Name: Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve Ex vivo Fibroblastlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Keşfedin, lazer mikrodisseksiyon kullanarak kolorektal kanser hücrelerinin invaziv tümör önündeki biyolojisini ve kanserle ilişkili stromal hücreleri nasıl karakterize edebilirsiniz. Bu 3 boyutlu organotipik model, moleküler profilleme için hücre popülasyonlarını izole etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MB, MRC dostluk hibe finansmanı ile desteklenmektedir. KP ve AHM Wessex Tıbbi Araştırma ve Birleşik Krallık Kanser Araştırma / RCS (İngiltere) (C28503/A10013) hibe finansmanı ile desteklenmektedir. Biz Southampton Histokimyas Araştırma Birimi Üniversitesi&#39;nin destek için müteşekkiriz.

Kolon Eksplantlarından Primer Fibroblast Kültürleri 1.. Kurulması <ol><li> Doğrudan cerrahi ameliyathanede normal insan kolon mukoza dokusu örnekleri elde edilir ve 7-10 içinde askıya PBS ml 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve / ml Fungizone, 0.25 ug ile takviye edilmiştir. </li><li> Laboratuarda, 10 cm&#39;lik bir doku kültürü çanağı merkezinde numune yerleştirin ve PBS / Pen-strep / fungizon ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra aspire etmeyin. </li><li> Steril forseps ve neşter ile (yaklaşık 2mm) küçük parçalar halinde doku kesilir ve 12 plaka olarak neşter ile çizilmiş bir haç merkezine her bir parçayı yerleştirin. Yapışması sağlamak için doku üzerinde hafifçe neşter sallayın. </li><li> Kültür 750 ul numuneler birinci fibroblast büyüme ortamı subme gerekir, (DMEM,% 20 fetal buzağı serumu (FCS), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 292 ug / ml L-glutamin ile takviye edilmiş)float etkinleştirme olmadan doku RGE. 2 günde yeniden besleme dışında önümüzdeki 5 gün içinde plaka rahatsız kaçının. </li><li> Sonraki 5 gün boyunca yavaş yavaş fibroblastlar doku kenarından dışarı büyümeye başlar. Yaklaşık 7 gün, bu daha görünür olacak. Dışarı büyüyen yeterli fibroblastlar varsa Yaklaşık 3-4 hafta sonra, ve, her bir oyuğa 750 ul tripsin eklemek. Hücreler T-25 doku kültürü şişesi, havuz ve transfer (5-10 dk sürebilir) müstakil sonra. </li></ol> 2.. Organotipik Hazırlık Fibroblast emprenye organotipik jelin hazırlanması: <ol><li> % 10 FCS ve 292 ug / ml L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde Organotipik başına 5 x 10 5 hücre ihtiva eden bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın. </li><li> Aşağıdaki oranlarda, buz üzerinde organotipik jeller Makyaj: <ul><li> Rat-Kuyruk Kollajen 7 hacim: Matrıgel karışımı (1:1) </li><li> Süzüldü 10x DMEM 1 hacim </li><li> FCS 1 hacim </li><li> 5 x 10 5 fibroblastlar içeren fibroblast hücre süspansiyonu, 1 hacim 9 jeller (jel başına 1 mi) 10 ml hazırlamak ve kabarcıklarını önlemek için yavaşça karıştırın. </li></ul></li><li> , 24 oyuklu plakanın her oyuğuna 1 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca kuluçkaya bırakınız Jeller ayarlaması için nemli bir atmosferde C °. 1 saat sonra, jellerin üzerine 1 ml DMEM (% 10 FCS) / Glut ekleyin ve gece boyunca inkübatör dönün. </li><li> Ertesi gün, jeller ve 5 x 10 5 CRC epitel hücreleri ihtiva eden ortam plaka 1 ml üst aspirat ortamı. </li></ol> Jel kaplı naylon Formlarının hazırlanması: <ol start="5"><li> , 1.5 cm boyutlarında otoklavlanmalıdır naylon sayfaları peşin, 1.5 cm x steril hazırlayın. </li><li> Steril forseps kullanarak, 10 cm kültür çanak (genellikle 4 naylon yaprak çanak başına kalabilirler) naylon yaprak gerekli sayıda koyun. </li><li> Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde jel Makyaj (250 ul toplamhacim) naylon tabaka başına gereklidir: <ul><li> Rat-Kuyruk Kollajen 7 hacimleri </li><li> Süzüldü 10x DMEM 1 hacim </li><li> FCS 1 hacim </li><li> 1 DMEM hacmi,% 10 FCS / Glut </li></ul></li><li> Çözelti, sarı ise, çözelti donene kadar 50 ul alikolar içinde 0.1 M NaOH ilave edilerek etkisiz hale getirir. </li><li> Her bir naylon tabaka için, bu çözeltinin 250 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de inkübe ° C jel ayarlaması için 30 dakika boyunca% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde. </li><li> PBS içinde% 1 glutaraldehid çözelti hazırlayın. Jel belirledi bir kez, her 10 cm kültür tabağına 10 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yıkama naylon levhalar PBS ve DMEM içinde 1x (% 10 FCS) / Glu içinde 3 kat ve 4 ° C de DMEM / Glu içinde gece boyunca inkübe </li></ol> Işgali için çelik ızgaralar üzerine organotipik jeller Raising: <ol start="12"><li> Tripod oluşum içine paslanmaz çelik levhalar katlayarak iskele ızgaralarını hazırlıyor. Kullanmadan önce otoklav.