Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Bu protokol, o hücre veya doku tipine özgü antijenleri bulmak için çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyinde bulunan antijenleri araştırmamıza olanak tanır. Burada sunduğumuz teknik, hücre zarı proteinlerinin bütün bir hücre lizatından zenginleştirilmesine ve sonuçta kütle spektrometresi tabanlı proteomik ile analiz edilmesine izin verir. Bu nedenle, bu protokolün spesifik bir uygulaması, kanser immünoterapileri için yeni hedefler olarak hizmet edebilecek normal hücreleri değil, bu kanser hücrelerinin yüzeyinde bulunan antijenleri aramak için tümör hücrelerine uygulamaktır.

Bu protokolle ilgili dikkat edilmesi gereken bir nokta, ilgilendiğiniz deney için numune girişinizi optimize etmenin önemli olabileceğidir. Bu nedenle, en uygun koşulları bulmak için birkaç yineleme veya titrasyon gerekebilir. Bu nedenle, prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan genç bir uzman olan Akul Naik olacak.

Başlamak için, donmuş biyotin etiketli hücre peletini eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. Peletin içine 500 mikrolitre 2X Lizis Tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve 30 saniye kuvvetlice girdap yapın. Hücre lizatını buz üzerinde sonikasyon yapın ve kalan kalıntıları peletlemek için lizatı 17, 200 G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Lizat santrifüjlenirken, vakum manifolduna bağlı bir filtrasyon kolonuna 100 mikrolitre NeutrAvidin Agarose reçine boncukları ekleyin. Nazik bir vakum uygulayın ve üzerlerine 3 mililitre Yıkama Tamponu 1 akıtarak boncukları yıkayın. Filtrasyon kolonunu vakum manifoldundan çıkarın, altını kapatın ve arıtılmış hücre lizatını boncuklarla birlikte kolona ekleyin.

Kolonun üst kısmını kapatın ve lizatı boncuklarla birlikte uçtan uca bir rotor üzerinde 4 santigrat derecede 120 dakika inkübe edin. Lizat inkübasyonunu tamamladıktan sonra, filtrasyon kolonunu tekrar vakum manifolduna yerleştirin ve hafif bir vakum uygulayın. Boncukları üzerlerine beş mililitre Yıkama Tamponu 1 akıtarak yıkayın.

Yıkama adımını beş mililitre Yıkama Tamponu 2 ve Yıkama Tamponu 3 ile tekrarlayın. Son Yıkama Tamponu tamamen boncuklardan aktıktan sonra, sütunu manifolddan çıkarın. Daha sonra boncuklara 100 mikrolitre liz çözeltisi ekleyin ve bunları bir pipetle 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Boncukları yerleştirmek için tüpü kısaca döndürün ve çözeltinin 50 mikrolitresini çıkarın. Ardından, tüpü 1000 RPM çalkalamada 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede bir ısı bloğu çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 210 mikrolitre yeniden süspansiyon çözeltisi ekleyerek ve tüm kurutulmuş tripsinin yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek digest tüpündeki kurutulmuş tripsini kitten yeniden süspanse edin.

Boncuk inkübasyonunun sonunda, ısı bloğu çalkalayıcıdan çıkarın ve boncuklara 50 mikrolitre yeniden süspanse tripsin çözeltisi ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecede inkübe edin, proteini sindirmek için en az 90 dakika boyunca 500 RPM'de çalkalayın. Sindirim tamamlandıktan sonra, boncukları içeren çözeltiyi bir döndürme kolonuna aktarın ve kolonu, 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Sindirilmiş peptit çözeltisini boncuklardan ayırmak için tüpü döndürün. Daha sonra, sindirim reaksiyonunu durdurmak ve peptit çözeltisini asitleştirmek için 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Bir tüp adaptörü kullanarak, 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne bir tuz giderme sütunu yerleştirin.

Asitleştirilmiş peptit çözeltisinin tamamını kolona ekleyin. Sütunu 3 dakika boyunca 3.800 G'de döndürün, böylece çözelti sütundan akar. Peptitler artık kolona bağlı olduğu için akışı atın.

Kolona 200 mikrolitre Yıkama 1 solüsyonu ekleyin, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.800 G'de döndürün ve ardından akışı atın. Yıkama adımını 200 mikrolitre Wash 2 solüsyonu ile tekrarlayın. Sütunu yeni etiketli 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Kolona 100 mikrolitre elute çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.800 G'de döndürün. Peptitler şimdi kolondan tüpe atılır. Peptit çözeltisini bir vakum santrifüjüne yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin.

Kurumuş peptitleri, kütle spektrometresinde nicelik belirlemeye ve analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi kullanılarak zenginleştirilmiş hücre yüzeyi proteinlerini karakterize etmek için proteom analizi yapıldı. Kolorimetrik peptit miktar tayini testine dayalı olarak mikrolitre başına yaklaşık 630 nanogramlık bir nihai peptit konsantrasyonu elde edildi.

MaxQuant kullanılarak analiz edilen kütle spektrometresi verileri ve ardından hücre yüzey proteinlerinin veri seti analizi, numunede tanımlanan tüm proteinlerin yaklaşık% 27'si olan 601 yüzey proteini verdi. Tanımlanan proteinin Andromeda skorundaki dağılımını temsil eden bir çizim burada gösterilmiştir ve dağılım grafiği, numuneden örneğe korelasyonu göstermektedir. Kutu çizimleri, koşudan koşuya varyasyonu tasvir ediyordu.

Ve örneklem bazında dağılım grafiği, kopyaların veri kalitesini temsil ediyordu. Akılda tutulması gereken en önemli şey, peptitlerin her adımda nerede olduğudur. Başlangıçta çözelti içindedirler, daha sonra sindirime kadar boncuklara bağlanırlar, daha sonra nihayet ayrıştırılana kadar tuzdan arındırma kolonuna bağlanırlar.

Bu prosedürü takiben, hedeflenen akış sitometrisi ve hedeflenen proteomik gibi tanımlanan bir avuç proteini doğrulamanın çeşitli yolları vardır. Bu, numune boyunca bu proteinlerin ekspresyon seviyeleri hakkında daha ayrıntılı bilgi verecektir.