Name: tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi Coxiella burnetii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Keşfedin, liyofilize reaktiflerle LAMP yöntemi kullanarak Coxiella burnetii tespiti için hızlı ve basit bir tanı protokolü. Bu yöntem, kaynak kısıtlı ortamlarda Q ateşi teşhisini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Deniz Araştırma Merkezi, araştırma iş birimi 6000.RAD1.J.A0310 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazarlara aittir ve ille de Deniz Kuvvetleri, Savunma Bakanlığı, ya da ABD Hükümeti Bölümü resmi politikasını ya da yansıtmaz. Wei-Mei Ching ABD Hükümetinin bir çalışanıdır. Bu eser onun resmi görevlerinin bir parçası olarak hazırlanmıştır. Başlık 17 USC §105 &#39;bu başlık altında Telif hakkı koruması Birleşik Devletler Hükümeti&#39;nin herhangi bir iş için mevcut değildir.&#39; Öngörmektedir Başlık 17 USC §101 o kişinin resmi görevlerinin bir parçası olarak askerlik üyesi veya ABD Hükümeti çalışanı tarafından hazırlanan bir eser olarak bir ABD Hükümeti işi tanımlar.

1. LAMBA Reaksiyon Standardı olarak plazmid DNA dilüsyonları hazırlayın <ol><li> DNA konsantrasyonu plazma (C burnetii RSA 493 ihtiva eden hedef gen IS1111a) belirlenmesi için, 260 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak. 1 OD 260 DNA 50 ug / ul eşittir. </li><li> kopya sayısında plazmit DNA miktarını dönüştürün. Plazmid büyüklüğü 6330 bp olduğu için, bu plazmid moleküler ağırlığı 4.1 x 10 6 g (6.330 bp&#39;lik bir X 649 g / BP) &#39;dir. (Adım 1.1 belirlenir) plazmidinin DNA konsantrasyonu 34.2 ng / ml. Bu DNA, örnek 1 ul DNA, 5 x 10 9 kopya (34.2 x 10 -9 g / 4.1 x 10 6 gx 6.02 x 10 23) denk, plasmid DNA 34.2 ng içerir. </li><li> 5 x 10 8 kopya DNA örneği yapmak için bir 10-kat seyreltme için su 90 ul plasmid DNA (5 x 10 9 kopya / ml) 10 ul ekle / ml. </li><li> Tekrar adım 1.3, 5 x 10 7 DNA numuneleri hazırlamak için 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 ve 5 x 10 0 kopya / ul. </li></ol> 2. LAMBA Reaksiyon için Örneklerden DNA şablonu hazırlayın <ol><li> imalatçının protokolüne göre, ticari bir DNA mini kiti kullanılarak insan plazma örneklerinden DNA izolasyonu. çıkarılması için 200 ul örnek bir toplam kullanım ve 20 ul hacim içinde ekstre DNA Zehir. </li></ol> 3. 2x LAMP reaksiyonu tamponu hazırlayın <ol><li> 10x Pol tampon 200 ul, 5 M Trimethylglycine 320 ul, E MgSO 4, dNTP karışımı 280 ul (10 mm) ve suyun 188 ul 2x LAMBASI 1 ml tampon olmak için 1 12 ul karıştırın. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın. </li></ol> 4. Standart LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirin <ol><li> 2x LA 12.5 ul karıştırınAşama 3&#39;te hazırlanan MP tamponu (40 mM Tris-HCI (pH 8.8), 20 mM KCI, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH4) 2 SO4,% 0.2 Triton X-100, 1.6 M Trimethylglycine, 1.4 mM dNTP karışımı), primer karışımının 1.2 ul, Bst DNA polimerazı (8 U / ul) 1 ul ve 0.2 ml PCR tüpü içinde, reaksiyon karışımı (20 ul) yapmak için su 5.3 ul. </li><li> 20 ul reaksiyon karışımına 5 (aşama 1 ya da 2) DNA ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Yakın boru ve bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 60 dakika süre ile, 60 ° C&#39;de inkübe edin. Bu önceden belirlenmiş optimal reaksiyon sıcaklığıdır. </li><li> Tepkimeyi sonlandırmak için 10x, jel yükleme tampon maddesi 5 ul ekle. </li><li> nükleik asit, leke interkalasyon ile boyanmış% 2 agaroz jeli reaksiyon ürünlerin yük 5 ul. </li><li> 1x TBE tamponu içinde 35 dakika boyunca 100 V&#39;ta jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> UV ışığı ile sonuçları görselleştirmek. </li></ol> 5. sulandırılmış ile LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirinReaktifler <ol><li> 10x Pol Tamponu 125 ul 5 M Trimethylglycine 200 ul, 1 M MgSO 4 7.5 ul karıştırın, su 667.5 ul sulandırma tamponu 1 ml yapmak için. