Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve

Bu prosedürün genel amacı, invaziv tümör önündeki malign epitel hücreleri ile kanserle ilişkili stromal hücreler arasındaki ara yüzeydeki özgün biyolojiyi karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle kolon implantlarından primer fibroblast kültürleri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, primer kolon fibroblastları ve kültürlenmiş kolorektal kanser hücreleri kullanılarak organotipik ko-kültür modellerinin oluşturulmasıdır.

Sıradaki organotipik modeller, formalin ile fikse edilip membran montajlı lamlara kesitlenir ve kristal viyole ile boyanır. Son adım, istila eden tümör hücrelerini, istila etmeyen tümör hücrelerinden ve kanserle ilişkili stromal hücrelerden ayırmak için yapılan lazer mikrodisseksiyondur. Nihayetinde, istila eden ve etmeyen tümör hücrelerinin yanı sıra çevreleyen tümör mikroçevresindeki stromal hücrelerin biyolojisini karakterize etmek için moleküler profilleme teknikleri kullanılabilir.

Bu yöntemle ilgili fikrimiz, kolorektal kanserin üç boyutlu organotipik ko-kültür modellerinde, istilacı hücrelerin istilacı olmayan hücrelerden ne kadar net bir şekilde ayırt edilebildiğini fark ettiğimizde ortaya çıktı. Başlangıç olarak, normal insan kolon mukozası doku örneklerini doğrudan cerrahi ameliyathaneden laboratuvara alın. Bir örneği 10 santimetrelik bir doku kültürü kabının merkezine yerleştirin, ardından kültürü penisilin, streptomisin ve fungi zone ile desteklenmiş fosfat tamponlu salin veya PBS ile üç kez yıkayın.

Steril pens ve bistüri ile yapılan son yıkamadan sonra aspirasyon yapmayın; dokuyu küçük parçalara bölün. Ardından, her bir parçayı bistüri ucuyla çizilmiş bir haçın merkezine yerleştirin. 12 kuyucuklu bir plaka içerisinde, dokunun kültüre yapışmasını sağlamak için bistüriyi doku üzerinde nazikçe sallayın.

Örnekleri, dokuyu yüzdürmeden tamamen örtecek şekilde 750 µL primer fibroblast büyüme ortamına yerleştirin. Ardından örnekleri sonraki beş gün boyunca 37 °C ve %5-10 CO2 içeren bir inkübatöre koyun. Yaklaşık yedinci günde, fibroblastlar dokunun kenarlarından yavaşça büyümeye başlayacaktır.

Bu durum yaklaşık üç ila dört hafta sonra daha belirgin hale gelecektir. Eğer yeterince fibroblast büyümesi gerçekleşmişse, hücreler ayrıştıktan sonra her kuyucuğa 750 µL tripsin ekleyin; ardından hücreleri toplayın ve fibroblast yüklü organotipik jel için bir T 25 doku kültürü flakonuna aktarın. Öncelikle, desteklenmiş dmm içerisinde jel başına 500.000 hücre içeren bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın.

Organotipik jelleri, metin protokolünde belirtilen oranlarda, jel başına bir mililitre olacak şekilde dokuz jel için buz üzerinde hazırlayın. 10 mililitre hazırlayın ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için nazikçe karıştırın. Ardından, 24 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa bir mililitre ekleyin ve nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Jellerin bir saat sonra donmasını sağlamak için, jellerin üzerine bir mililitre desteklenmiş DM EM ekleyin ve gece boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, jellerin üzerindeki medyumu aspire edin ve jel kaplı naylon levhalar üzerine 500.000 kolorektal kanser epitelyal hücresi içeren bir mililitre medyum ekleyin.

Steril pensler kullanarak önceden 1,5 santimetre x 1,5 santimetre boyutlarında steril otoklavlanmış naylon levhalar hazırlayın. Gerekli sayıda naylon levhayı 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Jel karışımını metin protokolünde açıklandığı gibi buz üzerinde hazırlayın ve çözeltinin nötralize olduğunu belirten pembe renge dönene kadar jel karışımına 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyin.

Ardından, bu çözeltiden 250 µL her bir naylon tabakaya ekleyin. Jelinin donması için %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonra, her bir 10 cm'lik kültür kabına, PBS içinde %1'lik glutaraldehit çözeltisinden 10 mL ekleyin.