</li><li> Altı çukurlu bir levhanın her bir kuyuya bir çelik ızgara yerleştirmek için, etanol içinde sterilize forseps kullanın. </li><li> Her ızgara üzerine, üst kollajen tarafı ile bir jel kaplı naylon yaprak yerleştirin. </li><li> Dikkatlice etanol steril bir spatula kullanılarak yükseltilmiş naylon tabaka için 24 oyuklu plaka Organotipik jeller aktarın. </li><li> Naylon tabaka ortamı ile temas halinde olduğu, ancak daldırılmamaktadır kadar% 10 FCS ile takviye edilmiş DMEM,% 10 FCS / Glut ile kuyu doldurun. Orta organotipik jel dokunmayın olmadığından emin olun. </li><li> Her 2 günde bir ortam değiştirme,% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de 14 gün boyunca inkübe edin. </li></ol> 3.. Organotipik Fixation <ol><li> Kuyudan naylon tabaka dahil tüm organotipik çıkarın ve sarılmak film yerleştirin. </li><li> Organotipik ve temiz bir tek neşter kullanılarak naylon sayfasını ikiye bölmek ve oda sıcaklığında 24 saat formaldehit içinde iki yarıyı düzeltmek. </li><li> % 70 Ethan ile formaldehit değiştirinol, 24 saat sonra ve öncesinde, parafine gömme, kesme, boyama ve bir gece bekletin. </li></ol> İnvaziv Margin 4. Lazer Diseksiyon <ol><li> Zarı üzerine 10 um-kalınlıkta Bölüm slaytlar. </li><li> 1 dakika boyunca Ksilen uygulayarak Deparaffinize bölümleri, daha sonra, ilave 1 dakika boyunca iksilenin çıkması ve% 75 etanol içinde çözmek. </li><li> 1 dakika boyunca% 0.125 kresil menekşe çözeltisi ile etanol ve leke çıkarın. Kresil Violet epitel hücreleri vurgular ve stromadan kolay ayrımcılığına izin verir. </li><li> Kresil menekşesi çıkarın ve% 100 etanol ile yıkamadan önce, ilave 1 dakika boyunca% 100 etanol geçerlidir. 30 dakika boyunca kuru hava slaytlar izin verin. </li><li> Seçilen platformu (örneğin Leica AS sistemi) kullanılarak lazer mikrodiseksiyon Davranış. </li><li> Mikroskop sahnede yüzü aşağı microdissected gereken lekeli bölümü ile cam slayt yerleştirin. </li><li> Toplama kaseti bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü monte edin ve 50 ul ilave edinmicrodissected doku toplayacak içine kapağa hücre liziz tamponu (örn., DNA, RNA ya da protein lizis tamponu). </li><li> Direkt görüş altında, ilgi doku tespit joystick&#39;i kullanın ve yazılım arayüzü kullanarak, tümör yayılması önünde microdissected edilecek hücreleri vurgulayarak, lekeli organik bölümü açıklama. </li><li> Vurgulanan bir bölümünü kesmek gerekir hem de yangın lazer, talimat ve mikrosantrifüj tüp kap içine microdissected doku itmek. </li><li> Bir kez yeterli malzeme elde edilmiştir, toplama kaseti çıkarmak mikrosantrifüj tüpü kapatmak ve tüpün altına lizis tamponu çekmek için yavaşça dönerler. </li><li> Mikrodisseksiyon tamamlanana kadar buz üzerinde örnekleri yerleştirin. Uygun bir yöntem ile işlem örnekleri ilgilenilen analit çıkarmak için. </li></ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li>
<li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+invasion+in+an+organotypic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li>
<li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li>
<li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li>
<li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li>
<li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+roads+to+maturity%3A+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+cells+and+snap+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li>
<li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları anlatmaktadır.

