tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi Coxiella burnetii

Bu deneyin genel amacı, hasta örneklerinde C. burnetii'nin tespiti için liyofilize reaktifler kullanan basit bir LAMP yöntemi geliştirmektir. Bu protokolün ana avantajı, reaktiflerin saklanması için herhangi bir koçluğa gerek olmamasıdır. Bu yöntem, Q ateşinin endemik olduğu kaynak sınırlı ortamlarda kullanım için idealdir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Tatiana olacaktır. C.burnetii RSA493'ten hedef gen IS1111a için DNA ile başlayarak, plazmit konsantrasyonunu 260 nanometrede bir spektrofotometre ile belirleyin. Plazmit DNA konsantrasyonunu, 6330'un plazmidin uzunluğuna ve baz çiftlerine eşit olduğu ve mikrolitre başına 34.2 nanogramın, spektrofotometre kullanılarak yeni belirlendiği gibi plazmitin konsantrasyonu olduğu aşağıdaki hesaplamaları kullanarak kopya numarasına dönüştürün.

Daha sonra, mikrolitre başına aşağıdaki kopya sayısına ulaşmak için plazmitin 8 ila 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. DNA şablonunu LAMP reaksiyonu için hazırlamak için 200 mikrolitre insan plazma örneği ile başlayın ve DNA miniprep kiti ile DNA'yı üreticinin protokolüne göre çıkarın. Son numuneyi 20 mikrolitrelik bir hacme seyreltin.

Aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre 2x LAMP reaksiyon tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Standart LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünde 12.5 mikrolitre 2x LAMP tamponu, 1.2 mikrolitre primer karışımı, 1 mikrolitre Bst DNA polimeraz ve 5.3 mikrolitre su karıştırın.

Daha sonra, 20 mikrolitrelik reaksiyona 5 mikrolitre DNA ekleyin ve iyice karıştırın, ardından 60 santigrat derecede bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpe 5 mikrolitre 10x jel yükleme tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Daha sonra 5 mikrolitre reaksiyon ürününü, enterkalasyon yapan nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.

Jeli 35 dakika boyunca 100 voltta 1x TBE'de çalıştırın, ardından sonuçları görselleştirmek için UV ışığı kullanın. Sulandırılmış reaktiflerle LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre sulandırma tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın.

Ardından, liyofilize reaktifleri içeren tüpleri sızdırmaz alüminyum folyo torbadan çıkarın. Adım 4.2 için, alüminyum folyo torbayı açmadan önce düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak çok önemlidir. Alüminyum torba sızdırmaz değilse veya hasar görmüşse tüpleri kullanmayın.

Her bir reaktif tüpüne 20 mikrolitre sulandırma tamponu ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Liyofilize reaktiflerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Ardından, sulandırılmış reaktiflere 5 mikrolitre DNA şablonu ekleyin ve iyice karıştırın.

60 santigrat derecede bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra reaksiyonu sonlandırmak için, 5 mikrolitre 10x jel yükleme tamponu ekleyin, ardından 5 mikrolitre reaksiyon ürününü, enterkalasyon nükleik asit boyası ile boyanmış %2'lik bir agaroz jel üzerine ekleyin. Jeli 35 dakika boyunca 100 voltta 1x TBE tamponunda çalıştırın, ardından sonuçları UV ışığı ile görselleştirin.

Hidroksinaftol mavisi veya HNB veya interkalasyon boyası ile LAMP reaksiyonunu gerçekleştirmek için, HNB veya bir floresan interkalasyon boyası içeren aşağıdaki reaktifleri birleştirerek 1 mililitre sulandırma tamponu hazırlayın. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. LAMP reaksiyonunu az önce açıklandığı gibi gerçekleştirin ve sonuçları görselleştirmek için UV ışığı veya çıplak göz kullanın.

LAMP reaksiyonunu bir tüp tarayıcı ile gerçekleştirmek için, floresan interkalasyon boyasını içeren sulandırılmış reaktiflere 5 mikrolitre DNA ekleyin, ardından kapalı tüpü tüp tarayıcıya yerleştirin. Kuluçka sıcaklığını 60 santigrat dereceye ayarlayın ve floresansı 60 dakika boyunca 520 nanometrede ölçün. Bu şekil, taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktifler ile agaroz jeller üzerindeki LAMP reaksiyon sonuçlarını göstermektedir.

Liyofilize reaktifin aktivitesini koruduğunu gözlemleyin. Her iki reaktif tarafından hazırlanan LAMP reaksiyonları, 25 kopya DNA şablonu tespit etti. Bu şekilde, reaksiyondaki HNB veya floresan interkalasyon boyası ile reaksiyon ürünlerinin tespiti gösterilmiştir.

Reaksiyona HNB'nin eklenmesi, reaksiyonlarda 25, 50 ve 100 kopya DNA şablonu ile mordan maviye görsel bir renk değişikliği üretir. Ek olarak, floresan interkalasyon boyasının reaksiyona dahil edilmesi, benzer DNA kopya sayıları mevcut olduğunda UV ışığı ile güçlü bir floresan sinyali gösterir. Burada, floresan interkalasyon boyası ile floresan sinyallerini gerçek zamanlı olarak izlemek için tüp tarayıcının kullanılmasından elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.

Floresan sinyaller, reaksiyonlarda 10^6, 10^4, 10^3 ve 100 DNA şablonu kopyası ile 14, 18, 21 ve 23 dakika sonra taban çizgisinin üzerindedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür 90 dakika içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu test, kaynakların sınırlı olduğu alanlarda Coxiella burnetii enfeksiyonunun hızlı teşhisinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, liyofilize LAMP reaktiflerinin nasıl yeniden oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Hasta örneklerinin bulaşıcı olabileceğini ve bu işlem yapılırken her zaman güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.