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın. </li><li> mühürlü alüminyum folyo çanta liyofilize reaktif ihtiva tüpleri çıkarın. alüminyum folyo çanta mühürlü değilse tüpleri kullanmayın veya hasarlı olup olmadığını. </li><li> Liyofilize reaktifler yeniden askıya almak için her bir tüp halinde yeniden tamponu 20 ul ekle. </li><li> Tampon yukarı ve aşağı 5 kez pipetleme karıştırın. Liyofilize reaktifler tamamen yeniden askıya alınır emin olmak için bir göz atın. beyaz toz tüp içinde kaybolur. </li><li> yeniden reaktifler (aşama 1 ya da 2) DNA şablonu 5 ul ilave edin ve iyice karıştırın. </li><li> Yakın boru ve bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 60 dakika süre ile, 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tepkimeyi sonlandırmak için 10x, jel yükleme tampon maddesi 5 ul ekle. </li><li> Yük reaksiyon 5 ulnükleik asit, leke interkalasyon ile boyanmış% 2 agaroz jel ürünleri. </li><li> 1x TBE tamponu içinde 35 dakika boyunca 100 V&#39;ta jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> UV ışığı ile sonuçları görselleştirmek. </li></ol> 6. Sulandırma Tampon HNB veya Floresan araya eklenen boyanın İçeren ile LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirin <ol><li> 10x Pol Tamponu 125 ul 5 M Trimethylglycine 200 ul, 1 M, 7.5 ul MgSO 4, 20 mM HNB (ya da 100X flüoresan araya eklenen boyanın 12.5 ul) ve 660 ul (veya 655 ul) su için 7.5 ul karıştırın sulandırma tamponu 1 ml yapmak. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın. </li><li> 5.6 - adımlarını 5.2 tekrarlamak için 6. bölümde hazırlanan sulandırılmış tampon kullanın. </li><li> çıplak gözle sonuçları (HNB içeren reaksiyon) ya da bir UV ışığı (floresan interkalasyon boya içeren reaksiyon) gözünüzde canlandırın. </li></ol> 7. Tüp Tarayıcı ile gerçek zamanlı LAMBASI Reaksiyonu gerçekleştirin <ol><li> reconstitut DNA ul 5 ekleyinfloresan interkalasyon boya, yakın tüp içeren ve tüp tarayıcıya yerleştirin ed reaktifleri. </li><li> 60 ° C&#39;ye ayarlanmış inkübasyon sıcaklığı. 60 dakika boyunca 520 nm de floresan ölçülür. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
<li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li>
<li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li>
<li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N+Y+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li>
<li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li>
<li>Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+E+%22J.+Med.+Microb.+Diagn%22">J. Med. Microb. Diagn</a>. 1 (112), (2012).</li>
<li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Daha önce, ekleme elemanı IS1111a 14 hedefleyen duyarlı ve özgül LAMBA testi geliştirdi. Derece C arasında, farklı türleri arasında korunduğu için IS1111 elemanı seçilmiştir burnetti ve bakteri kopya yüksek numarası (110 7) (Klee 2006). Bizim sonuçlarımız LAMP Coxiella DNA gibi kısa bir sürede kromozomal kopyasını ilişkili olabilir IS1111 elemanı, yaklaşık 25 kopya tespit edebilen gösterdi. Bu çalışmada, Bst DNA polimerazı, lamba primerleri ve dNT...