Jel set olduktan sonra, dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe etmeden önce, naylon sayfaları üç kez PBS ile ve bir kez desteklenmiş dme ile yıkayın. Organotipik jelleri, paslanmaz çelik sayfaların tripod formunda katlanmasıyla hazırlanmış sterilizasyonlu invazyon iskale ızgaralarına yerleştirmek için sayfaları aynı tampon çözeltide, dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ardından, altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir çelik ızgara yerleştirmek için sterilize edilmiş ve etanolle temizlenmiş pensleri kullanın.

Kolajen tarafı yukarı bakacak şekilde, her ızgaranın üzerine jel kaplı bir naylon tabaka yerleştirin. Organotipik jelleri, sterilize edilmiş ve etanolle temizlenmiş bir spatula kullanarak 24 kuyucuklu plakadan yükseltilmiş naylon tabakaya dikkatlice aktarın. Kuyucuğu, naylon tabaka besiyeri ile temas edecek ancak tamamen gömülmeyecek şekilde takviye edilmiş D mem ile doldurun.

Besiyerinin organotipik jelle temas etmediğinden emin olun. %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de 14 gün boyunca inkübe edin. Besiyerini her iki günde bir yenileyin.

Naylon tabaka dahil tüm organotipik kültürü kuyucuktan çıkarın ve streç filme yerleştirin. Organotipik kültürü ve naylon tabakayı temiz, tek kullanımlık bir bistüri ile ikiye bölün ve her iki yarıyı 24 saat boyunca formaldehit içinde sabitleyin. 24 saat sonra, oda sıcaklığında formaldehiti %70 etanol ile değiştirin ve parafine gömme, kesme ve boyama işlemlerinin ardından lazer mikrodisseksiyonu gerçekleştirmek için gece boyunca bekletin.

İlk bölüm, organotipik kesitlerin membran montajlı lamlar üzerine 10 mikron kalınlığında hazırlanmasıdır. Metin protokolünde açıklandığı şekilde kesitleri işledikten sonra, seçilen platformu kullanarak lazer mikrodissection işlemini gerçekleştirmeye hazırlanın. Boyanmış kesiti içeren cam lamı, mikrodissection yapılacak şekilde yerleştirin.

Mikroskop tablasına yüzü aşağı gelecek şekilde, bir 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü toplama kasetine yerleştirin ve mikro diseksiyonla toplanacak dokunun doğrudan görünür altında kalacağı kapağa 50 mikrolitre hücre liziz tamponu ekleyin. Joystick'i kullanarak ilgilenilen dokuyu belirleyin ve yazılım arayüzünü kullanarak, tümör invazyon cephesinde mikro diseksiyon yapılacak hücreleri vurgulayarak boyanmış organik kesiti işaretleyin. Lazerin ateşlenmesi komutunu verin; bu işlem hem vurgulanan bölümü kesmeli hem de mikro diseksiyonla ayrılan dokuyu mikro santrifüj tüpünün kapağına itmelidir.

İlgilenilen analiti özütlemek için numuneleri uygun bir yöntemle işlemeye geçin. Organotipik stromaya istila eden SW 480 kolorektal kanser hücrelerinin lazer mikrodissection görüntüleri burada gösterilmiştir. Kolorektal kanser epitelyal hücrelerini vurgulamak için kristal viyole kullanılmıştır.

Ardından, lazer diseksiyonu gerçekleştirilmeden önce invaziv tümör adaları tanımlanır ve kesilen parça bir toplama cihazına aktarılır. İnvaziv olmayan hücreler ve stromal hücreler aynı metodoloji kullanılarak tanımlanır ve izole edilir. Üç boyutlu ko-kültürler, invaziv tümör önündeki hücreler ile stratifiye tümör bölgelerindeki hücreler arasında diferansiyel ekspresyon gösteren mikroRNA'ların karşılaştırılması amacıyla mikroRNA profillemesi ile analiz edilmiştir.

Veriler, toplam değişim ve artı veya eksi iki kat veri değerlerine göre sıralanmıştır. Temsili bir deneyden elde edilen değişimler, invaziv kenar hücreleri ile invaziv olmayan kenar hücreleri arasındaki diferansiyel mikro RNA gen ekspresyonunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, anatomik olarak uygun organotipik modellerin nasıl oluşturulacağı ve daha ileri çalışmalar için bireysel hücre popülasyonlarını izole etmek amacıyla lazer mikrodissection yönteminin nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.Vay canına.