Name: Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için hücre yüzeyi yakalama iş akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Keşfedin, hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için hücre yüzeyi yakalama iş akışını. Bu yöntem, kanser immünoterapisi için yeni antijen hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LC-MS/MS çalışmasının kurulumundaki yardımları için Dr. Kamal Mandal'a (Laboratuvar Tıbbı Bölümü, UCSF), veri analizindeki yardımı için Deeptarup Biswas'a (BSBE, IIT Bombay) ve veri analizi konusundaki yardımı için Dr. Audrey Reeves'e (Laboratuvar Tıbbı Bölümü, UCSF) teşekkür ederiz. A.P.W. laboratuvarındaki ilgili çalışmalar NIH R01 CA226851 ve Chan Zuckerberg Biohub tarafından desteklenmektedir. Şekil 1 ve Şekil 2B, BioRender.com kullanılarak yapılmıştır.

NOT: Bu hücre yüzeyi proteom deneyi için AMO1 plazmasitom hücreleri kullanıldı. Aynı protokol, çok çeşitli süspansiyon ve yapışık hücre hatları dahil olmak üzere diğer hücre türleri için de kullanılabilir9 ve ayrıca çeşitli birincil numune türleri10. Bununla birlikte, hücre sayılarının (deney için başlangıç materyali) tipik olarak eşdeğer proteom kapsamı için optimize edilmesi gerekir. Malzeme ve ekipmanla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tamponlar ve reaktif çözeltileri ve bunların bileşimi ile ilgili ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
1. Biyotin ile hücre yüzeyi etiketleme
<ol>
	<li>Kültürlenmiş hücreleri sayın ve santrifüjleme ile yaklaşık 3,5 × 107 canlı hücreyi pelet haline getirin (500 × g, 24 ° C'de 5 dakika). 
	NOT: AMO1 plazmasitom hücreleri, hasattan önce her 3 günde bir taze besiyeri ile geçirildi.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve 1 mL soğuk (4 °C) Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (D-PBS) (kalsiyum yok, magnezyum yok) ekleyerek ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri tekrar pelet haline getirin (adım 1.1'de olduğu gibi) ve yıkama adımını (adım 1.2) bir kez daha tekrarlayın (toplamda iki yıkama).</li>
	<li>İkinci yıkamadan sonra, hücreleri peletleyin (adım 1.1'de olduğu gibi) ve hafifçe pipetleyerek 990 μL soğuk D-PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Önceden 160 mM sodyum metaperiodat (NaIO4) stok çözeltisi hazırlayın. 50 μL'lik alikotlara bölün ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın. Adım 1.4'te hücre süspansiyonuna 10 μL 160 mM sodyum metaperiodat çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve uçtan uca bir rotorda 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri peletleyin (adım 1.1'de olduğu gibi), süpernatanı boşaltın ve 1 mL soğuk D-PBS'de yeniden süspanse edin. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın (toplamda üç yıkama). Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri 989 μL D-PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Önceden 100 mM biyosit hidrazidden oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. 50 μL'lik alikotlara bölün ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın. Adım 1.6'da hücre süspansiyonuna 1 μL anilin ve 10 μL 100 mM biyositin hidrazid ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 60 dakika boyunca uçtan uca bir rotorda inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri peletleyin (adım 1.1'de olduğu gibi), süpernatanı boşaltın ve 1 mL soğuk D-PBS'de yeniden süspanse edin. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın (toplamda üç yıkama).</li>
	<li>Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı bir pipetle dikkatlice aspire edin ve tüpü sıvı N2 içine yerleştirerek hücre peletini dondurun. Dondurulmuş peleti -80 °C'de, lizis ve aşağı çekme işlemine devam etmeye hazır olana kadar yerleştirin.</li>
</ol>
2. Hücre parçalanması ve biyotin çekme
<ol>