Burada spesifik olarak izole edilmesi ve epitel hücreler ve stromal hücrelerin bir 3 boyutlu ko-kültür yapı metastatik ilerlemesi en erken aşamaları sırasında kanser bağlantılı stroma işgal etme kapasitesine kazanmış tümör hücrelerini karakterize etmek için bir yöntem tarif eder. Ex vivo insan kolonik fibroblastlar ihtiva eden bir sentetik stroma ile yan yana CRC epitel hücrelerinin oluşan Co-kültür modelleri 3-boyutlu olarak CRC işgali yapısını incelemek için kullanılmıştır. In...

Organik tip ko-kültürler bu temel hücre-dışı matris bileşenlerini ihtiva eden bir 1-3 kollajen jel habis epitel hücreler ve stromal hücrelerin yan yana 3-boyutlu olarak in vivo tümör mikro-ortam içinde yeniden yardım doku mühendisliği modellerdir. Prensip olarak tümör istilasını ölçülmesi için bir yöntem olarak tasarlanmış, organotypics in vivo hayvan modellerinde bağımlılığı azaltmak ve bu bezine akın eden hücre, bir mono-dağılmış halde 2-4 içine yapay karşıya hareket ettiği Transwell tahlilleri, in vitro olarak, diğer tekniklerin eksikliklerini kaçının. Fibroblastlar gibi, bu modellerde görülen stromal hücreleri dahil, malign yayılma ve metastaz 3-4 düzenlenmesinde tümör mikro-ortamınm rol yansıtır, ancak stroma fenotipik hetero gibi olduğu organotipik fizyolojik önemi maksimize etmek için modeller, hedef organ, anatomik olarak doğru bir ex vivomümkün olan her yerde 3,6 fibroblastlar dahil edilmelidir. Organotypics tümör ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için çok yönlü bir platform vardır ve giderek kimyasal inhibitörlerinin tümör işgali üzerine etkisini ve hedeflenen gen değişiklikleri 7,8 incelemek için yeni yollar kullanılır. Invaziv tümör marjı incelenmesi özellikle heyecan verici bir görünüm sergiliyor. Organotipik modellerinde, kurulan kolorektal kanser (CRC) hücre çizgileri, tipik olarak iyi tabakalı epitel tabakası üretir ve kesit olarak, hücre dışı matris (ECM) işgal kapasitesi kazanmış hücreler kolay bir şekilde görülebilir. Lazer mikrodiseksiyon kullanarak ve izolasyon bunları okuyan bu hücreleri ayıklanması tümör ve in vivo tümör ilişkili stromal hücrelerinin kurulan mikro-topografik düzensizliğin ışığında, kolorektal kanser metastaz kökeniyle ilgili önemli biyolojik anlayışlar ortaya koyabilir ve nasıl daha verimli olabilir hedeflenmiş. Benn aşağıdaki metodoloji, doku yazılı onam sağlanan örnekleri ve çalışma bağışlanan tüm hastalar bölgesel araştırma etik komitesi kurumlar tarafından onaylanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Kolorektal kanser hücre hatları - gösterilen örnek SW480</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-228</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen</td><td>BD Biosciences</td><td>354265</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Naylon membran</td><td>Merck Millipore VVLP01300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ızgara</td><td>Mesh Şirketi</td><td>WSS20-A4</td><td>themeshcompany.com</td></tr><tr><td>Lazer mikrodiseksiyon platformu</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica AS LMD</td><td></td></tr><tr><td>Membran montajlı slaytlar</td><td>Moleküler cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet</td><td>Merck Millipore 1052350025</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