Küçük Gram-negatif bakteri Coxiella burnetii dünya çapında bir zoonoz olan Q humması etkeni olduğunu. Nedeniyle Q Ateşi dünya çapında dağıtım ve C yüksek bulaşıcılıklarına burnetii, denizaşırı dağıtılan ABD askeri ve sivil personel endemik bölgelerde enfekte olma riski vardır. akut ve kronik enfeksiyonların: Q humması iki şekilde tezahür eder. Akut Q-humması grip benzeri semptomlar, hepatit, pnömoni veya ile kendini göstermektedir ve genellikle düşük mortalite oranı kendini sınırlayan bir hastalıktır. Kronik Q-humması, daha az yaygın olmakla birlikte, genellikle 1,2 tedavi edilmediği takdirde çok daha yüksek bir ölüm oranına sahip endokardit ile sonuçlanır. Bu nedenle erken tanı uygun bir tedavi hasta bakımı için önemlidir rehberlik. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizleri C saptanması için geliştirilmiştir hücre kültürleri ve klinik örneklerde 3-5 &lt;de burnetii DNA/ Sup&gt;. PCR ve qPCR Hem masraflı ve rutin işleri için kaynak kısıtlı alanlarda genellikle hazır değildir. Başlangıçta Notomi 6 tarafından açıklanan döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) alternatif bir DNA çoğaltma yöntemi sunuyor. LAMBA hedef genin en az altı bağımsız bölgeleri tanıyan özel olarak tasarlanmış primer kümeleri ile birlikte sarmal yer değiştirme DNA sentezi için Bst DNA polimerazı kullanır. LAMP en önemli avantajı, amplifikasyon izotermal şartlar altında gerçekleşmesidir. Bu nedenle, yalnızca su banyosu ısıtma bloğu ya da bir inkübatör gereklidir. Bu yöntem, birkaç riketsiyal patojenleri 7-9 algılamak için kullanılır olmuştur. jel elektroforezi ile yükseltilmiş DNA ürünleri Görselleştirme nedeniyle nonspesifik amplifikasyon yanlış pozitif gelen gerçek pozitifler ayırt edebilirsiniz en doğru yöntemdir. Ancak jel elektroforezinde ilgili prosedürler kaynakları sınırlı ar için pratik değildirEAS. Birkaç alternatif yöntemler tepkime ürünlerini tespit etmek için geliştirilmiştir. Magnezyum pirofosfat oluşumu 10 veya floresan interkalasyon boya kullanılarak elde edilen bulanıklık UV ışığı 11,12 altında görüntülendi edilecek gibi bu alternatif, bir jel çalışan daha elverişli. Q humması endemik 13 olduğu tropikal ve alt tropikal ülkelerde ortam sıcaklığı olan 25 ° C ve 37 ° C&#39;de saklandığında LAMP reaktifleri bir ay boyunca stabil idi. Bir lamba deneyi C varlığını tespit etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir Plazma örneklerinde 14 burnetti. Burada liyofilize reaktifler lamba Reaksiyon karışımının hazırlanması için bir protokol açıklamaktadır. Oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde liyofilize reaktif bir ay boyunca stabildir. Kolay bir görselleştirme yöntemi ile kombine edildiğinde, bu C tespit için kullanılacak ideal bir yöntemdir Bir kaynak sınırlı bir ortamda burnetti.