	<li>Donmuş hücre peletini buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Pelete 500 μL 2x lizis tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve 30 s. için girdap
	NOT: Peleti tamamen parçalamak için kuvvetli pipetleme ve girdaplama gerekebilir. Bazı çözünmeyen kalıntılar (yani, DNA), sonraki sonikasyon adımında çıkarıldığı için kabul edilebilir.</li>
	<li>Hücre lizatını buz üzerinde sonikasyon yapın (üç patlama, her biri 20 s,% 60 görev döngüsü).</li>
	<li>Kalan kalıntıları gidermek için lizatı santrifüjleyin (17.200'de 10 dakika × 4 ° C'de g).</li>
	<li>Lizat santrifüjlenirken, bir filtrasyon kolonuna 100 μL nötravidin agaroz reçine boncukları ekleyin. Kolonu bir vakum manifolduna takın, yumuşak bir vakum uygulayın ve üzerlerine 3 mL yıkama tamponu 1 akıtarak boncukları yıkayın.</li>
	<li>Filtrasyon kolonunu vakum manifoldundan çıkarın, altını kapatın ve arıtılmış hücre lizatını boncuklarla birlikte kolona ekleyin. Kolonun üst kısmını kapatın ve lizatı boncuklarla birlikte uçtan uca bir rotorda 120 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 
	NOT: Kolonun üst kısmını kapatırken, alt kapağı sıkıca yerinde tutun, aksi takdirde yerinden çıkabilir ve inkübasyon sırasında hücre lizatı sızabilir.</li>
	<li>1, 2 ve 3 numaralı yıkama tamponlarını hazırlayın (numune başına her yıkama tamponundan yaklaşık 5 mL, Tablo 1'e bakın) ve bunları 42 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin</li>
	<li>Lizat inkübasyonu bittikten sonra, filtrasyon kolonunu tekrar vakum manifolduna yerleştirin, yumuşak bir vakum uygulayın ve üzerlerine 5 mL yıkama tamponu 1 akıtarak boncukları yıkayın. 
	NOT: Yıkama için 5 mL'den fazla yıkama tamponu kullanılabilir; Ekstra yıkama, boncuklar üzerindeki arka planı, spesifik olmayan bağlanmayı azaltabilir.</li>
	<li>Yıkama adımını 5 mL yıkama tamponu 2 ile tekrarlayın.</li>
	<li>Yıkama adımını 5 mL yıkama tamponu 3 ile tekrarlayın.</li>
	<li>Son yıkama tamponu boncuklardan tamamen aktıktan sonra, kolonu manifolddan çıkarın. Boncuklara 100 μL "Lyse" çözeltisi ekleyin ve bunları bir pipet ile 1.7 mL düşük protein bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Boncukları çökeltmek için tüpü kısaca döndürün ve çöken boncukları bozmadan çözeltinin 50 μL'sini çıkarın. 
	NOT: Bu adımdaki ve sonraki tüm adımlardaki reaktifler, piyasada bulunan bir proteomik numune hazırlama kiti kullanır. Kit, optimize edilmiş, basitleştirilmiş bir numune hazırlama iş akışı sağlar. Bununla birlikte, bu adımlar, Verma ve ark.9'da açıklandığı gibi geleneksel bir proteomik iş akışı kullanılarak kitten bağımsız olarak da gerçekleştirilebilir. Boncuklar kolonun yanına veya altına yapışmış kalırsa, tüpe aktarılan boncukların çökmesine izin verin ve kalan boncukları aktarmak için tüpte ekstra "Lyse" çözeltisi kullanın.</li>
	<li>Tüpü 65 °C'de bir ısı bloğu/çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve 1,000 rpm'de 10 dk. çalkalayın
	NOT: Bu adım, sindirimden önce sistein kalıntılarının azaltılması ve alkilasyonu için gereklidir.</li>
</ol>
3. Protein sindirimi
<ol>
	<li>Kurutulmuş tripsini (kitteki "Digest" tüpü, -20 ° C'de saklanır) 210 μL "Yeniden Süspansiyon" çözeltisi ekleyerek yeniden süspanse edin. Tüm kurutulmuş tripsinin yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>İnkübasyon tamamlandıktan sonra, boncuklara 50 μL yeniden süspanse tripsin çözeltisi ekleyin. Tüpü 37 °C'de inkübe edin, proteini sindirmek için en az 90 dakika boyunca 500 rpm'de çalkalayın.</li>
	<li>Sindirim tamamlandıktan sonra, boncukları içeren çözeltiyi bir döndürme kolonuna aktarın ve kolonu, 1.7 mL'lik düşük protein bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Sindirilmiş peptit çözeltisini boncuklardan ayırmak için tüpü (oda sıcaklığında [RT] 5 dakika boyunca 500 × g) döndürün. 
