Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, entegre olan viral vektörlerin genomdaki kesin konumlarını belirlemektir. Bu, önce biyotinlenmiş primerlerle yapılan bir lineer PCR reaksiyonu ile genomik DNA'daki vektör genom bağlantı sekanslarının bir dizi reaksiyonda katı fazda zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir; ürünün her iki ucunda bilinen DNA sekanslarına sahip çift zincirli DNA'lar üretilerek vektör genom bağlantılarının eksponansiyel amplifikasyonu sağlanır. Ardından, lamb PCR ürünlerine sekanslama adaptörleri eklenir.

Bilinmeyen flanke DNA'nın derin sekanslama ile sekanslanması ve karakterize edilmesi amacıyla, bu fragmanlar vektör entegrasyonlarının kesin konumlarını ortaya çıkarır. Sonuç, jel elektroforezi ile görüldüğü üzere, amplifiye edilmiş eklemlerin çeşitliliğidir. Bu yöntem, klinik gen tedavisi alan hastalarda viral vektör entegrasyon bölgesi dağılımı hakkında bilgi sağlar.

Bu yöntem ayrıca insersiyonel mutajenez, taramalar, virüs enfeksiyonu, kanser ve kök hücre klonalitesi veya T-hücresi çeşitliliği gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Prosedür, laboratuvarımdan bir teknisyen olan ina RA tarafından gösterilecektir. Bu prosedür için öncelikle linker kasetlerini hazırlayın; iki LCO Lego'nun her birinden 40 µL'yi, 110 µL tris hidroklorür ve 10 µL magnezyum klorür ile bir mikro santrifüj tüpünde karıştırın. Ardından, karışımı 95 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı blokta beş dakika inkübe edin ve sonrasında gece boyunca yavaşça oda sıcaklığına soğutun.

Ertesi gün, hazırlanan çift zincirli linker DNA'ya 300 µL su ekleyin ve bunları bir mikro santrifüj tüpü üzerinden filtreleyin. Konsantre linker DNA'yı tüpte toplamak için filtreyi santrifüjleyin. Ardından, tüpü filtreden geri alın.

Çıkışa 80 µL su ekleyin ve pipetleyin. PCR tüplerine 10 µL'lik alikotlar hazırlayın. Lamb için 50 µL'lik reaksiyon tüplerinde vektör genom eklemlerini ön yükseltmek için PCR kullanın.

Reaksiyon başına 50 µL için 1 ng ile 1 µg arasında örnek DNA ekleyin. NR koyun için en az 100 ng DNA kullanın. 25 µL'den fazla eklemeyin ve PCR'ı metindeki tablo ikiye göre gerçekleştirin.

İşlem tamamlandığında, her reaksiyona 0.5 µL ek teknik ekleyin ve PCR programını ikinci kez çalıştırın. İlk olarak, manyetik boncukları hazırlayın. 1.5 mL'lik bir tüpe 20 µL strept ENC kaplı manyetik boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin.

Ardından süpernatan fazını atın. Boncukları BSA içeren 40 µL PBS içinde süspande edin ve boncukları bir dakika daha ayırıcıya yerleştirin. Süpernatanı, 20 µL'lik 3 M lityum klorür çözeltisi yıkaması ile değiştirin.

Ardından, boncukları bir dakika boyunca separatöre yerleştirin. Süpernatantı 50 µL 6 M lityum klorür çözeltisi ile değiştirerek işlemi tamamlayın. Şimdi, manyetik boncuk karışımını PCR reaksiyon ürününe ekleyin ve bu karışımı oda sıcaklığında, hafifçe sallayarak iki saatten geceye kadar inkübe edin.

Biyotinillenmiş DNA, şerit tava ve kaplanmış boncuklar, dört santigrat derecede dört güne kadar saklanabilen kompleksler oluşturacaktır. Yüksek hassasiyeti nedeniyle lamb veya NR lamb ile devam edin. L-A-M-P-C-R, dikkatli yürütülmediği takdirde kontaminasyona eğilimlidir.

Burası PCR düzeyinde bir ortamdır ve temizliğe azami dikkat gösterilmesi büyük önem taşır. Numuneleri kontamine etmeden bilinmeyen flanker DNA'ları başarılı bir şekilde amplifiye etmek için, önce kompleksleri bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakın ve ardından DNA boncuklarını 100 µL su içinde yeniden süspande edin.

Ardından, kompleksleri bir dakika boyunca separatöre maruz bırakın. Ve bu kez DNA boncuk komplekslerini 8,25 µL su, 1 µL HEXA nükleotid tamponu, 0,25 µL dNTP'ler ve 0,5 µL cano polimeraz içeren bir karışım içinde yeniden süspande edin.

Bu karışımı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından 90 µL su ekleyin ve reaksiyonu bir dakika daha separatöre maruz bırakın. Daha sonra DNA boncuk komplekslerini 100 µL'lik su yıkama solüsyonu ile yeniden süspande edin.

Ayırıcıyı bir dakika daha kullanın ve restriksiyon enzimi reaksiyonunu hazırlayın. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra 8.5 µL su, 1 µL restriksiyon enzimi tamponu ve 0.5 µL restriksiyon enzimi ekleyin.

