levha da dahil olmak üzere tüm organotipik tabakayı kuyudan çıkarın ve streç film üzerine yerleştirin. Organotipik ve naylon tabakayı temiz, tek kullanımlık bir neşter kullanarak ikiye bölün ve her iki yarıyı da 24 saat boyunca formaldehit içinde sabitleyin. Oda sıcaklığında, formaldehiti 24 saat sonra% 70 etanol ile değiştirin ve lazer mikrodiseksiyon yapmak için parafine gömmeden, kesit ayırmadan ve boyamadan önce gece boyunca bırakın.

İlk bölüm, organotipik olarak 10 mikron kalınlığa kadar membran üzerine monte edilmiş slaytlar. Bölümleri metin protokolünde açıklandığı gibi tedavi ettikten sonra, seçilen platform formunu kullanarak lazer mikrodiseksiyon yapmaya hazırlanın. Cam sürgünü, leke bölümü mikros disseke edilecek şekilde yerleştirin.

Mikroskop aşamasına yüzü aşağı bakacak şekilde, 0.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünü toplama kasetine monte edin ve mikro diseke dokunun doğrudan görüş altında toplanacağı kapağa 50 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. İlgilenilen dokuyu tanımlamak için joystick'i kullanın ve yazılım arayüzünü kullanarak, tümör istilası cephesinde mikrodiseke edilecek hücreleri vurgulayarak lekeli organik bölüme açıklama ekleyin. Lazere, hem vurgulanan bölümü kesmesi hem de mikrodiseksiyon dokusunu mikro santrifüj tüpünün kapağına itmesi gereken ateşleme talimatı verin.

İlgilenilen analiti çıkarmak için numuneleri uygun bir yöntemle işlemeye devam edin. Organotipik stroma invazyon yapan SW 480 kolorektal kanser hücrelerinin lazer mikrodiseksiyon görüntüleri burada gösterilmektedir. Krestal menekşe, kolorektal kanser epitel hücrelerini vurgulamak için kullanılır.

İnvaziv tümör adaları daha sonra lazer diseksiyon gerçekleşmeden önce tanımlanır ve kesilen parça bir toplama cihazına taşınır. İnvaziv olmayan hücreler ve stromal hücreler aynı metodoloji kullanılarak tanımlanır ve izole edilir. Üç boyutlu kokültürler, invaziv tümör cephesindeki hücreler ile tabakalı tümör bölgelerindeki hücreler arasında diferansiyel olarak eksprese edilen mikroRNA'ların karşılaştırılması için mikro RNA profillemesi ile analiz edildi.

Veriler tam değişime ve veri değerlerine göre artı veya eksi iki kat sıralandı. İnvaziv kenar hücreleri ile non-invaziv kenar hücreleri arasındaki diferansiyel mikro RNA gen ekspresyonunu gösteren temsili bir deneyden elde edilen değişiklik sunulmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, anatomik olarak uygun organotipik modellerin nasıl oluşturulacağı ve daha fazla çalışma için tek tek hücre popülasyonlarını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonun nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız. Vay canına.