moleküler kolorektal kanser hücrelerinin bir 3-boyutlu modeli İnvaziv tümör mikro profili ve<em&gt; ex vivo</em&gt; fibroblastlar

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Kolorektal kanser işgalci (CRC) hücreleri, onların kardeş hücrelerden kurtulma stromayı sızmak ve hücre dışı matris (ECM) bozulmasina kapasitesini elde etmiş. Bu hücre fenotipik ayrı grubun biyolojisini karakterize ölçüde metastatik kaskad sırasında erken olayların anlayışımızı geliştirmek olabilir. Tümör işgali malign epitel ve kanser bağlantılı stroma arasında çift yönlü etkileşimler tarafından kolaylaştırdı dinamik bir süreçtir. Bu ko-kültür ve lazer mikro-disseksiyon teknikleri Organotipik kombine tümör stroma-arayüzünde hücreye özel tepkileri incelemek amacıyla. Fibroblastlar gibi önemli stromal bileşenleri 3-dimentioanally kanser epitelyal hücrelere sahip ortak-kültürlenir, olduğu Organik tip modeller, yakın pH incelenecek istila ve kansere stroma etkileşimi sağlayacak yüksek manuel olarak kullanılabilen deneysel araçlardırysiological koşulları. Lazer mikrodisseksiyon (LMD) mikron düzeyinde hassasiyetle tümör dokusu içinde çeşitli katmanlarının cerrahi diseksiyonu ve çıkarma, gerektiren bir tekniktir. Genomik Transkriptomik ve epigenetik profilleme ile bu teknikleri birleştirerek biz tümör hücreleri istila ve stromal doku çevresindeki moleküler özelliklerine daha derin bir anlayış geliştirmek ve bunu yaparken de potansiyel yeni biyomarkerler ve CRC ilaç gelişimi için fırsatlar ortaya hedefliyoruz.

Biz CRC hücre hatları ve stromal hücrelerin çoklu kombinasyonlar için yukarıdaki yöntemi uyguladık. Burada sunulan bir örnek, primer insan ex vivo kolon fibroblastlar ile SW480 epitelyal hücre hatları olduğu, CRC. 3-boyutlu ko-kültürler istilacı tümör ön hücreler arasında farklı şekilde eksprese miRNAs karşılaştırılmasında mikroskopisi ve lazer yakalama mikro-kesim (Şekil 2) tabi tutuldu (Şekil 1), inşa edilmiş ve microRNA (miRNA) profil (Şekil 3) ile analiz ed...