	NOT: Bu aşamada, streptavidin boncuklarından biyotinile peptit parçalarını çıkarmak için peptit çözeltisinden ayrıldıktan sonra boncuklar üzerinde PNGase işlemi gerçekleştirilebilir. Bu peptit numunesi daha sonra iş akışının geri kalanı boyunca, analiz edilebilen ve boncuk üzerindeki tripsinizasyondan elde edilen birincil numune ile karşılaştırılabilen ayrı, ikincil bir peptit numunesi olarak ileriye taşınabilir. MS ile saptanabilir yan zincir modifikasyonu12'ye dayalı olarak yakalanan N-glikosile asparaginler için ek özgüllük göz önüne alındığında, PNGase yaklaşımının boncuk üzerinde tripsinizasyona tamamlayıcı veriler sağlaması muhtemeldir. Bununla birlikte, bu sıralı elüsyon yaklaşımının dezavantajı, numune analizi başına kütle spektrometresi cihaz süresinin iki katı gerekliliğidir.</li>
	<li>Sindirim reaksiyonunu durdurmak ve peptit çözeltisini asitleştirmek için 100 μL "Durdur" çözeltisi ekleyin.</li>
</ol>
4. Peptit tuzdan arındırma
<ol>
	<li>Bir tüp adaptörü kullanarak, 1,7 mL'lik düşük protein bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne bir tuz giderme sütunu yerleştirin. Asitleştirilmiş peptit çözeltisinin tamamını kolona ekleyin. Sütunu (3 dakika boyunca 3.800 × g) döndürün, böylece çözelti sütundan akar. Peptitler şimdi kolona bağlanmıştır; Akışı atın.</li>
	<li>Kolona 200 μL "Yıkama 1" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g, RT). Akışı atın.</li>
	<li>Kolona 200 μL "Wash 2" solüsyonu ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g, RT). Akışı atın.</li>
	<li>Kolonu yeni, etiketli 1.7 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kolona 100 μL "Elute" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g, RT). Kolona 100 μL daha "Elute" çözeltisi ekleyin ve döndürün (3 dakika boyunca 3.800 × g, RT). Peptitler şimdi kolondan tüpe atılır.</li>
	<li>Peptit çözeltisini bir vakum santrifüjüne yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin. Kurumuş peptitleri, nicelik belirlemeye hazır olana kadar -80 °C'ye yerleştirin ve kütle spektrometresinde analiz edin.</li>
</ol>
5. Peptit yeniden süspansiyonu ve miktar tayini
<ol>
	<li>Kurumuş peptitleri 20 μL çözücü A (% 0.1 formik asit,% 2 asetonitril) içinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Çözünmeyen kalıntıları peletlemek için yeniden askıya alınan peptitleri (10 dakika boyunca 17.200 × g) santrifüjleyin.</li>
	<li>Kolorimetrik peptit miktar tayini testi için peptit standartlarını hazırlayın.
