tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi

Bu deneyin genel amacı, hasta örneklerinde C.burnetii tespit etmek için liyofilize reaktifler kullanan basit bir LAMP yöntemi geliştirmektir. Bu protokolün temel avantajı, reaktiflerin saklanması için soğuk zincir gereksiniminin olmamasıdır. Bu yöntem, Q ateşinin endemik olduğu, kaynakların sınırlı olduğu ortamlar için idealdir.

Prosedürü laboratuvarımızdan teknisyen Tatiana uygulamalı olarak gösterecektir. C.burnetii RSA493'ten hedef gen IS11111a için DNA ile başlayarak, plazmit konsantrasyonunu 260 nanometrede bir spektrofotometre ile belirleyin. Plazmit DNA konsantrasyonunu, 6330'ın plazmitin uzunluğu ve baz çiftlerini, 34,2 nanogram/µL'nin ise spektrofotometre ile az önce belirlenen plazmit konsantrasyonunu temsil ettiği aşağıdaki hesaplamaları kullanarak kopya sayısına dönüştürün.

Ardından, mikrolitre başına aşağıdaki kopya sayılarına ulaşmak için plazmidden 8 ila 10 katlık seri dilüsyonlar hazırlayın. LAMP reaksiyonu için DNA kalıbını hazırlamak üzere, 200 mikrolitre insan plazma örnekleriyle başlayın ve DNA miniprep kiti ile üretici protokolüne uygun olarak DNA'yı ekstrakte edin. Nihai örneği 20 mikrolitrelik bir hacme dilüe edin.

Aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre 2x LAMP reaksiyon tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca pulse-vortex uygulayarak karıştırın. Standart LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 0,2 mililitrelik bir PCR tüpünde 12,5 mikrolitre 2x LAMP tamponu, 1,2 mikrolitre primer karışımı, 1 mikrolitre Bst DNA polimeraz ve 5,3 mikrolitre su karıştırın.

Ardından, 20 µL'lik reaksiyona 5 µL DNA ekleyip iyice karıştırın, ardından bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüpe 5 µL 10x jel yükleme tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Daha sonra, reaksiyon ürünlerinden 5 µL'yi, interkalasyon yapan nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik agaroz jele yükleyin.

Jeli 1x TBE içerisinde 100 volt ile 35 dakika boyunca çalıştırın, ardından sonuçları görüntülemek için UV ışığı kullanın. Yeniden konstitüe edilmiş reaktiflerle LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre reconstitution buffer hazırlayın. 10 saniye boyunca puls-vorteksleyerek karıştırın.

Ardından, liyofilize reaktifleri içeren tüpleri kapalı alüminyum folyo torbadan çıkarın. Adım 4.2 için, alüminyum folyo torbayı açmadan önce düzgün şekilde mühürlendiğinden emin olmak çok önemlidir. Alüminyum torba mühürlü değilse veya hasarlıysa tüpleri kullanmayın.

Her bir reaktif tüpüne 20 microliters rekonstitüsyon tamponu ekleyin ve pipetle beş kez aşağı yukarı çekerek karıştırın. Liyofilize reaktiflerin tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun. Ardından, rekonstitüe edilmiş reaktiflere 5 microliters DNA kalıbı ekleyin ve iyice karıştırın.

60 °C'de bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası reaksiyonu sonlandırmak için 5 µL 10x jel yükleme tamponu ekleyin, ardından reaksiyon ürünlerinden 5 µL'yi interkalasyon yapan nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik agaroz jele yükleyin. Jeli 1x TBE tamponunda 100 voltda 35 dakika boyunca çalıştırın, ardından sonuçları UV ışığı altında görselleştirin.

Hidroksinaphtol mavi (HNB) veya interkale eden boya ile LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, HNB veya floresan interkale eden boya içeren aşağıdaki re ajanları birleştirerek 1 mililitre rekonstitüsyon tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca pulse-vortex yaparak karıştırın. LAMP reaksiyonunu az önce açıklanan şekilde gerçekleştirin ve sonuçları görselleştirmek için UV ışığı veya çıplak göz kullanın.

LAMP reaksiyonunu bir tüp tarayıcı ile gerçekleştirmek için, floresan interkale boya içeren yeniden konfigüre edilmiş reaktiflere 5 µL DNA ekleyin ve ardından kapalı tüpü tüp tarayıcıya yerleştirin. İnkübasyon sıcaklığını 60 °C olarak ayarlayın ve 60 dakika boyunca 520 nm'de floresansı ölçün. Bu şekil, taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktifler ile agaroz jeller üzerindeki LAMP reaksiyon sonuçlarını göstermektedir.

Liyofilize reaktifin aktivitesini koruduğu gözlemlenmiştir. Her iki reaktif ile hazırlanan LAMP reaksiyonları, 25 kopya DNA şablonunu tespit etmiştir. Bu şekilde, reaksiyon ürünlerinin HNB veya floresan interkale boya ile tespit edilmesi gösterilmektedir.

Reaksiyonlara HNB eklenmesi; reaksiyonlarda 25, 50 ve 100 kopya DNA şablonu mevcutken, mor renkten maviye görsel bir renk değişimi meydana getirir. Ek olarak, reaksiyona floresan interkale edici boyanın dahil edilmesi, benzer DNA kopya sayıları mevcut olduğunda UV ışığı altında güçlü bir floresan sinyali verir. Burada, floresan interkale edici boya ile floresan sinyallerini gerçek zamanlı olarak izlemek için tüp tarayıcı kullanımından elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.

Reaksiyonlarda sırasıyla 10^6, 10^4, 10^3 ve 100 kopya DNA kalıbı varken, floresan sinyalleri 14, 18, 21 ve 23. dakikalardan sonra baz çizgisine yükselmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür 90 dakika içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu analiz, kaynakların sınırlı olduğu bölgelerde Coxiella burnetii enfeksiyonunun hızlı teşhisi için yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, liyofilize LAMP reaktiflerinin nasıl yeniden çözüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Hasta örneklerinin enfeksiyöz olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.