<table><tbody><tr><td>LAMP astarları</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, tuzsuz</td><td>Müşteri tarafından tasarlanan dizi</td></tr><tr><td>Bst DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 birim/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>her biri 10</td></tr><tr><td>mM Betain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimetilglisin</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>jel yükleme tamponu</td></tr><tr><td>SYBR yeşil</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10.000x, tüplerdeki ürünleri görselleştirin</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phoenix Araştırma Ürünleri</td><td>RGB-4103</td><td>10.000x, jellerdeki ürünleri görselleştirin</td></tr><tr><td>Liyofilize reaktifler</td><td>Gen Erişimi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol mavi</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tüp tarayıcı</td><td>Qiagen</td><td></td><td>gerçek zamanlı algılama</td></tr></tbody></table>

tespiti için liyofilize döngü aracılı İzotermal amplifikasyon reaktifler gelişimi<em&gt; coxiella burnetii</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, Q ateşi etkenidir, zorunlu hücre içi bakteridir. PCR bazlı teşhis deneyleri C saptanması için geliştirilmiştir Hücre kültürleri ve klinik örneklerde burnetii&#39;nin DNA. PCR özel ekipman ve kapsamlı son kullanıcı eğitimi gerektirir ve bu nedenle, özellikle kaynak kısıtlı bir alanda rutin işleri için uygun değildir. Bunun C varlığını tespit etmek için bir döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) deneyi geliştirdik hasta numunelerinde burnetti. Bu yöntem, bir su banyosu ya da ısıtma bloğu 60 ° C civarında tek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Bu lamba tahlilin duyarlılığı reaksiyon başına yaklaşık 25 kopya, algılama sınırı ile PCR için çok benzer. Bu rapor, liyofilize reaktifler ve hydroxynaphthol mavisi (HNB) veya reaksiyon floresan interkalasyon boya ile UV lambası kullanılarak sonuçlar görselleştirmelerine reaksiyon hazırlanmasını tarif etmektedir. LAMP reaktifler lyophili edildized ve algılama hassasiyeti kaybı olmadan bir ay süreyle oda sıcaklığında (RT) saklandı. Reaksiyon karışımı hazırlama karmaşık adımlar içermez, çünkü bu lamba deneyi özellikle sağlamdır. Bu yöntem, Q humması endemik kaynak sınırlı ortamlarda kullanım için idealdir.

0.2 ml tüp içinde liyofilize LAMP reaktifler Bst DNA polimeraz, astar ve dNTP içerir. Sulandırma tamponu 20 ul yeniden askıya liyofilize reaktifler kullanılır. 1 taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktiflerle agaroz jelleri üzerinde LAMP reaksiyonu sonucu göstermektedir. Liyofilize reaktif aktivitesini azaltmaz. DNA şablonu. Şekil 2&#39;nin 25 kopya tespit her iki reaktiflerle hazırlanan LAMP reaksiyonları HNB veya reaks...