	<ol>
		<li>5 μL 1.000 mg / mL peptit stok çözeltisini 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yerleştirin.</li>
		<li>Plakada deiyonize (DI) su ile aşağıdaki gibi, kuyucuk başına her standarttan 5 μL olacak şekilde yedi aşamalı bir seri seyreltme gerçekleştirin: 1.000 mg / mL, 500 mg / mL, 250 mg / mL, 125 mg / mL, 62.5 mg / mL, 31.25 mg / mL ve 15.625 mg / mL. Boşluk için sekizinci bir kuyuya 5 μL DI su yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>96 oyuklu plakanın üç ayrı kuyusuna 4 μL DI su yerleştirin. Toplam hacmi 5 μL. olacak şekilde her oyuğa 1 μL yeniden süspanse peptit çözeltisi ekleyin
	NOT: Peptit çözeltisini miktar tayini için pipetlerken, çökelmiş kalıntıların bozulmasını önlemek için çözeltinin üstünden dikkatlice pipetleyin.</li>
	<li>Ne kadar çalışma reaktifine ihtiyaç duyulduğunu hesaplayın (kuyucuk başına 45 μL gereklidir). Kolorimetrik tahlil çalışma reaktifinin gerekli hacmini hazırlayın; Bileşenlerin uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için çalışma reaktifini girdaplayın.</li>
	<li>Standart ve numune kuyularının her birine 45 μL çalışma reaktifi ekleyin. 
	NOT: Standartları iki kopya haline getirin ve reaktifin kuyucuklara eklendiği zamanlamada minimum bir fark sağlamak için çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
	<li>Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı otomatik bir plaka okuyucuda analiz edin. Doğrusal bir standart eğri oluşturmak için standart numuneler için kaydedilen absorbans değerlerini kullanın. Standart eğrinin veR2 değerinin denklemini belirleyin. R2 değeri makul ise (≥0.95), kolorimetrik tahlil plakasındaki beş kat seyreltmeyi hesaba katan yeniden süspanse peptitlerin konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriyi kullanın.</li>
</ol>
6. Sindirilen peptitlerin sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizi
<ol>
	<li>Çözücü A ekleyerek peptit örneklerinin konsantrasyonunu 0.2 μg / μL'ye ayarlayın ve 10 μL'yi 0.6 mL düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüpü LC otomatik numune alma cihazına yerleştirin.</li>
	<li>LC ve MS/MS parametrelerini Şekil 2 ve Şekil 3'e göre ayarlayın.</li>
	<li>5 μL (1 μg) peptit örneğini analiz için LC-MS/MS kurulumuna enjekte edin. 
	NOT: Burada gösterilen LC-MS/MS ayarları yalnızca çizimleri temsil etmektedir. LC ve MS cihazının kullanılabilirliğine bağlı olarak, kullanıcılar derin proteom kapsamı elde etmek için LC gradyanı ve MS/MS parametrelerinin ayarlarını değiştirebilir. Bu çalışmada MS veri analizi MaxQuant https://www.maxquant.org/ kullanılarak, ikincil veri analizi Perseus https://maxquant.net/perseus/ kullanılarak ve yol analizi https://reactome.org/ kullanılarak gerçekleştirilmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+silico+human+surfaceome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The in silico human surfaceome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 10988-10997 (2018).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advance+in+tumor+specific+antigens%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22AME+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research advance in tumor specific antigens: A narrative review.</a> AME Medical Journal. 6, 35(2021).</li>
<li>Li, Y., Qin, H., Ye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+enrichment+methods+for+cell+surface+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling.</a> Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Chandler, K. B., Costello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics+and+glycoproteomics+of+membrane+proteins+and+cell-surface+receptors%3A+present+trends+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities.</a> Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).</li>
<li>Ferguson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfaceome+of+multiple+myeloma+cells+suggests+potential+immunotherapeutic+strategies+and+protein+markers+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance.</a> Nature Communications. 13 (1), 4121(2022).</li>
<li>Karcini, A., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SKBR3+cell-membrane+proteome+reveals+telltales+of+aberrant+cancer+cell+proliferation+and+targets+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10847(2022).</li>
<li>Köhnke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiomic+approach+for+identification+of+novel+immunotherapeutic+targets+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML.</a> Biomarker Research. 10 (1), 43(2022).</li>
<li>Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+workflow+of+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics+of+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e61786(2021).</li>
<li>Leung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+and+thematic+remodeling+of+the+surfaceome+and+glycoproteome+on+isogenic+cells+transformed+with+driving+proliferative+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).</li>
