tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi Coxiella burnetii
18 Nisan 2016
Burada, hasta örneklerinde C. burnetii'nin tespiti için liyofilize reaktifler kullanan basit bir döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemini tanımladık.
Bu deneyin genel amacı, hasta örneklerinde C. burnetii'nin tespiti için liyofilize reaktifler kullanan basit bir LAMP yöntemi geliştirmektir. Bu protokolün ana avantajı, reaktiflerin saklanması için herhangi bir koçluğa gerek olmamasıdır. Bu yöntem, Q ateşinin endemik olduğu kaynak sınırlı ortamlarda kullanım için idealdir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Tatiana olacaktır. C.burnetii RSA493'ten hedef gen IS1111a için DNA ile başlayarak, plazmit konsantrasyonunu 260 nanometrede bir spektrofotometre ile belirleyin. Plazmit DNA konsantrasyonunu, 6330'un plazmidin uzunluğuna ve baz çiftlerine eşit olduğu ve mikrolitre başına 34.2 nanogramın, spektrofotometre kullanılarak yeni belirlendiği gibi plazmitin konsantrasyonu olduğu aşağıdaki hesaplamaları kullanarak kopya numarasına dönüştürün.
Daha sonra, mikrolitre başına aşağıdaki kopya sayısına ulaşmak için plazmitin 8 ila 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. DNA şablonunu LAMP reaksiyonu için hazırlamak için 200 mikrolitre insan plazma örneği ile başlayın ve DNA miniprep kiti ile DNA'yı üreticinin protokolüne göre çıkarın. Son numuneyi 20 mikrolitrelik bir hacme seyreltin.
Aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre 2x LAMP reaksiyon tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Standart LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünde 12.5 mikrolitre 2x LAMP tamponu, 1.2 mikrolitre primer karışımı, 1 mikrolitre Bst DNA polimeraz ve 5.3 mikrolitre su karıştırın.
Daha sonra, 20 mikrolitrelik reaksiyona 5 mikrolitre DNA ekleyin ve iyice karıştırın, ardından 60 santigrat derecede bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpe 5 mikrolitre 10x jel yükleme tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Daha sonra 5 mikrolitre reaksiyon ürününü, enterkalasyon yapan nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.
Jeli 35 dakika boyunca 100 voltta 1x TBE'de çalıştırın, ardından sonuçları görselleştirmek için UV ışığı kullanın. Sulandırılmış reaktiflerle LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre sulandırma tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın.
Ardından, liyofilize reaktifleri içeren tüpleri sızdırmaz alüminyum folyo torbadan çıkarın. Adım 4.2 için, alüminyum folyo torbayı açmadan önce düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak çok önemlidir. Alüminyum torba sızdırmaz değilse veya hasar görmüşse tüpleri kullanmayın.
Her bir reaktif tüpüne 20 mikrolitre sulandırma tamponu ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Liyofilize reaktiflerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Ardından, sulandırılmış reaktiflere 5 mikrolitre DNA şablonu ekleyin ve iyice karıştırın.
60 santigrat derecede bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra reaksiyonu sonlandırmak için, 5 mikrolitre 10x jel yükleme tamponu ekleyin, ardından 5 mikrolitre reaksiyon ürününü, enterkalasyon nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik bir agaroz jel üzerine ekleyin. Jeli 35 dakika boyunca 100 voltta 1x TBE tamponunda çalıştırın, ardından sonuçları UV ışığı ile görselleştirin.
Hidroksinaftol mavisi veya HNB veya interkalasyon boyası ile LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, HNB veya bir floresan interkalasyon boyası içeren aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre sulandırma tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. LAMP reaksiyonunu az önce açıklandığı gibi gerçekleştirin ve sonuçları görselleştirmek için UV ışığı veya çıplak göz kullanın.
LAMP reaksiyonunu bir tüp tarayıcı ile gerçekleştirmek için, floresan interkalasyon boyasını içeren sulandırılmış reaktiflere 5 mikrolitre DNA ekleyin, ardından kapalı tüpü tüp tarayıcıya yerleştirin. Kuluçka sıcaklığını 60 santigrat dereceye ayarlayın ve floresansı 60 dakika boyunca 520 nanometrede ölçün. Bu şekil, taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktifler ile agaroz jeller üzerindeki LAMP reaksiyon sonuçlarını göstermektedir.
Liyofilize reaktifin aktivitesini koruduğunu gözlemleyin. Her iki reaktif tarafından hazırlanan LAMP reaksiyonları, 25 kopya DNA şablonu tespit etti. Bu şekilde, reaksiyondaki HNB veya floresan interkalasyon boyası ile reaksiyon ürünlerinin tespiti gösterilmiştir.