Burada, hasta örneklerinde C. burnetii'nin tespiti için liyofilize reaktifler kullanan basit bir döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemini tanımladık.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Bu deneyin genel amacı, hasta örneklerinde C.burnetii tespit etmek için liyofilize reaktifler kullanan basit bir LAMP yöntemi geliştirmektir. Bu protokolün temel avantajı, reaktiflerin saklanması için soğuk zincir gereksiniminin olmamasıdır. Bu yöntem, Q ateşinin endemik olduğu, kaynakların sınırlı olduğu ortamlar için idealdir.Prosedürü laboratuvarımızdan teknisyen Tatiana uygulamalı olarak gösterecektir. C.burnetii RSA493'ten hedef gen IS11111a için DNA ile başlayarak, plazmit konsantrasyonunu 260 nanometrede bir spektrofotometre ile belirleyin. Plazmit DNA konsantrasyonunu, 6330'ın plazmitin uzunluğu ve baz çiftlerini, 34,2 nanogram/µL'nin ise spektrofotometre ile az önce belirlenen plazmit konsantrasyonunu temsil ettiği aşağıdaki hesaplamaları kullanarak kopya sayısına dönüştürün.Ardından, mikrolitre başına aşağıdaki kopya sayılarına ulaşmak için plazmidden 8 ila 10 katlık seri dilüsyonlar hazırlayın. LAMP reaksiyonu için DNA kalıbını hazırlamak üzere, 200 mikrolitre insan plazma örnekleriyle başlayın ve DNA miniprep kiti ile üretici protokolüne uygun olarak DNA'yı ekstrakte edin. Nihai örneği 20 mikrolitrelik bir hacme dilüe edin.Aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre 2x LAMP reaksiyon tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca pulse-vortex uygulayarak karıştırın. Standart LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 0,2 mililitrelik bir PCR tüpünde 12,5 mikrolitre 2x LAMP tamponu, 1,2 mikrolitre primer karışımı, 1 mikrolitre Bst DNA polimeraz ve 5,3 mikrolitre su karıştırın.Ardından, 20 µL'lik reaksiyona 5 µL DNA ekleyip iyice karıştırın, ardından bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüpe 5 µL 10x jel yükleme tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Daha sonra, reaksiyon ürünlerinden 5 µL'yi, interkalasyon yapan nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik agaroz jele yükleyin.Jeli 1x TBE içerisinde 100 volt ile 35 dakika boyunca çalıştırın, ardından sonuçları görüntülemek için UV ışığı kullanın. Yeniden konstitüe edilmiş reaktiflerle LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre reconstitution buffer hazırlayın. 10 saniye boyunca puls-vorteksleyerek karıştırın.Ardından, liyofilize reaktifleri içeren tüpleri kapalı alüminyum folyo torbadan çıkarın. Adım 4.2 için, alüminyum folyo torbayı açmadan önce düzgün şekilde mühürlendiğinden emin olmak çok önemlidir. Alüminyum torba mühürlü değilse veya hasarlıysa tüpleri kullanmayın.Her bir reaktif tüpüne 20 microliters rekonstitüsyon tamponu ekleyin ve pipetle beş kez aşağı yukarı çekerek karıştırın. Liyofilize reaktiflerin tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun. Ardından, rekonstitüe edilmiş reaktiflere 5 microliters DNA kalıbı ekleyin ve iyice karıştırın.60 °C'de bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası reaksiyonu sonlandırmak için 5 µL 10x jel yükleme tamponu ekleyin, ardından reaksiyon ürünlerinden 5 µL'yi interkalasyon yapan nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik agaroz jele yükleyin. Jeli 1x TBE tamponunda 100 voltda 35 dakika boyunca çalıştırın, ardından sonuçları UV ışığı altında görselleştirin.Hidroksinaphtol mavi (HNB) veya interkale eden boya ile LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, HNB veya floresan interkale eden boya içeren aşağıdaki re ajanları birleştirerek 1 mililitre rekonstitüsyon tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca pulse-vortex yaparak karıştırın. LAMP reaksiyonunu az önce açıklanan şekilde gerçekleştirin ve sonuçları görselleştirmek için UV ışığı veya çıplak göz kullanın.LAMP reaksiyonunu bir tüp tarayıcı ile gerçekleştirmek için, floresan interkale boya içeren yeniden konfigüre edilmiş reaktiflere 5 µL DNA ekleyin ve ardından kapalı tüpü tüp tarayıcıya yerleştirin. İnkübasyon sıcaklığını 60 °C olarak ayarlayın ve 60 dakika boyunca 520 nm'de floresansı ölçün. Bu şekil, taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktifler ile agaroz jeller üzerindeki LAMP reaksiyon sonuçlarını göstermektedir.Liyofilize reaktifin aktivitesini koruduğu gözlemlenmiştir. Her iki reaktif ile hazırlanan LAMP reaksiyonları, 25 kopya DNA şablonunu tespit etmiştir. Bu şekilde, reaksiyon ürünlerinin HNB veya floresan interkale boya ile tespit edilmesi gösterilmektedir.Reaksiyonlara HNB eklenmesi; reaksiyonlarda 25, 50 ve 100 kopya DNA şablonu mevcutken, mor renkten maviye görsel bir renk değişimi meydana getirir. Ek olarak, reaksiyona floresan interkale edici boyanın dahil edilmesi, benzer DNA kopya sayıları mevcut olduğunda UV ışığı altında güçlü bir floresan sinyali verir. Burada, floresan interkale edici boya ile floresan sinyallerini gerçek zamanlı olarak izlemek için tüp tarayıcı kullanımından elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.Reaksiyonlarda sırasıyla 10^6, 10^4, 10^3 ve 100 kopya DNA kalıbı varken, floresan sinyalleri 14, 18, 21 ve 23. dakikalardan sonra baz çizgisine yükselmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür 90 dakika içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu analiz, kaynakların sınırlı olduğu bölgelerde Coxiella burnetii enfeksiyonunun hızlı teşhisi için yol açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, liyofilize LAMP reaktiflerinin nasıl yeniden çözüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Hasta örneklerinin enfeksiyöz olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Domesle, K. J. ve diğerleri. Hayvansal Gıda Salmonella'yı Taramak ve Kültür İzolasyonundan Salmonella'yı Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon.  J. Vis. Exp. (2020).Bu video, hedef bakteri genini sabit sıcaklıkta amplifikasyonla tespit etmek için döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) tekniğini göstermektedir. Reaksiyon karışımı, izotermal ana karışım, hedef gen için özel primerler ve DNA şablonları içeren örnekler eklenerek hazırlanır. Amplifikasyon bir LAMP...