<li>Nix, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+proteomics+reveals+CD72+as+a+target+for+in+vitro-evolved+nanobody-based+CAR-T+cells+in+KMT2A%2FMLL1-rearranged+B-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL.</a> Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+from+T+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Hosen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activated+conformation+of+integrin+%CE%B27+is+a+novel+multiple+myeloma-specific+target+for+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).</li>
<li>Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glycosylation%3A+A+new+road+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery.</a> Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).</li>
<li>Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+proteomics+in+the+discovery+of+cell-surface+markers+on+stem+cells%3A+Scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface.</a> Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).</li>
<li>Itzhak, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+approach+for+mapping+protein+subcellular+localization+reveals+the+spatial+proteome+of+mouse+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons.</a> Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).</li>
<li>Kirkemo, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+tethered+promiscuous+biotinylators+enable+comparative+small-scale+surface+proteomic+analysis+of+human+extracellular+vesicles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells.</a> eLife. 11, 73982(2022).</li>
<li>Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+bottom-up+proteomics+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows.</a> Current Protocols. 1 (3), 85(2021).</li>
<li>Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+popular+proteomics+software+workflows+for+label-free+proteome+quantification+and+imputation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PLoS One. 10 (3), 0121314(2015).</li>
<li>Griss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReactomeGSA-efficient+multi-omics+comparative+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).</li>
<li>Waas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SurfaceGenie%3A+a+web-based+application+for+prioritizing+cell-type-specific+marker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates.</a> Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>van Oostrum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mouse+B+cell+types+using+surfaceome+proteotype+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps.</a> Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).</li>
<li>Berg Luecke, L., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+streptavidin+bead+binding+capacity+to+improve+quality+of+streptavidin-based+enrichment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies.</a> Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Kütle spektrometrisi tabanlı proteomik, binlerce bilinmeyen proteinin daha önce imkansız bir ölçekte tarafsız karakterizasyonunu sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yaklaşım, belirli bir numunede bulunan protein çeşitliliğini karakterize ederek, proteinleri tanımlamamıza ve ölçmemize ve ayrıca hücrelerin ve dokuların yapısal ve sinyal kapasiteleri için bir dizi içgörü toplamamıza olanak tanır. Bir numunedeki küresel protein profilinin ötesine geçen kütle spektrometrisi, bu proteinler üzerindeki çeşitli translasyon sonrası mod...

Proteinler, hücresel işlevlerin çoğunun gerçekleştirildiği temel birimler olarak hizmet eder. İlgili proteinlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek, biyolojik süreçleri anlamak için önemli bir adımdır. Son on yılda, kütle spektrometresi teknolojisi, analiz yazılımı ve veri tabanlarındaki ilerlemeler, proteinlerin proteom çapında bir ölçekte doğru bir şekilde tespit edilmesini ve ölçülmesini sağlamıştır1. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik, biyokimyasal yolların temel bilim analizinden, translasyonel bir ortamda yeni ilaç hedeflerinin tanımlanmasına, clinic2'de hastalıkların teşhisi ve izlenmesine kadar çok çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Yeni ilaç hedefleri taranırken, hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu özellikle önemlidir ve şu anda onaylanmış insan ilaçlarının %65'inden fazlası hücre yüzeyi proteinlerini hedef alır3. Kanser immünoterapisi alanı ayrıca tümör hücrelerini hedeflemek ve spesifik olarak ortadan kaldırmak için tamamen kansere özgü hücre yüzey antijenlerine dayanır4. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik, bu nedenle, terapötik müdahalelere yönelik yeni hücre yüzeyi proteinlerini tanımlamak için umut verici bir araç olarak hizmet edebilir.