Reaksiyona HNB'nin eklenmesi, reaksiyonlarda 25, 50 ve 100 kopya DNA şablonu ile mordan maviye görsel bir renk değişikliği üretir. Ek olarak, floresan interkalasyon boyasının reaksiyona dahil edilmesi, benzer DNA kopya sayıları mevcut olduğunda UV ışığı ile güçlü bir floresan sinyali gösterir. Burada, floresan interkalasyon boyası ile floresan sinyallerini gerçek zamanlı olarak izlemek için tüp tarayıcının kullanılmasından elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.
Floresan sinyaller, reaksiyonlarda 10^6, 10^4, 10^3 ve 100 DNA şablonu kopyası ile 14, 18, 21 ve 23 dakika sonra taban çizgisinin üzerindedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür 90 dakika içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu test, kaynakların sınırlı olduğu alanlarda Coxiella burnetii enfeksiyonunun hızlı teşhisinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, liyofilize LAMP reaktiflerinin nasıl yeniden oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Hasta örneklerinin bulaşıcı olabileceğini ve bu işlem yapılırken her zaman güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hasta örneklerinde C. burnetii'nin tespiti için liofilize reaktiflerin kullanıldığı basit bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemi sunmaktadır. Yöntem, Q ateşinin yaygın olduğu kaynak kısıtlı ortamlar için özellikle avantajlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Tanı Yöntemleri
- Bulaşıcı Hastalıklar
Arka Plan
- C. burnetii, Q ateşinin nedensel ajanıdır.
- Geleneksel tespit yöntemleri karmaşık depolama koşulları gerektirebilir.
- Liyoflilize reaktiflerin işlemi basitleştirdiğini.
- Bu yöntem endemik bölgelerde kullanım için uygundur.
Çalışmanın Amacı
- C. burnetii'yi tespit etmek için bir LAMP yöntemi geliştirmek.
- Kaynak kısıtlı ortamlarda tanı yöntemlerine erişimi artırmak.
- Liyoflilize reaktiflerin etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- LAMP için liofilize reaktiflerin hazırlanması.
- Plasmid konsantrasyonunu belirlemek için spektrofotometri kullanımı.
- Plasmid DNA kopya sayısının hesaplanması.
- İşlemin bir laboratuvar teknisyeni tarafından gösterimi.
Ana Sonuçlar
- LAMP yöntemi C. burnetii'yi başarıyla tespit eder.
- Liyoflilize reaktiflerin özel depolama gerektirmeden stabil kaldığını.
- Yöntemin kaynak kısıtlı ortamlarda etkili olduğunu.
- Gösterimin protokolün kullanılabilirliğini doğrulamış olduğunu.
Sonuçlar
- LAMP yöntemi, C. burnetii tespiti için uygun bir alternatiftir.
- Liyoflilize reaktiflerin tanı sürecini basitleştirdiğini.
- Bu yaklaşımın endemik bölgelerde hastalık yönetimini iyileştirebileceğini.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Lyophilized LAMP reagents for Coxiella burnetii detection address the need for robust, field-deployable molecular diagnostics in infectious disease surveillance and outbreak response. This approach enables sensitive nucleic acid detection without cold chain requirements, supporting rapid decision-making in resource-limited and decentralized settings. The method enhances portfolio flexibility for biopharma teams developing diagnostic platforms targeting emerging and neglected pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in clinical and environmental samples.
- Supports functional validation of nucleic acid targets through direct amplification and detection.
- Facilitates biological de-risking by confirming assay sensitivity and specificity at low copy numbers.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, lyophilized reagent format for reproducible assay setup across sites.
- Delivers quantitative outputs via fluorescence or colorimetric readouts for reliable sample comparison.
- Enables scalable screening workflows by simplifying reagent handling and storage logistics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by supporting detection of pathogen DNA in patient-derived matrices.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through robust, field-ready assay formats.
- Reduces operational risk in deploying diagnostics for emerging infectious threats.
Pipeline & Workflow Integration
This lyophilized LAMP platform integrates from early discovery through translational research, supporting rapid pathogen detection and assay deployment in diverse settings.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and target confirmation for infectious agents.
- Screening: Standardizes assay conditions and enables reproducible, quantitative detection across sample types.
- Analytics: Provides clear visual or fluorescent outputs for comparative analysis of sample positivity and assay sensitivity.
- Translational Research: Bridges laboratory and field diagnostics, supporting biomarker-driven surveillance and intervention studies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, lyophilized reagent system adaptable to other pathogen targets and diagnostic platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathogen detection and reduces ambiguity in diagnostic workflows.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and logistical simplicity for global deployment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for diagnostic development and supports rapid response to infectious disease outbreaks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for emerging and endemic pathogens.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise for assay setup and interpretation.
- Needs basic laboratory instrumentation such as heating blocks, pipettes, and fluorescence or colorimetric readers.
- Demands cross-team standardization of reagent handling and result interpretation protocols.
- Adaptable to various sample matrices with appropriate DNA extraction methods.
- Stability and performance validated for at least one month at room temperature as supported by source data.