Restriksiyon enzimi seçerken, enzimin preem amplifikasyon reaksiyonunda kullanılan primer bağlanma bölgesinde veya bu bölgenin aşağısında herhangi bir kesim bölgesine sahip olmadığından emin olun. Enzimlerin ideal sıcaklıkta bir saat boyunca reaksiyona girmesini bekledikten sonra 90 µL su ekleyin. Bir dakika boyunca ayırıcı kullanın ve BDNA komplekslerini 100 µL su içeren bir yıkama çözeltisinde yeniden süspande edin.

Ayırma işlemini tekrarlayın ve ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Boncuklara beş µL su, bir µL 10 x fast link tamponu, bir µL TP, bir µL fast link DNA ligaz ve prosedürün başında hazırlanan linker kasetinden bir µL ekleyin.

Bu reaksiyonun oda sıcaklığında beş dakika boyunca sürmesine izin verin. Reaksiyonu 90 µL su ekleyip boncukları ayırarak sonlandırın, ardından 100 µL su ile yıkama yapın. Sentezlenen DNA'yı denatüre etmek için boncukları tekrar ayırın, boncukları 5 µL 0,1 normal sodyum hidroksit içinde yeniden süspande edin ve karışımın oda sıcaklığında beş dakika boyunca çalkalanmasını sağlayın.

Ardından kompleksleri bir dakika boyunca ayırın ve önceden amplifiye edilmiş vektör genom eklemini içeren SUP natin'i toplayın. Hemen eksponansiyel amplifikasyona geçin veya -20 °C'de saklayın. Kompleksleri bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakarak başlayın.

Ardından, DNA boncuklarını 100 µL su içinde yeniden süspanse edin. Boncukları tekrar ayırın ve süpernatantı uzaklaştırın. Ligasyon reaksiyonu için 6,5 µL su, 1 µL circ Ligaz ve 10x reaksiyon tamponu ekleyin.

Yarım mikrolitre magnezyum klorür, yarım mikrolitre TP, bir mikrolitre SS linker oligoları ve yarım mikrolitre cir ligaz ekleyin. 60 °C'de bir saat bekledikten sonra, boncuk ayırıcıyı kullanarak reaksiyonu 90 mikrolitre su ile sonlandırın. Boncukları başka bir 100 mikrolitre içinde yeniden süspande edin, ayırıcıyı tekrar kullanın ve yıkama komplekslerini 10 mikrolitre su içinde toplayın. Metnin üçüncü tablosunda açıklandığı şekilde bir PCR master mix hazırlayarak başlayın.

200 µL'lik PCR tüplerindeki iki µL kuzu veya NR kuzu ürünlerine 48 µL master mix ekleyin ve PCR'ı metinde açıklandığı şekilde çalıştırın; daha önce olduğu gibi daha fazla streptavidin boncuk hazırlayın ve bunları 6 M lityum klorür içinde yeniden süspande edin. Kuzu için 20 µL veya NR kuzu için 50 µL kullanın. Ardından, boncukları aynı hacimdeki PCR reaksiyon ürünlerine ekleyin ve oda sıcaklığında, bir çalkalayıcıda 300 RPM'de iki saatten gece boyunca dekubasyon yapın; DNA-boncuk kompleksini toplayın ve daha önce gösterildiği gibi 100 µL su ile yıkayın.

Şimdi, kompleksi 0,1 normal sodyum hidroksit içerisinde süspande edin ve boncukları oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından boncukları bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakın ve amplifiye edilmiş DNA'yı içeren süpernatantı yeni bir tüpe toplayın. Amplifiye edilmiş DNA'yı kalıp olarak kullanarak, metnin dördüncü tablosunda açıklandığı şekilde bir PCR yürütmek için bu DNA'dan iki µL kullanın.

Ürünleri saflaştırmak için jel elektroforezi ile görselleştirin. Bunların 40 µL'sini oda sıcaklığındaki 44 µL am pure XP manyetik boncukları ile karıştırın ve beş dakika inkübe edin. Ardından boncukları mıknatıs üzerinde iki dakika boyunca ayırın.

Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, boncukları 200 µL %70 etanol kullanarak iki kez yıkayın ve ardından boncukları 40 ng DNAA füzyon primeri ve 30 µL su ile yeniden süspanse edin. Sekanslamaya özgü adaptörler eklemek için PCR kullanılabilir. Detaylar tablo beşte verilmiştir.

Ürünleri bir jel üzerinde kontrol edin. Lamb PCR sonuçlarının yüksek çözünürlüklü jel elektroforezi ile görüntülenmesi, karşılaştırmalı diagnostik analiz için en iyi seçenektir. %2'lik agarose da işe yaramakla birlikte, aynı performansı vermez.

NR LAMB'nin klonalliği ve PCR ürünleri görsel olarak teşhis edilemez. Ancak, protokolün başarısını belirlemek için %2'lik bir agroz jel tamamen yeterlidir. PCR ürünleri sekanslandıktan sonra, vektörlerin konak genomundaki konumları bulunabilir.

Bu veriler sayesinde, geliştirilmesinin ardından kodlama bölgelerindeki ve transkripsiyon başlangıç bölgelerine yakın olan insersiyon bölgelerinin konumlarını kaydetmek mümkündür. Bu teknik, gen tedavisi alanındaki araştırmacıların, hem preklinik modellerde hem de klinik gen tedavisi denemelerinde gen transfer vektörlerinin biyogüvenliğini incelemelerinin önünü açmıştır.