Bununla birlikte, yeni hücre yüzeyi protein hedefleri için tümör hücrelerini araştırmak için geleneksel proteomik yöntemleri kullanırken çeşitli sınırlamalar vardır. Birincil endişe, yüzey proteinlerinin bir hücredeki toplam protein moleküllerinin çok küçük bir kısmını oluşturmasıdır. Bu nedenle, bu proteinlerin fragmanları, tüm hücre lizatının kütle spektrometresi analizi yapılırken hücre içi proteinlerin yüksek bolluğu ile maskelenir 5. Bu sınırlama, hücre yüzeyi proteomunu geleneksel bir proteomik iş akışıyla doğru bir şekilde karakterize etmeyi zorlaştırır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, kütle spektrometresi üzerinde analiz edilmeden önce, hücre yüzey proteinlerini tüm hücre lizatından zenginleştirmenin yollarını geliştirmek gerekir. Böyle bir yöntem, bozulmamış hücrelerde glikosile hücre yüzey proteinlerinin oksidasyonunu ve biyotin etiketlemesini ve daha sonra bu biyotinile proteinlerin lizattan bir nötravidin çekmesi ile zenginleştirilmesini içerir, bu işlem "hücre yüzeyi yakalama"6 olarak adlandırılır. Memeli hücre yüzeyi proteinlerinin ~%85'inin glikosile edilmiş7 olduğu düşünüldüğünden, bu, hücre yüzeyi proteomunu tüm hücre lizatından zenginleştirmek için etkili bir yöntem olarak hizmet eder. Bu makale, kültürlenmiş hücrelerden başlayarak, hücre yüzeyi biyotin etiketlemesi ve ardından kütle spektrometresi analizi için numune hazırlama (Şekil 1) ile başlayan eksiksiz bir iş akışını açıklamaktadır. Birkaç kopya üzerinde, bu yöntem, belirli bir numunenin hücre yüzeyi proteomunun sağlam bir şekilde kapsanmasını sağlar. Hem tümör hem de sağlıklı hücrelerin hücre yüzeyi proteomunu karakterize etmek için bu yöntemin kullanılması, potansiyel immünoterapötik hedefleri tanımlamak için yeni hücre yüzeyi antijenlerinin keşfini kolaylaştırabilir8.

<table><tbody><tr><td>Kitler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X iST Numune Hazırlama Kiti</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>Proteomics numune hazırlama kiti. İndirgeme, alkilasyon ve sindirim için reaktifler içerir. Ayrıca tuzdan arındırma kolonlarını ve reaktifleri de içerir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit Testi</td><td>Termo</td><td>23275</td><td>Peptit miktar tayin kiti. Peptit standartlarını ve çalışma reaktiflerinin bileşenlerini içerir.</td></tr><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Biyosit hidrazid</td><td>Biotium</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Kalsiyum ve Magnezyum Tuzları olmadan)</td> <td>UCSF Hücre Kültürü Tesisi</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Tek Kullanımlık Kokteyl</td><td>Thermo</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli Nötravidin Agaroz Reçine</td><td>Thermo</td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>UCSF Hücre Kültürü Tesisi</td><td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lizis Tamponu, 10x</td><td>Milipor Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum metaperiodat</td><td>Alfa Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (% 0.4)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Üre (Proteomik Sınıfı)</td> <td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr> <<tr><td>güçlü > Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR Mikrosantrifüj</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>VWR</td><td>Branson Sonifier 240</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Manifoldu</td><td>Promega</td><td>Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>Titreyen Isı Bloğu</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Termomikser C</td><td></td></tr><tr><td>Uçtan Uca Döndürücü</td><td>Labnet</td><td>Tabanca Ayarlanabilir Döndürücü</td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC ve UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hibrit Quadrapole Orbitrap Kütle Spektrometresi</td><td>Termo</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Biotek Biotek</td><td>Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Konsantratörü</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Mikrosantrifüj Tüpleri Filtrasyon Sütunları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>Spin Sütunları</td><td>Termo</td><td>69725</td><td></td></tr></tbody></table> sayılı Kanun Hükmünde Kararname

hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Son on yılda, kütle spektrometresi tabanlı proteomik, geniş bir uygulama yelpazesinde biyolojik sistemlerin derinlemesine karakterizasyonunu mümkün kılmıştır. Plazma zarı proteinleri, klinik olarak onaylanmış terapötiklerin çoğunun birincil hedefi olmasının yanı sıra, hastalıklı hücreleri sağlıklı dokulardan tanısal olarak ayırt etmek için anahtar bir özellik olduğundan, insan hastalığında hücre yüzeyi proteomu ("surfaceome") önemli bir ilgi alanıdır. Bununla birlikte, hücrenin zar ve yüzey proteinlerinin odaklanmış karakterizasyonu, esas olarak diğer yüksek bolluktaki proteinler tarafından ilgilenilen proteinleri maskeleyen hücresel lizatların karmaşıklığı nedeniyle zor kalmıştır. Bu teknik engelin üstesinden gelmek ve kütle spektrometresi proteomiği kullanarak çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunu doğru bir şekilde tanımlamak için, kütle spektrometresinde analizden önce hücre yüzey proteinleri için hücre lizatını zenginleştirmek gerekir. Bu makale, kanser hücrelerinden hücre yüzey proteinlerini etiketlemek, bu proteinleri hücre lizatından zenginleştirmek ve ardından kütle spektrometresi analizi için numune hazırlamak için ayrıntılı bir iş akışı sunmaktadır.

