Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, viral vektörleri genoma entegre etmenin kesin konumlarını belirlemektir. Bu, bir dizi reaksiyonda katı faz üzerindeki genomik DNA'dan vektör genom bağlantı dizilerini zenginleştirmek için biyotinile primerlerle bir ilk doğrusal PCR reaksiyonu ile elde edilir, ürünün her iki ucunda bilinen DNA dizilerine sahip çift sarmallı DNA üretilir, bu da vektör genom bağlantılarının üstel amplifikasyonuna izin verir. Daha sonra, sıralama adaptörleri kuzu PCR ürünlerine dahil edilmiştir.

Bilinmeyen yan DNA'yı derin dizileme ile dizilemek ve karakterize etmek için, bu parçalar vektör entegrasyonlarının kesin konumlarını ortaya çıkarır. Sonuç, jel elektroforezi ile görüldüğü gibi çeşitli güçlendirilmiş bağlantılardır. Bu yöntem, klinik gen tedavisi hastalarında viral vektör entegrasyon bölgesi dağılımı hakkında bilgi sağlar.

Ayrıca insersiyonel, mutajenez, ekranlar, virüs enfeksiyonu, kanser ve kök hücre klonalitesi veya T hücresi çeşitliliği gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Prosedür, laboratuvarımdan bir teknisyen olan ina RA tarafından gösterilecektir Bu prosedür için, önce bağlayıcı kasetleri hazırlayın, iki LCO Lego'nun her birinden 40 mikrolitreyi 110 mikrolitre tris hidroklorür ve 10 mikrolitre magnezyum klorür ile karıştırın, bir mikro santrifüj tüpünde. Ardından, karışımı 95 santigrat derecelik bir ısı bloğunda beş dakika inkübe edecek şekilde ayarlayın ve ardından gece boyunca yavaşça oda sıcaklığına soğutun.

Ertesi gün, hazırlanan çift sarmallı bağlayıcıya, DNA'ya 300 mikrolitre su ekleyin ve bunları bir mikro santrifüj tüpü üzerinde süzün. Ouit'teki konsantre bağlayıcı DNA'yı toplamak için filtreyi aşağı doğru döndürün. Ardından, ouit'i filtreden kurtarın.

Ouit ve pipete 80 mikrolitre su ekleyin. PCR tüplerine 10 mikrolitre alikot. Kuzu eti için 50 mikrolitrelik reaksiyon tüplerinde vektör genom bağlantılarını önceden amplifiye etmek için PCR kullanın.

50 mikrolitre reaksiyon başına bir nanogram ile bir mikrogram arasında numune DNA'sı ekleyin. NR kuzu eti için en az 100 nanogram DNA kullanın. Metindeki ikinci tabloya göre PCR'yi yürütmek için 25 mikrolitreden fazla eklemeyin.

Ve tamamlandığında, her reaksiyona ek 0,5 mikrolitre teknoloji ekleyin ve PCR programını ikinci kez çalıştırın. İlk önce manyetik boncukları hazırlayın. 1,5 mililitrelik bir tüpe 20 mikrolitre strept ENC kaplı manyetik boncuk ekleyin ve bunları oda sıcaklığında bir dakika boyunca manyetik boncuk ayırıcıya koyun.

Ardından süpernatan kabarıklığı atın. Boncukları BSA ile 40 mikrolitre PBS'de askıya alın ve boncukları bir dakika daha ayırıcıya geri koyun. Süpernatanı, 20 mikrolitrelik üç molar lityum klorür çözeltisi ile yıkayın.

Ve yine, boncukları bir dakika boyunca ayırıcıya koyun. Süpernatanı 50 mikrolitre altı molar lityum klorür çözeltisi ile değiştirerek bitirin. Şimdi manyetik boncuk karışımını PCR reaksiyonunun ürününe ekleyin ve bu karışımın hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında iki saat ila gece boyunca inkübe edilmesine izin verin.

Biyotinile DNA ve şerit tava ve kaplanmış boncuklar, dört santigrat derecede dört güne kadar saklanabilen kompleksler oluşturacaktır. Kuzu veya NR kuzu ile devam edin Yüksek hassasiyeti nedeniyle. L-A-M-P-C-R dikkatli bir şekilde yürütülürse kontaminasyona eğilimlidir.

Bu PCR sınıfı bir ortamdır. Ve son derece önemli olan temizliğe özel dikkat. Numuneleri kontamine etmeden bilinmeyen yan DNA'yı başarılı bir şekilde çoğaltmak için, önce kompleksleri bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakın ve DNA boncuklarını 100 mikrolitre suda tekrar askıya alın.

Ardından, kompleksleri bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakın. Ve bu sefer DNA boncuk komplekslerini 8.25 mikrolitre su ile bir karışım halinde yeniden süspanse edin. Bir mikrolitre HEXA nükleotid tamponu, çeyrek mikrolitre D DN NTP ve yarım mikrolitre kano polimeraz.

Bu karışımı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra 90 mikrolitre su ekleyin ve reaksiyonu bir dakika daha ayırıcıya maruz bırakın. Daha sonra DNA boncuk komplekslerini 100 mikrolitrelik bir su yıkamasında yeniden süspanse edin.

Ayırıcıyı bir dakika daha kullanın ve kısıtlama enzimi reaksiyonunu hazırlayın. Süpernatanı çıkardıktan sonra. 8.5 mikrolitre su, bir mikrolitre kısıtlama enzimi tamponu ve yarım mikrolitre kısıtlama enzimi ekleyin.