Sentetik, doku mühendisliği kolorektal kanser modelleri, lazer microdissected stroma hücreleri ve moleküler profil invaziv ön ve kanserle ilişkili stromal hücre tümör hücreleri arasındaki ara yüzeyde ayırt edici karakterize biyoloji ve incelemek için bir yeni ve manuel olarak kullanılabilen bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Bu prosedürün genel amacı, invaziv tümör önündeki malign epitel hücreleri ile kanserle ilişkili stromal hücreler arasındaki ara yüzeydeki özgün biyolojiyi karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle kolon implantlarından primer fibroblast kültürleri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, primer kolon fibroblastları ve kültürlenmiş kolorektal kanser hücreleri kullanılarak organotipik ko-kültür modellerinin oluşturulmasıdır.Sıradaki organotipik modeller, formalin ile fikse edilip membran montajlı lamlara kesitlenir ve kristal viyole ile boyanır. Son adım, istila eden tümör hücrelerini, istila etmeyen tümör hücrelerinden ve kanserle ilişkili stromal hücrelerden ayırmak için yapılan lazer mikrodisseksiyondur. Nihayetinde, istila eden ve etmeyen tümör hücrelerinin yanı sıra çevreleyen tümör mikroçevresindeki stromal hücrelerin biyolojisini karakterize etmek için moleküler profilleme teknikleri kullanılabilir.Bu yöntemle ilgili fikrimiz, kolorektal kanserin üç boyutlu organotipik ko-kültür modellerinde, istilacı hücrelerin istilacı olmayan hücrelerden ne kadar net bir şekilde ayırt edilebildiğini fark ettiğimizde ortaya çıktı. Başlangıç olarak, normal insan kolon mukozası doku örneklerini doğrudan cerrahi ameliyathaneden laboratuvara alın. Bir örneği 10 santimetrelik bir doku kültürü kabının merkezine yerleştirin, ardından kültürü penisilin, streptomisin ve fungi zone ile desteklenmiş fosfat tamponlu salin veya PBS ile üç kez yıkayın.Steril pens ve bistüri ile yapılan son yıkamadan sonra aspirasyon yapmayın; dokuyu küçük parçalara bölün. Ardından, her bir parçayı bistüri ucuyla çizilmiş bir haçın merkezine yerleştirin. 12 kuyucuklu bir plaka içerisinde, dokunun kültüre yapışmasını sağlamak için bistüriyi doku üzerinde nazikçe sallayın.Örnekleri, dokuyu yüzdürmeden tamamen örtecek şekilde 750 µL primer fibroblast büyüme ortamına yerleştirin. Ardından örnekleri sonraki beş gün boyunca 37 °C ve %5-10 CO2 içeren bir inkübatöre koyun. Yaklaşık yedinci günde, fibroblastlar dokunun kenarlarından yavaşça büyümeye başlayacaktır.Bu durum yaklaşık üç ila dört hafta sonra daha belirgin hale gelecektir. Eğer yeterince fibroblast büyümesi gerçekleşmişse, hücreler ayrıştıktan sonra her kuyucuğa 750 µL tripsin ekleyin; ardından hücreleri toplayın ve fibroblast yüklü organotipik jel için bir T 25 doku kültürü flakonuna aktarın. Öncelikle, desteklenmiş dmm içerisinde jel başına 500.000 hücre içeren bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın.Organotipik jelleri, metin protokolünde belirtilen oranlarda, jel başına bir mililitre olacak şekilde dokuz jel için buz üzerinde hazırlayın. 10 mililitre hazırlayın ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için nazikçe karıştırın. Ardından, 24 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa bir mililitre ekleyin ve nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Jellerin bir saat sonra donmasını sağlamak için, jellerin üzerine bir mililitre desteklenmiş DM EM ekleyin ve gece boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, jellerin üzerindeki medyumu aspire edin ve jel kaplı naylon levhalar üzerine 500.000 kolorektal kanser epitelyal hücresi içeren bir mililitre medyum ekleyin.Steril pensler kullanarak önceden 1,5 santimetre x 1,5 santimetre boyutlarında steril otoklavlanmış naylon levhalar hazırlayın. Gerekli sayıda naylon levhayı 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Jel karışımını metin protokolünde açıklandığı gibi buz üzerinde hazırlayın ve çözeltinin nötralize olduğunu belirten pembe renge dönene kadar jel karışımına 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyin.Ardından, bu çözeltiden 250 µL her bir