Bu deneyde, sağlam hücrelerin N-glikozillenmiş membran proteinlerini biotin ile işaretleyip, bu işaretli proteinleri tüm hücre lizatından bir neutravidin pulldown işlemi ile zenginleştirerek bir tümör hücre hattının hücre yüzeyi proteomunu karakterize ettik (Şekil 1). Ayrıca, zenginleştirilmiş hücre yüzeyi proteinlerini karakterize etmek için LC-MS/MS kullanarak proteom analizi gerçekleştirdik. Tüm hücre proteom analizinin aksine, buradaki amaç yalnızca hücre yüzeyi proteinlerini ka...

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Bu protokol, o hücre veya doku tipine özgü antijenleri bulmak için çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyinde bulunan antijenleri araştırmamıza olanak tanır. Burada sunduğumuz teknik, hücre zarı proteinlerinin bütün bir hücre lizatından zenginleştirilmesine ve sonuçta kütle spektrometresi tabanlı proteomik ile analiz edilmesine izin verir. Bu nedenle, bu protokolün spesifik bir uygulaması, kanser immünoterapileri için yeni hedefler olarak hizmet edebilecek normal hücreleri değil, bu kanser hücrelerinin yüzeyinde bulunan antijenleri aramak için tümör hücrelerine uygulamaktır.Bu protokolle ilgili dikkat edilmesi gereken bir nokta, ilgilendiğiniz deney için numune girişinizi optimize etmenin önemli olabileceğidir. Bu nedenle, en uygun koşulları bulmak için birkaç yineleme veya titrasyon gerekebilir. Bu nedenle, prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan genç bir uzman olan Akul Naik olacak.Başlamak için, donmuş biyotin etiketli hücre peletini eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. Peletin içine 500 mikrolitre 2X Lizis Tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve 30 saniye kuvvetlice girdap yapın. Hücre lizatını buz üzerinde sonikasyon yapın ve kalan kalıntıları peletlemek için lizatı 17, 200 G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Lizat santrifüjlenirken, vakum manifolduna bağlı bir filtrasyon kolonuna 100 mikrolitre NeutrAvidin Agarose reçine boncukları ekleyin. Nazik bir vakum uygulayın ve üzerlerine 3 mililitre Yıkama Tamponu 1 akıtarak boncukları yıkayın. Filtrasyon kolonunu vakum manifoldundan çıkarın, altını kapatın ve arıtılmış hücre lizatını boncuklarla birlikte kolona ekleyin.Kolonun üst kısmını kapatın ve lizatı boncuklarla birlikte uçtan uca bir rotor üzerinde 4 santigrat derecede 120 dakika inkübe edin. Lizat inkübasyonunu tamamladıktan sonra, filtrasyon kolonunu tekrar vakum manifolduna yerleştirin ve hafif bir vakum uygulayın. Boncukları üzerlerine beş mililitre Yıkama Tamponu 1 akıtarak yıkayın.Yıkama adımını beş mililitre Yıkama Tamponu 2 ve Yıkama Tamponu 3 ile tekrarlayın. Son Yıkama Tamponu tamamen boncuklardan aktıktan sonra, sütunu manifolddan çıkarın. Daha sonra boncuklara 100 mikrolitre liz çözeltisi ekleyin ve bunları bir pipetle 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Boncukları yerleştirmek için tüpü kısaca döndürün ve çözeltinin 50 mikrolitresini çıkarın. Ardından, tüpü 1000 RPM çalkalamada 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede bir ısı bloğu çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 210 mikrolitre yeniden süspansiyon çözeltisi ekleyerek ve tüm kurutulmuş tripsinin yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek digest tüpündeki kurutulmuş tripsini kitten