Restriksiyon enzimini seçerken, preem amplifikasyon reaksiyonunda kullanılan primal bağlanma bölgesinin içinde veya aşağısında hiçbir yeri olmadığından emin olun. Enzimlerin ideal sıcaklıkta bir saat reaksiyona girmesine izin verdikten sonra 90 mikrolitre su ekleyin. Bir dakika boyunca bir ayırıcı kullanın ve BDNA komplekslerini 100 mikrolitre su ile yıkayın

Ayırma işlemini tekrarlayın ve ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Boncuklara beş mikrolitre su, bir mikrolitre 10 x hızlı bağlantı tamponu ekleyin. Bir mikrolitre TP, bir mikrolitre hızlı bağlantı DNA ligaz ve bir mikrolitre bağlayıcı kaset prosedürün başında yapılır.

Bu reaksiyonun oda sıcaklığında beş dakika çalışmasına izin verin. 90 mikrolitre su ekleyerek ve boncukları ayırarak reaksiyonu sonlandırın, ardından 100 mikrolitre suda yıkayın. Daha sonra sentezlenen DNA'yı denatüre etmek için başka bir ayırma, boncukları beş mikrolitre 0.1 normal sodyum hidroksit içinde yeniden süspanse eder ve karışımın oda sıcaklığında beş dakika çalkalanmasına izin verir.

Daha sonra kompleksleri bir dakika ayırın ve preem amplifiye vektör genom bağlantısını içeren SUP natin'i toplayın. Hemen üstel amplifikasyona devam edin veya eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kompleksleri bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakarak başlayın.

Ve DNA boncuklarını 100 mikrolitre suda askıya alan resus. Ve onları tekrar ayırın ve süpernatanı çıkarın. Ligasyon reaksiyonu için 6.5 mikrolitre su, bir mikrolitre circ Ligaz, 10 x reaksiyon tamponu ekleyin.

Yarım mikrolitre magnezyum klorür, yarım mikrolitre TP, bir mikrolitre SS bağlayıcı oligo ve yarım mikrolitre cir ligaz. 60 santigrat derecede bir saat sonra, boncuk ayırıcı Resus'u kullanarak 90 mikrolitre su ile reaksiyonu sonlandırın, boncukları 100 mikrolitrelik başka bir parçada askıya alın, ayırıcıyı tekrar kullanın ve yıkama komplekslerini 10 mikrolitre suda toplayın. Metnin üçüncü tablosunda açıklandığı gibi bir PCR ana karışımı hazırlayarak başlayın.

200 mikrolitrelik PCR tüplerinde iki mikrolitre kuzu veya NR kuzu ürününe 48 mikrolitre ana karışım ekleyin ve PCR'yi daha önce olduğu gibi metinde açıklandığı gibi çalıştırın, boncuklarda daha fazla strept hazırlayın ve bunları altı molar lityum klorür içinde yeniden süspanse edin. Kuzu eti için 20 mikrolitre veya NR kuzu eti için 50 mikrolitre kullanın. Daha sonra aynı hacimde PCR reaksiyon ürünlerine boncuklar ekleyin ve bunları oda sıcaklığında iki saat ila gece boyunca 300 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin, DNA boncuk kompleksini toplayın ve daha önce gösterildiği gibi 100 mikrolitre su ile yıkayın.

Şimdi, kompleksi 0.1 normal sodyum hidroksit içinde askıya alın ve boncukları bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra boncukları bir dakika boyunca ayırıcıya maruz bırakın ve amplifiye edilmiş DNA'yı içeren süpernatanı yeni bir tüpe toplayın. Amplifiye edilmiş DNA'yı bir şablon olarak kullanarak, metnin dördüncü tablosunda açıklandığı gibi bir PCR çalıştırmak için iki mikrolitre kullanın.

Ürünleri saflaştırmak için jel elektroforezi ile ürünleri görselleştirin. Bunların 40 mikrolitresini 44 mikrolitre oda sıcaklığında saf XP manyetik boncuklarla karıştırın ve beş dakika inkübe edin. Daha sonra boncukları mıknatıs üzerinde iki dakika ayırın.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, boncukları 200 mikrolitre% 70 etanol kullanarak iki kez yıkayın ve ardından 40 nanogram DNAA füzyon astarı kullanarak boncukları ve 30 mikrolitre suyu yeniden süspanse edin. PCR, sıralamaya özel adaptörler eklemek için kullanılabilir. Detaylar beşinci tabloda verilmiştir.

Ürünleri bir jel üzerinde kontrol edin. Kuzu PCR sonuçlarını yüksek çözünürlüklü jel elektroforezi ile görüntülemek, karşılaştırmalı olarak en iyi tanısal analiz seçimidir. %2 aros da işe yarasa da, aynı şekilde çalışmıyor.

NR LAMB, PCR ürünlerinin klonalitesi görsel olarak teşhis edilemez. Bununla birlikte, protokolün başarısını belirlemek için %2'lik bir agros jeli mükemmel bir şekilde yeterlidir. PCR ürünlerini diziledikten sonra, vektörlerin yeri konak genomunda bulunabilir.

Bu verilerden, kodlama bölgelerinde yerleştirme sitesi konumlarını günlüğe kaydetmek ve transkripsiyon başlangıç sitelerine yakın bir şekilde geliştirmek mümkündür. Bu teknik, gen terapisi alanındaki araştırmacıların hem klinik öncesi modellerde hem de klinik gen terapisi denemelerinde gen transfer vektörlerinin biyogüvenliğini keşfetmelerinin yolunu açtı.