naylon tabakaya ekleyin. Jelinin donması için %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonra, her bir 10 cm'lik kültür kabına, PBS içinde %1'lik glutaraldehit çözeltisinden 10 mL ekleyin.Jel set olduktan sonra, dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe etmeden önce, naylon sayfaları üç kez PBS ile ve bir kez desteklenmiş dme ile yıkayın. Organotipik jelleri, paslanmaz çelik sayfaların tripod formunda katlanmasıyla hazırlanmış sterilizasyonlu invazyon iskale ızgaralarına yerleştirmek için sayfaları aynı tampon çözeltide, dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ardından, altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir çelik ızgara yerleştirmek için sterilize edilmiş ve etanolle temizlenmiş pensleri kullanın.Kolajen tarafı yukarı bakacak şekilde, her ızgaranın üzerine jel kaplı bir naylon tabaka yerleştirin. Organotipik jelleri, sterilize edilmiş ve etanolle temizlenmiş bir spatula kullanarak 24 kuyucuklu plakadan yükseltilmiş naylon tabakaya dikkatlice aktarın. Kuyucuğu, naylon tabaka besiyeri ile temas edecek ancak tamamen gömülmeyecek şekilde takviye edilmiş D mem ile doldurun.Besiyerinin organotipik jelle temas etmediğinden emin olun. %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de 14 gün boyunca inkübe edin. Besiyerini her iki günde bir yenileyin.Naylon tabaka dahil tüm organotipik kültürü kuyucuktan çıkarın ve streç filme yerleştirin. Organotipik kültürü ve naylon tabakayı temiz, tek kullanımlık bir bistüri ile ikiye bölün ve her iki yarıyı 24 saat boyunca formaldehit içinde sabitleyin. 24 saat sonra, oda sıcaklığında formaldehiti %70 etanol ile değiştirin ve parafine gömme, kesme ve boyama işlemlerinin ardından lazer mikrodisseksiyonu gerçekleştirmek için gece boyunca bekletin.İlk bölüm, organotipik kesitlerin membran montajlı lamlar üzerine 10 mikron kalınlığında hazırlanmasıdır. Metin protokolünde açıklandığı şekilde kesitleri işledikten sonra, seçilen platformu kullanarak lazer mikrodissection işlemini gerçekleştirmeye hazırlanın. Boyanmış kesiti içeren cam lamı, mikrodissection yapılacak şekilde yerleştirin.Mikroskop tablasına yüzü aşağı gelecek şekilde, bir 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü toplama kasetine yerleştirin ve mikro diseksiyonla toplanacak dokunun doğrudan görünür altında kalacağı kapağa 50 mikrolitre hücre liziz tamponu ekleyin. Joystick'i kullanarak ilgilenilen dokuyu belirleyin ve yazılım arayüzünü kullanarak, tümör invazyon cephesinde mikro diseksiyon yapılacak hücreleri vurgulayarak boyanmış organik kesiti işaretleyin. Lazerin ateşlenmesi komutunu verin; bu işlem hem vurgulanan bölümü kesmeli hem de mikro diseksiyonla ayrılan dokuyu mikro santrifüj tüpünün kapağına itmelidir.İlgilenilen analiti özütlemek için numuneleri uygun bir yöntemle işlemeye geçin. Organotipik stromaya istila eden SW 480 kolorektal kanser hücrelerinin lazer mikrodissection görüntüleri burada gösterilmiştir. Kolorektal kanser epitelyal hücrelerini vurgulamak için kristal viyole kullanılmıştır.Ardından, lazer diseksiyonu gerçekleştirilmeden önce invaziv tümör adaları tanımlanır ve kesilen parça bir toplama cihazına aktarılır. İnvaziv olmayan hücreler ve stromal hücreler aynı metodoloji kullanılarak tanımlanır ve izole edilir. Üç boyutlu ko-kültürler, invaziv tümör önündeki hücreler ile stratifiye tümör bölgelerindeki hücreler arasında diferansiyel ekspresyon gösteren mikroRNA'ların karşılaştırılması amacıyla mikroRNA profillemesi ile analiz edilmiştir.Veriler, toplam değişim ve artı veya eksi iki kat veri değerlerine göre sıralanmıştır. Temsili bir deneyden elde edilen değişimler, invaziv kenar hücreleri ile invaziv olmayan kenar hücreleri arasındaki diferansiyel mikro RNA gen ekspresyonunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, anatomik olarak uygun organotipik modellerin nasıl oluşturulacağı ve daha ileri çalışmalar için bireysel hücre popülasyonlarını izole etmek amacıyla lazer mikrodissection yönteminin nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.Vay canına.