yeniden süspanse edin.Boncuk inkübasyonunun sonunda, ısı bloğu çalkalayıcıdan çıkarın ve boncuklara 50 mikrolitre yeniden süspanse tripsin çözeltisi ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecede inkübe edin, proteini sindirmek için en az 90 dakika boyunca 500 RPM'de çalkalayın. Sindirim tamamlandıktan sonra, boncukları içeren çözeltiyi bir döndürme kolonuna aktarın ve kolonu, 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.Sindirilmiş peptit çözeltisini boncuklardan ayırmak için tüpü döndürün. Daha sonra, sindirim reaksiyonunu durdurmak ve peptit çözeltisini asitleştirmek için 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Bir tüp adaptörü kullanarak, 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne bir tuz giderme sütunu yerleştirin.Asitleştirilmiş peptit çözeltisinin tamamını kolona ekleyin. Sütunu 3 dakika boyunca 3.800 G'de döndürün, böylece çözelti sütundan akar. Peptitler artık kolona bağlı olduğu için akışı atın.Kolona 200 mikrolitre Yıkama 1 solüsyonu ekleyin, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.800 G'de döndürün ve ardından akışı atın. Yıkama adımını 200 mikrolitre Wash 2 solüsyonu ile tekrarlayın. Sütunu yeni etiketli 1.7 mililitrelik düşük protein bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne aktarın.Kolona 100 mikrolitre elute çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.800 G'de döndürün. Peptitler şimdi kolondan tüpe atılır. Peptit çözeltisini bir vakum santrifüjüne yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin.Kurumuş peptitleri, kütle spektrometresinde nicelik belirlemeye ve analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi kullanılarak zenginleştirilmiş hücre yüzeyi proteinlerini karakterize etmek için proteom analizi yapıldı. Kolorimetrik peptit miktar tayini testine dayalı olarak mikrolitre başına yaklaşık 630 nanogramlık bir nihai peptit konsantrasyonu elde edildi.MaxQuant kullanılarak analiz edilen kütle spektrometresi verileri ve ardından hücre yüzey proteinlerinin veri seti analizi, numunede tanımlanan tüm proteinlerin yaklaşık% 27'si olan 601 yüzey proteini verdi. Tanımlanan proteinin Andromeda skorundaki dağılımını temsil eden bir çizim burada gösterilmiştir ve dağılım grafiği, numuneden örneğe korelasyonu göstermektedir. Kutu çizimleri, koşudan koşuya varyasyonu tasvir ediyordu.Ve örneklem bazında dağılım grafiği, kopyaların veri kalitesini temsil ediyordu. Akılda tutulması gereken en önemli şey, peptitlerin her adımda nerede olduğudur. Başlangıçta çözelti içindedirler, daha sonra sindirime kadar boncuklara bağlanırlar, daha sonra nihayet ayrıştırılana kadar tuzdan arındırma kolonuna bağlanırlar.Bu prosedürü takiben, hedeflenen akış sitometrisi ve hedeflenen proteomik gibi tanımlanan bir avuç proteini doğrulamanın çeşitli yolları vardır. Bu, numune boyunca bu proteinlerin ekspresyon seviyeleri hakkında daha ayrıntılı bilgi verecektir.

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca...

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Keşfedin, hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için hücre yüzeyi yakalama iş akışını. Bu yöntem, kanser immünoterapisi için yeni antijen hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olur.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Daha fazla video keşfet