Bakteriyel Gen Tespiti İçin Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Bu video, kültürlenmiş epitel hücreleri içinde GFP etiketli Coxiella mutantlarının hücre içi büyümesini değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Mutant fenotip, immünoboyama ve epifloresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir ve mutasyonun hücre içi büyüme üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir.

Coxiella Mutantlarının Ökaryotik Hücrelerde Hücre İçi Büyümesinin Değerlendirilmesi

Tavuklarda Eimeria enfeksiyonu teşhisi zorlu olmaya devam etmektedir. Parazit morfolojisi ve konak patolojisi odaklı yaklaşımlar genellikle sonuçsuz kalırken, PCR'ye dayalı moleküler yaklaşımların maliyet ve uzmanlık açısından zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolün amacı, eimerian enfeksiyonu için basit bir moleküler tanı olarak döngü aracılı izotermal amplifikasyonu (LAMP) oluşturmaktır.

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Burada, at solunum sıvılarında EHV-2 DNA'sının tespiti ve miktarının belirlenmesi için kullanılan kantitatif bir PCR yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz. EHV-2 qRT-PCR doğrulama protokolü üç bölümden oluşan bir prosedür içerir: geliştirme, tek başına qRT-PCR testinin karakterizasyonu ve tüm analitik yöntemin karakterizasyonu.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojen tespit alanında geniş ilgi gören bir izotermal nükleik asit amplifikasyon testidir (iNAAT). Burada, Salmonella'yı hayvansal gıdalarda taramak ve tahmin edilen Salmonella'yı kültür izolasyonundan doğrulamak için hızlı, güvenilir ve sağlam bir yöntem olarak çok laboratuvar onaylı bir Salmonella LAMP protokolü sunuyoruz.

Hayvansal Gıdalarda Salmonella Taramak ve Salmonella'yı Kültür İzolasyonundan Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Bu çalışma, reaksiyon kabına önceden yüklenebilen ve birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabilen T. cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR üretme adımlarını açıklamaktadır.

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Çeşitli bakteriyel patojenler, doğru bir şekilde tespit edilmez ve derhal tedavi edilmezse solunum yolu enfeksiyonlarına neden olabilir ve ciddi sağlık sorunlarına yol açabilir. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla bu patojenlerin hızlı ve doğru tespiti, klinik ortamlarda solunum yolu enfeksiyonlarının etkili bir şekilde yönetilmesini ve kontrol edilmesini sağlar.

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Keşfedin, liyofilize reaktiflerle LAMP yöntemi kullanarak Coxiella burnetii tespiti için hızlı ve basit bir tanı protokolü. Bu yöntem, kaynak kısıtlı ortamlarda Q ateşi teşhisini kolaylaştırır.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi

Daha fazla video keşfet