molecular-profiling-invasive-tumor-microenvironment-3-dimensional

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kolorektal kanser (CRC) uygulanabilir tek bir hücre üretmek için, daha sonra yüzey antijenleri (DotScan ÇHS mikroarray) tanıyan özelleştirilmiş antikor mikrodizinlerinde yakalanır ayrıştırılmasıyla için bir prosedür nitelendirdi. Mikroarray bağlı hücrelerin alt popülasyonlarda floresan boya ile monoklonal antikorlar kullanılarak floresans çoklama profilli olabilir.

Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

Biz onların mikroçevresindeki meme tümör hücreleri ve diğer hücreler arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için 3D kokültürü modeli geliştirdik bir invaziv fenotip darbe ilerlemesi. Bu modeller invaziv karıştığı parakrin kaynaklı proteolitik, kemokin / sitokin ve kinaz yolları hedefleyen ilaçlar için klinik öncesi ekranlar olarak hizmet verebilir.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

Video, 3D organotipik ko-kültür modelinin mikron düzeyinde hassasiyetle lazer diseksiyonunu açıklamaktadır. 3D organotipik modellerde, fibroblastlar gibi stromal bileşenler, kanser epitel hücreleri ile 3 boyutlu olarak birlikte kültürlenir. 3D model, invazyon ve kanser-stroma etkileşimlerinin yakın fizyolojik koşullarda incelenmesini sağlayan deneysel bir araç olarak hizmet eder.

Lazer Mikrodiseksiyon: İstilacı Kolorektal Kanser hücrelerini 3D Organotipik Kültür Modelinden İzole Etme Tekniği

Doku mühendisliği fibroblast türevli doğal matris epitel hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyen bir stromal alt-tabakayı üretmek için gelişmekte olan bir araçtır. Burada tümör hücre biyolojisi farklı stromal hücre tiplerinin etkisini değerlendirmek için bu yöntemi uygulayarak bir protokol sunulmuştur.

Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Oksijen ve besin sağlamak için bir perfüzyon biyoreaktör sistemi kullanılarak kültürlenebilen 3D meme kanseri vekilleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyoruz. Büyümeyi takiben, vekiller sabitlenir ve ilgilenilen parametrelerin değerlendirilmesi için parafine işlenir. Böyle bir parametrenin, hücre yoğunluğunun değerlendirilmesi açıklanmaktadır.

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Keşfedin, lazer mikrodisseksiyon kullanarak kolorektal kanser hücrelerinin invaziv tümör önündeki biyolojisini ve kanserle ilişkili stromal hücreleri nasıl karakterize edebilirsiniz. Bu 3 boyutlu organotipik model, moleküler profilleme için hücre popülasyonlarını izole etmenizi sağlar.

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve

Daha fazla video keşfet